王仁耀，王娟，李德茂，王乃可，才金玲

(1.天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津 300457；2.中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津 300308)

中國是世界上農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量最大的國家，秸稈資源量達(dá)到全球總量的五分之一[1]。秸稈的處理通常有三種方式：直接田間焚燒、農(nóng)業(yè)化利用、工業(yè)化利用。其中，直接田間焚燒會造成大氣污染和資源浪費等一系列問題。秸稈的農(nóng)業(yè)化利用目前以還田為主，通過復(fù)合菌群加速秸稈腐解，為作物提供養(yǎng)分。工業(yè)化利用通過微生物或者水解酶等處理秸稈生產(chǎn)乙醇、沼氣、丁酸等。然而，酶解工藝成本過高、條件苛刻，并且效率較低。高效秸稈降解復(fù)合菌群具有低成本、高效、降解條件寬泛的特點，對秸稈變廢為寶具有重要的意義。

秸稈的農(nóng)業(yè)化和工業(yè)化利用都離不開秸稈的降解，而微生物是秸稈降解的關(guān)鍵所在。早期，國內(nèi)外學(xué)者針對秸稈降解的研究更多的體現(xiàn)在篩選單菌株后構(gòu)建復(fù)合菌系，在實驗室條件下篩選出具有較高纖維素酶活和半纖維素酶活的單個菌株，然后將菌株進(jìn)行復(fù)配構(gòu)建復(fù)合菌系，繼而對復(fù)合菌系進(jìn)行條件優(yōu)化來達(dá)到降解秸稈的目的。但是，目前的研究表明秸稈的降解是不同菌種協(xié)同作用的結(jié)果，并且在實驗室條件下不可培養(yǎng)的微生物在秸稈降解中起到一定的作用[2]。另外，構(gòu)建的復(fù)合菌系容易受到外源微生物的影響，不太符合秸稈還田的實際應(yīng)用場景。因而，采用限制性培養(yǎng)方法馴化微生物獲得一組高效秸稈降解菌群，對農(nóng)作物秸稈的循環(huán)利用和實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)都具有重要的意義。

1 秸稈的降解機理

秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組分統(tǒng)稱為木質(zhì)纖維素，在一系列降解酶協(xié)同作用下，各組分基質(zhì)分子內(nèi)的化學(xué)鍵被依次破壞，致使結(jié)構(gòu)裂解[3]。

纖維素是構(gòu)成纖維細(xì)胞骨架的主要物質(zhì)，是由葡萄糖分子單體之間通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的一種線性長鏈結(jié)構(gòu)[4]。纖維素酶復(fù)合酶系由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β糖苷酶組成[5]，將纖維素降解為纖維二糖和葡萄糖等小分子還原物質(zhì)。

半纖維素聚合度較低，呈現(xiàn)非結(jié)晶態(tài)，主要作為填充物質(zhì)分布在纖維素大分子之間[4]。木聚糖是組成半纖維素結(jié)構(gòu)框架的最小單體，串聯(lián)方式為β-1,4糖苷鍵的相互締合。木聚糖需要多種酶共同參與降解，首先，木聚糖骨架由于內(nèi)切 1,4-β-D 木聚糖酶隨機切斷導(dǎo)致聚合度降低，然后形成的產(chǎn)物木寡糖和木二糖被外切酶β-木糖苷酶分解為木糖。

木質(zhì)素本質(zhì)上是由苯丙烷單體聚合而成，并且由大量醚鍵連接而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的芳香族物質(zhì)。木質(zhì)素的降解以功能酶為主，同時需要多種酶的協(xié)同作用，在催化作用下產(chǎn)生不穩(wěn)定的中間體，繼而自發(fā)一系列降解反應(yīng)，生成小分子物質(zhì)[6]。

另外，纖維素多酶復(fù)合體是最近發(fā)現(xiàn)的一種主要存在于厭氧微生物中的類似于核糖體的一種細(xì)胞器，具有高效的木質(zhì)纖維素降解能力。其由纖維素酶和腳手架蛋白構(gòu)成，腳手架蛋白有吸附木質(zhì)素的纖維素結(jié)合域和專一性結(jié)合纖維素酶的粘附結(jié)構(gòu)域，從而使纖維素酶在物理空間上聚集[7]。相比于纖維素酶的簡單混合，人工體外設(shè)計構(gòu)建的多酶復(fù)合體的降解效率可以提高6倍[8]。

2 降解秸稈的微生物

自然環(huán)境中存在著大量的木質(zhì)纖維素降解菌，主要通過篩選高效純培養(yǎng)菌株、人工構(gòu)建復(fù)配菌系和采用限制性培養(yǎng)法馴化復(fù)合菌群的方法進(jìn)行研究。另外，隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，導(dǎo)入外源基因，構(gòu)建工程菌株也受到越來越多的關(guān)注與研究[9]。

2.1 降解秸稈的純菌

自然界中存在著大量可以利用秸稈的微生物，從環(huán)境中篩選高效菌株是早期的研究方式。純培養(yǎng)菌株的篩選一般先對來源于沼液、動物糞便及土壤等環(huán)境中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，而后以秸稈降解相關(guān)的酶活力大小為降解能力指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩得到[10]。目前，細(xì)菌、真菌和放線菌等都對木質(zhì)纖維素表現(xiàn)出一定的降解能力。

細(xì)菌中多個菌屬都可以降解纖維素和半纖維素，但其降解木質(zhì)素的報道很少。研究表明細(xì)菌在木質(zhì)素降解中起輔助作用，可以使木質(zhì)素結(jié)構(gòu)發(fā)生改性，但無法使其礦化[11]。細(xì)菌生長快、抗逆性強、耐酸堿的特點使其擁有巨大的應(yīng)用潛力[12]。目前，已被報道的能夠降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌主要有噬纖維菌(Cytophaga)、芽孢桿菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)和醋弧菌(Acetivibrio)等[13]。

真菌在木質(zhì)纖維素的降解中起到主要作用。真菌纖維素酶活性較高，產(chǎn)生的胞外酶種類更為齊全，但是真菌的生長及產(chǎn)酶環(huán)境的敏感性限制了其大規(guī)模的開發(fā)利用。絲狀真菌的菌絲可以穿透木質(zhì)素形成的屏障，由內(nèi)而外進(jìn)行木質(zhì)纖維素的降解。曲霉(Aspergillus)、木霉(Phanerochaete)、絲狀真菌(Trichoderma)和白腐真菌(Phanerochaete)等菌屬受到的關(guān)注最多[14]。

在木質(zhì)纖維素的降解中，放線菌相比于大部分細(xì)菌有更高的酶活；相比于真菌，其抵御極端環(huán)境能力更強。研究報道有效降解木質(zhì)纖維素的放線菌主要有鏈霉菌屬(Streptomyces)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、小單孢屬(Micromonospora)和諾卡氏菌屬(Nocardia)等[15]。

利用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建高效的基因工程菌，因可實現(xiàn)秸稈的高效降解而受到了越來越多的關(guān)注和研究。研究人員將嗜熱梭菌的雙功能纖維素-木聚糖酶基因和梭狀芽孢桿菌的β-葡萄糖苷酶基因重組于畢赤酵母，構(gòu)建的基因工程菌對于秸稈的降解性能優(yōu)于兩株單菌的單獨和復(fù)配降解[9]。研究表明利用基因工程技術(shù)，以枯草芽孢桿菌作為宿主構(gòu)建高效表達(dá)纖維素多酶復(fù)合體的工程菌株，可以實現(xiàn)燕麥干青草的高效降解[16]。

2.2 降解秸稈的菌群

在自然環(huán)境下，復(fù)合菌群的秸稈降解能力大多優(yōu)于單菌株。菌群生態(tài)適應(yīng)性強，生理代謝功能豐富，其菌群內(nèi)部微生物間協(xié)同作用是木質(zhì)纖維素降解的關(guān)鍵所在。目前，復(fù)合菌群構(gòu)建主要有高效單菌株復(fù)配和限制性培養(yǎng)法馴化兩種方式。

單菌株復(fù)配構(gòu)建菌群周期較短，從環(huán)境中篩選出木質(zhì)纖維素降解單菌進(jìn)行拮抗性實驗，選取無拮抗作用的菌株進(jìn)行復(fù)配，然后對其降解條件優(yōu)化而獲得秸稈降解菌群。李春黎等[17]通過平板初篩和酶活復(fù)篩的方式得到的6個菌株復(fù)配后，表現(xiàn)出對于煙草秸稈的高效降解，驗證了多功能菌株通過協(xié)同作用可以顯著提高生物質(zhì)秸稈的降解。但是單菌株復(fù)配的方式忽略了不可培養(yǎng)菌在菌群中的作用，大量關(guān)于菌群的宏基因組分析表明，不可培養(yǎng)菌對菌群的降解能力影響重大[2]。除此之外，在利用單菌株復(fù)配構(gòu)建復(fù)合菌群中，各菌株之間的協(xié)同和拮抗作用、各菌株混合比例以及互生和共生菌株的篩選分離仍需要深入研究探索。

利用限制性培養(yǎng)法對菌群進(jìn)行定向馴化是篩選高效菌群的有效方式，通過對堆肥、瘤胃、厭氧沼液和土壤等環(huán)境中的菌群進(jìn)行限制性培養(yǎng)(主要選取溫度和碳源作為限制性條件)，不斷提高秸稈降解率而得到一組高效木質(zhì)纖維素降解菌群。華彬彬等[18]分別在滅菌秸稈和未滅菌秸稈中加入馴化的菌群MC1進(jìn)行厭氧發(fā)酵，5 d后DGGE和PCR圖譜表明，所得到的秸稈降解菌群符合秸稈在自然條件下的腐解規(guī)律，降解率高，環(huán)境適應(yīng)性強，所含物種豐富，限制性培養(yǎng)方法是構(gòu)建高效秸稈降解菌群的有效手段。

2.3 影響微生物降解秸稈的因素

秸稈預(yù)處理和環(huán)境因素都會影響微生物降解秸稈的效果。秸稈預(yù)處理的主要目的是去除秸稈硅化層和木質(zhì)素，破壞纖維素定形區(qū)結(jié)構(gòu)，降低結(jié)晶度[19]。傳統(tǒng)的酸堿預(yù)處理方式成本高，污染大，且對水的需求量高，不符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。目前常將生物、化學(xué)、物理預(yù)處理方法結(jié)合使用用以打破傳統(tǒng)預(yù)處理方法的局限性，獲得較好的秸稈降解效果。因此將各類預(yù)處理方法聯(lián)合起來作用于水稻秸稈以期打破預(yù)處理過程中的局限性勢在必行。

環(huán)境因素對微生物降解秸稈的影響主要體現(xiàn)在兩個方面[20]：菌群的物種結(jié)構(gòu)組成與物種演替以及微生物的產(chǎn)酶活性與酶解效率。溫度、pH值、發(fā)酵方式、碳氮比(C/N)和金屬離子等均對降解有影響。Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)55 ℃條件下菌群對水稻秸稈的降解效果更好，并且微生物的種類沒有發(fā)生變化，豐富度有較大的的差異。Wang等[22]研究表明pH會顯著影響與木質(zhì)纖維素降解有關(guān)的酶的活性。Kim等[23]研究發(fā)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵時，靜置狀態(tài)利于微生物粘附于秸稈表面而達(dá)到更好的降解效果。合適的C/N有助于微生物的生產(chǎn)繁殖，也會影響秸稈降解后腐殖質(zhì)的質(zhì)量，初始C/N值在25～35之間被認(rèn)為是合適的[24]。金屬離子影響微生物的產(chǎn)酶活性和菌群結(jié)構(gòu)，Mn2+和木質(zhì)素降解酶的活性密切相關(guān)[25]，Cu2+可以提高微生物群落對聚合物類碳源的轉(zhuǎn)化與利用的能力，對水解酶有激活效應(yīng)[26]。

對降解條件進(jìn)行優(yōu)化也是提高微生物降解秸稈能力的重要途徑。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面的方法對復(fù)合菌群的降解條件進(jìn)行優(yōu)化也受到了越來越多的關(guān)注。泊翠翠[27]通過響應(yīng)面分析得出溫度和基質(zhì)含水量是影響固體秸稈基質(zhì)發(fā)酵的關(guān)鍵因素，優(yōu)化之后使纖維素的降解效率提高2.1倍。

3 宏基因組學(xué)解析菌群降解秸稈機理

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的低成本、高質(zhì)量化發(fā)展，宏基因組學(xué)技術(shù)在微生物群落多樣性和功能研究中得到廣泛利用。微生物多樣性測序能同時對優(yōu)勢物種、稀有物種以及非培養(yǎng)物種進(jìn)行分析，精確解析微生物菌群在種、屬水平上的物種組成和豐度情況，是研究微生物菌群多樣性及物種演替變化的重要技術(shù)手段[28]。

宏基因組學(xué)關(guān)注微生物群體種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化分析、功能基因，解析微生物功能與環(huán)境之間的關(guān)系，挖掘和研究特定功能基因及代謝通路。Kong等[29]采用宏基因組測序技術(shù)，研究了平菇發(fā)酵液接種玉米芯進(jìn)行堆肥過程中微生物菌群的動態(tài)變化及代謝功能。結(jié)果表明，不同堆肥階段理化性質(zhì)的變化導(dǎo)致了不同的優(yōu)勢菌株，不同階段的代謝是由不同的微生物驅(qū)動的。Zhong等[30]研究表明不同堆肥階段的關(guān)鍵微生物有棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、木犀單胞菌屬和非單胞菌屬，利用共生分析方法確定了堆肥過程中菌群的六個功能模塊。這些模塊與溫度、pH值、有機質(zhì)降解和堆肥的成熟度顯著相關(guān)，宏基因組分析表明，在堆肥過程中，氨基酸、脂肪、能量和異種生物代謝的相對豐度增加。

宏基因組學(xué)可以幫助我們發(fā)現(xiàn)菌群內(nèi)部更深層次的機理，對了解微生物之間的協(xié)同作用有重要意義。另外，組學(xué)分析可以比較菌群在物種組成和功能代謝層面的差異，對于構(gòu)建高效秸稈降解菌群有重要的指導(dǎo)作用。

4 展望

利用微生物菌群降解秸稈是目前研究的熱點，能夠解決秸稈焚燒導(dǎo)致的環(huán)境污染和資源浪費問題。通過宏基因組學(xué)技術(shù)對微生物菌群進(jìn)行功能解析，能夠更加深入的探究秸稈的生物降解機理，闡示多種微生物之間的協(xié)同作用，提高秸稈分解速度，縮短秸稈分解周期，這對于秸稈的綜合利用至關(guān)重要。鑒于此，需要進(jìn)一步結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析菌群中微生物的代謝聯(lián)系，為微生物降解秸稈的實際應(yīng)用提供更加切實可行的理論依據(jù)。