查中萍，郭 英，殷得所，胡建林，鄭興飛，董華林，劉艷芳，王紅波，薛 蓮，徐得澤

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.湖北省科技信息研究院，武漢 430064）

水稻（Oryza sativaL.）是中國(guó)重要的糧食作物之一［1］，肩負(fù)著國(guó)家糧食安全、滿足人們不斷提高的消費(fèi)需求以及農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的第一重任，一直被視為重要的戰(zhàn)略物資［2］。水稻花藥培養(yǎng)可以快速獲得水稻純系、提高選擇效率、縮短育種周期［3］，再生植株雙單倍體（DH）系也是分子標(biāo)記和基因圖譜的理想材料。水稻花藥培養(yǎng)始于1968 年，日本學(xué)者新關(guān)（Niizeki）和大野（Oono）利用花藥培養(yǎng)技術(shù)首次獲得水稻單倍體植株［4］，開啟了水稻花藥培養(yǎng)的先河［5］。1970 年，中國(guó)開始研究水稻花藥培養(yǎng)，并于1975 年第1 次利用花藥培養(yǎng)技術(shù)育成粳稻新品種單豐1 號(hào)［6］。近年來，隨著研究的不斷深入，水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)也在逐步完善，并與其他技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用在遺傳育種上，已經(jīng)成為生物育種技術(shù)中相對(duì)成熟、實(shí)用而且有效的技術(shù)［4］。水稻花藥培養(yǎng)及單倍體育種，是生物技術(shù)在農(nóng)作物育種中應(yīng)用最廣泛、最有成效的領(lǐng)域［7］。中國(guó)開展水稻花藥培養(yǎng)及育種應(yīng)用研究取得了許多成就，花藥培養(yǎng)技術(shù)不斷改進(jìn)、完善，研究出用于水稻花藥培養(yǎng)的培養(yǎng)基有N6［8］、合5、通用、L8、SK3 等［9］；通過花藥培養(yǎng)育出中花8 號(hào)、中花9 號(hào)、花寒早、新秀、朝花矮等優(yōu)良水稻新品種，已成功在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用［10，11］。隨著花粉植株性狀表現(xiàn)及遺傳機(jī)理、生理生化研究的深入，花藥培養(yǎng)育種相關(guān)理論得以不斷形成和充實(shí)。

本研究以N6、合5、SK3、M8 及改良的M8（簡(jiǎn)稱GM8）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，篩選愈傷組織誘導(dǎo)效率高的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，設(shè)置單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)比試驗(yàn)，以秈稻、粳稻、野生稻為試驗(yàn)材料，廣泛而又有重點(diǎn)地選配水稻材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)試驗(yàn)，為探索不同培養(yǎng)基的花藥培養(yǎng)效果，獲得遺傳基因型豐富的花藥培養(yǎng)后代提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種（組合）：X1、HB568（粳稻），JL117、HB613（秈稻），HB570（糯稻）及21ah36（野生稻）。試驗(yàn)于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所南湖試驗(yàn)基地開展，秧齡25～30 d 移栽，水稻的播種、移栽及接種時(shí)間詳見表1。

表1 水稻播種、移栽及接種時(shí)間

1.2 培養(yǎng)基

水稻花藥培養(yǎng)基本培養(yǎng)基配方見表2。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用N6［8］、M8［12］、合5［13］、SK3［14］以及GM8 為基本培養(yǎng)基，以MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 為分化培養(yǎng)基［3］，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方見表3。

表2 水稻花藥培養(yǎng)基本培養(yǎng)基 （單位：mg/L）

表3 水稻花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方 （單位：mg/L）

1.3 水稻花藥培養(yǎng)取材及預(yù)處理

水稻花藥培養(yǎng)取材及預(yù)處理參照文獻(xiàn)［3］。

1.4 培養(yǎng)條件

將接種花藥后的三角瓶放入培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26 ℃。待愈傷組織長(zhǎng)到直徑2 mm左右時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，光照誘導(dǎo)器官分化，每天用日光燈補(bǔ)充光照10 h，培養(yǎng)溫度為26～28 ℃。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以生育期比較早的X1（粳稻）及JL117（秈稻）為試驗(yàn)材料，利用5 種誘導(dǎo)培養(yǎng)基I1、I2、I2、I4、I5 進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每種培養(yǎng)基接種40 瓶，每瓶100 枚，即每種培養(yǎng)基接種4 000 枚花藥，50 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。篩選出最佳誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基后，對(duì)HB613、HB568、HB570、21ah36 4 個(gè)品種（組合）進(jìn)行單一/復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案參照文獻(xiàn)［3］花藥培養(yǎng)方法和文獻(xiàn)［15］成熟胚培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織配方。

1.6 計(jì)算參數(shù)及方法

愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)/接種花藥數(shù)×100%，綠苗分化率=綠苗分化數(shù)/愈傷組織數(shù)×100%，花藥培養(yǎng)力=愈傷組織誘導(dǎo)率×綠苗分化率×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

以X1（粳稻）及JL117（秈稻）為試驗(yàn)材料，X1 誘導(dǎo)20 d 后各培養(yǎng)基陸續(xù)有愈傷組織出現(xiàn)，JL117 接種15 d 開始有愈傷組織出現(xiàn)。各基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷組織的初始時(shí)間沒有明顯差異，但是各基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織的數(shù)量有明顯不同，接種30 d后，X1 及JL117 在I5 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量明顯高于其他培養(yǎng)基，且I5 培養(yǎng)基上的愈傷組織大而質(zhì)地緊密、顏色鮮黃，達(dá)到愈傷組織分化培養(yǎng)的條件。接種50 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率（表4），從表4 可以看出，不同的基本培養(yǎng)基對(duì)水稻花藥培養(yǎng)效果不同，I5 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)秈稻、粳稻的效果都較好，誘導(dǎo)率較高，因此最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為GM8+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA。

表4 各種誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)花藥培養(yǎng)力的影響

2.2 單一/復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)花藥培養(yǎng)力的影響

以GM8 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置僅添加2，4-D 單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的I6 培養(yǎng)基與復(fù)合培養(yǎng)基I5（CK）比較，探討單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)水稻花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)力的影響（表5）。從表5 可以看出，無論是粳稻、秈稻、糯稻或野生稻，4 種材料在復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑I5 培養(yǎng)基及單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑I6 培養(yǎng)基上，都能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生。其中，除HB613在復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率高于單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基外，其他品種在復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率并沒有明顯差異，甚至單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)率還略高于復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基，說明以GM8 為基本培養(yǎng)基，僅添加2，4-D 單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也能夠很好地誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生。進(jìn)一步分化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4 種材料在復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織上的綠苗率均高于單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，說明復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能提高花藥培養(yǎng)力。

表5 單一/復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)花藥培養(yǎng)力的影響

3 小結(jié)與討論

成功的花藥培養(yǎng)在一定程度上依賴于培養(yǎng)基的選擇，不同的培養(yǎng)基對(duì)不同基因型的水稻材料有不同的培養(yǎng)效果，目前研究主要集中在M8、合5 和N6等幾種培養(yǎng)基上［16］。本研究采用N6、合5、SK3、M8以及改良的M8 培養(yǎng)基（GM8）為基本培養(yǎng)基對(duì)粳稻X1 及秈稻JL117 進(jìn)行花藥培養(yǎng)力研究，結(jié)果表明在1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L NAA 的GM8培養(yǎng)基上獲得了較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，因此GM8培養(yǎng)基是水稻花藥培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基。

在植物離體培養(yǎng)過程中，外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑被認(rèn)為是植物胚胎發(fā)育所必需的［17］。外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)愈傷組織的發(fā)生和分化，在水稻花藥培養(yǎng)中扮演著重要角色，但研究發(fā)現(xiàn)單一成分的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)效果并不理想，而幾種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的搭配使用卻可以在花粉脫分化階段為組織的分化和成苗提供便利，由此可見水稻花藥培養(yǎng)是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，使用合理的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組分及不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比是影響花培效率的重要因素［18，19］。本研究以GM8 為基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)了單一和復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比后，發(fā)現(xiàn)單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-D在GM8 基本培養(yǎng)基上對(duì)秈稻、粳稻、糯稻及野生稻都有較好的愈傷組織誘導(dǎo)效果。

有研究表明［20-22］，單一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)花藥培養(yǎng)力效果較差，復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能明顯提高花藥培養(yǎng)力。施利利等［23］進(jìn)行不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比組合試驗(yàn)，得出合理添加2，4-D、NAA 和KT 相對(duì)于只添加2，4-D 的培養(yǎng)基，不僅出愈率高，而且愈傷質(zhì)量好。王伍梅等［24］認(rèn)為，對(duì)于粳稻或秈粳交后代誘導(dǎo)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑僅用2，4-D 是可行的。本研究結(jié)果表明，添加復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基雖然沒有明顯地提高愈傷組織誘導(dǎo)率但綠苗分化率高，即復(fù)合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基對(duì)水稻花藥培養(yǎng)力較高。