經(jīng)宏基因組二代測序診斷立克次體病3例

張?zhí)m，袁蘭，袁義美，王震，范雪娟，崔寧，袁春

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九九〇醫(yī)院 感染科，河南 信陽 464000)

立克次體病是一組由立克次體感染引起的急性傳染病，為一類嚴重威脅人類健康的人畜共患自然疫源性疾病[1]。目前臨床上最常用的診斷立克次體病的方法為外斐試驗，但特異性較差，且此反應出現(xiàn)較晚，不能做早期診斷，因此診斷價值有限[2-3]。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一種新型的病原學診斷方法，已成為新發(fā)、突發(fā)、罕見及常規(guī)檢測陰性的感染性疾病診斷的重要手段。這項技術提高了臨床醫(yī)生對感染性疾病的認識，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、呼吸道感染及血流感染的診斷中體現(xiàn)了價值，成為精準診療的重要驅(qū)動力[4]。本文通過總結(jié)3例經(jīng)mNGS檢測后診斷的立克次體病的臨床資料，分析其臨床及治療要點，探討mNGS在立克次體病早期診斷中的應用價值，旨在提高對立克次體病的診斷和研究水平。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性分析2020年9月至2021年4月于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九九〇醫(yī)院感染科住院疑診為立克次體病，最終經(jīng)mNGS檢測技術確診的3例患者的臨床資料。詳細記錄每例患者的病史、臨床表現(xiàn)、體征、實驗室檢查[白細胞(white blood cell，WBC)、血小板(platelet，PLT)、超敏C反應蛋白(hypersensitive C reactive protein，hs-CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)、白蛋白(albumin，Alb)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)]、治療以及血液mNGS檢測結(jié)果等資料。

1.2 診斷標準立克次體病診斷標準為：(1)流行病學資料，如發(fā)病季節(jié)、當?shù)亓餍星闆r、被蜱蟲叮咬史、職業(yè)等；(2)臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹等；(3)多西環(huán)素治療48～72 h退熱；(4)經(jīng)血液mNGS檢測出立克次體，至少2次發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)核酸陰性，并排除其他病原體所致的感染。

1.3 宏基因組二代測序患者入院后、應用多西環(huán)素前，留取EDTA抗凝外周血5 mL，樣本獲取后立即放入-80 ℃冰箱凍存，保存在干冰中運輸至北京博奧醫(yī)學檢驗所進行病原菌 mNGS分析。博奧MAPMITM檢測基于BioelectronSeq 4000基因測序儀，可覆蓋7 374種病毒(涵蓋DNA病毒和RNA病毒)、13 362種細菌、1 659種真菌、153種寄生蟲及2 500種耐藥基因。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料3例患者均來自河南信陽，均為女性，職業(yè)為農(nóng)民，年齡為54～74歲，中位年齡66歲。

2.2 流行病學特征3例患者發(fā)病時間分別為2020年9月、2020年10月及2021年4月，居住地均為山區(qū)丘陵地帶，發(fā)病前在林區(qū)、草叢、茶山等地域有野外活動史。2例有明確蜱叮咬史，另外1例雖然無明確蜱叮咬史，但居住地周圍有蜱活動。

2.3 臨床表現(xiàn)

2.3.1癥狀 3例患者均急性發(fā)病，以發(fā)熱為主要表現(xiàn)，第2～3日即達高峰，呈稽留熱型，體溫39～40 ℃，同時伴有頭痛、乏力、納差、全身肌肉酸痛、關節(jié)痛等癥狀，部分有惡心、嘔吐，無腹瀉、腹痛、意識障礙、咳嗽、咳痰等癥狀，無明顯皮膚黏膜、腔道器官出血等。見表1。

表1 3例立克次體病患者的臨床資料

2.3.2體征 3例患者均有明顯皮疹，皮疹出現(xiàn)在發(fā)熱后3～4 d。早期為粉紅色斑疹，直徑1～3 mm，皮疹形態(tài)不規(guī)則，多孤立存在，不融合。進展期為暗紅色斑丘疹，直徑2～5 mm，按之不消失，皮疹的顏色隨著體溫升高而加深，體溫下降，顏色變淺?；謴推隗w溫正常后皮疹逐漸消退，皮疹可持續(xù)2周，常留色素沉著，無脫屑。皮疹多見軀干部，1～2 d內(nèi)遍及四肢，面部少見，手掌、腳底無皮疹。2例被蜱叮咬的患者在叮咬處出現(xiàn)類似恙蟲病樣焦痂；1例患者有淋巴結(jié)腫大。3例患者均無結(jié)膜充血及腦膜刺激征等。早期、進展期、恢復期皮疹及焦痂見圖1。

2.4 實驗室檢查

2.4.1血常規(guī) 3例患者中，有1例WBC減少，另2例正常(見圖2A)。3例患者PLT均降低，隨病情恢復逐漸升高(見圖2B)，血紅蛋白基本正常。

2.4.2生化檢測 3例患者均有不同程度血清Alb降低(見圖3A)和LDH升高(見圖3B)、hs-CRP升高。2例患者AST、ALT輕度升高，1例CK稍升高，3例患者腎功能均正常。3例患者AST、ALT、CK變化分別見圖3C、圖3D、圖3E。

A為焦痂(病程第4日)；B為腹部早期皮疹(病程第4日)；C為背部進展期皮疹(病程第6日)；D為背部恢復期皮疹(病程第11日)。

圖2 患者WBC(A)和PLT(B)變化

圖3 患者Alb(A)、LDH(B)、AST(C)、ALT(D)、CK(E)變化

2.4.3病原學檢測及影像學檢查 3例患者外斐試驗、布魯菌病凝集試驗、SFTSV-RNA及血培養(yǎng)均陰性。2例患者行胸腹部CT檢查顯示胸腔少許積液，未見肺部感染，無肝、脾、縱隔及腹腔淋巴結(jié)腫大。

2.5 血液mNGS檢測結(jié)果以血液mNGS檢出病原序列數(shù)大于1為條件，共檢出細菌3屬3種，病毒1屬1種(HBV)，立克次體1種(均為Rickettsiaargasii)。檢測結(jié)果顯示存在背景菌，包括不動桿菌、地衣芽孢桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌。排除背景菌序列后，mNGS檢測到所有Rickettsiaargasii的核酸序列數(shù)為160～1 739，基因覆蓋率為1.42%～9.79%。見表1。

2.6 治療及轉(zhuǎn)歸

2.6.1抗生素治療 所有患者入院后靜脈滴注鹽酸多西環(huán)素200 mg，每日1次，療程5～7 d。

2.6.2對癥支持治療 患者臥床休息，高熱量、優(yōu)質(zhì)蛋白、低纖維素飲食，維持水電解質(zhì)平衡。當血清Alb<30 g·L-1，輸注新鮮冰凍血漿或200 g·L-1人血白蛋白注射液。給予肝功能異常的患者甘草酸制劑等保肝、降酶治療。

2.6.3轉(zhuǎn)歸 3例患者靜滴多西環(huán)素后48 h體溫下降，96 h恢復正常，臨床癥狀逐漸改善。經(jīng)積極治療，患者均痊愈出院，隨訪無明顯不適，體溫變化見圖4。

圖4 患者體溫變化

3 討論

立克次體病是一類重要的人畜共患疾病，在全世界范圍流行，其病原體在自然界動物宿主與傳播媒介(蜱、螨、蚤等)中維持循環(huán)，這些傳播媒介的地理分布及活動季節(jié)決定了人類的發(fā)病地區(qū)與時間。除了傳統(tǒng)立克次體病如斑疹傷寒、斑點熱、恙蟲病、Q熱等在我國流行外，近年來大量研究和流行病學資料顯示，我國存在多種新發(fā)蜱傳立克次體病，如西伯利亞立克次體、虎林立克次體、雷氏立克次體、黑龍江立克次體、蒙納克立克次體等十余種斑點熱種群立克次體(spotted fever group rickettsia, SFGR)[5]。已證實至少有17種SFGR對人體有致病性，其中8種為新發(fā)現(xiàn)的立克次體[5]。河南信陽為發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)的主要疫源地，該病主要經(jīng)蜱傳播。在823例SFTS確診病例回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，復合感染SFGR約占8.5%，而且在河南信陽首次檢測到雷氏立克次體、日本立克次體2種SFGR，并發(fā)現(xiàn)1種新型的SFGR，暫命名為信陽立克次體[6]。

隨著對新發(fā)感染病的重視和研究的不斷深入，尤其mNGS迅速發(fā)展，改變了傳統(tǒng)病原學診斷模式。mNGS能快速鑒定新發(fā)病原體，檢測罕見病原體、跨物種傳播病原體、混合感染病原體和培養(yǎng)陰性的細菌/真菌性病原體[7]。3例患者具有發(fā)熱、皮疹、頭痛立克次體病典型三聯(lián)征表現(xiàn)，SFTSV等病原體檢測陰性，多西環(huán)素治療效果良好，結(jié)合流行病學史，符合立克次體病表現(xiàn)。3例患者經(jīng)mNGS檢測出的序列可以證明這種新型立克次體可引起臨床疾病。需要進一步加強研究，尤其針對該立克次體的分離培養(yǎng)。

蜱作為傳播媒介可引起病毒性疾病、螺旋體病、立克次體病等多種蟲媒傳染病。SFTS和Rickettsiaargasii感染引起的立克次體病在流行病學特征(農(nóng)民多發(fā)、4～10月發(fā)病、蜱叮咬史、戶外作業(yè)史)、臨床表現(xiàn)(急性發(fā)熱為主要表現(xiàn))、實驗室檢查(WBC、PLT、血清Alb降低，ALT、AST、CK、LDH升高)等方面具有相似的表現(xiàn)，臨床鑒別診斷相對困難，容易誤診。SFTS病例病情進展更快，納差、惡心、嘔吐、腹瀉等消化道癥狀更加突出，腹股溝等淺表淋巴結(jié)腫大、疼痛的可能性更高(可高達70%以上)，WBC、PLT下降幅度及ALT、AST、CK、LDH升高幅度更大，但無皮疹，少焦痂，病死率高達10%～30%，SFTSV-RNA陽性可確診[8-9]。軀干、四肢散在淡紅色斑丘疹且部分伴有焦痂是立克次體病患者早期主要的陽性體征。掌握以上特點有利于基層醫(yī)生及早診斷疑似病例，及時將患者轉(zhuǎn)至有確診條件的醫(yī)療機構(gòu)，最大可能減少誤診和降低病死率。本研究中的3例患者均因發(fā)熱、血小板減少在當?shù)蒯t(yī)院懷疑SFTS而轉(zhuǎn)診，入院時查體即發(fā)現(xiàn)皮疹，擬診立克次體病，及時行外周血mNGS檢測。美國疾病控制與預防中心在蜱傳立克次體病的診療原則中強調(diào)，對高度懷疑立克次體病時，及時采用四環(huán)素類藥物進行經(jīng)驗治療，無須等實驗室檢測結(jié)果。延遲治療可導致疾病加重甚至死亡。患者高熱在24～48 h得到緩解對診斷有重要意義，如發(fā)熱不退，則可基本排除立克次體病[10]。根據(jù)以上診療原則，3例患者在入院當日即經(jīng)驗性給予多西環(huán)素抗感染治療，爭取了早期的治療時機。

蜱傳立克次體病作為新發(fā)蜱媒傳染病，逐漸引起世界的廣泛關注。許多具有致病性的立克次體已被確定為人類致病病原體，并且一些立克次體已被國際反恐列為生物恐怖主義病原體。本研究通過mNGS首次證明Rickettsiaargasii這一新型立克次體的致病作用，并詳細描寫其臨床表現(xiàn)、實驗室化驗指標異常變化、治療等，為今后新發(fā)立克次體病的研究提供借鑒。