周銳澤 李文亮 黃 鑒 保見坤 （昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，昆明650032）

手術(shù)、放療及化療是治療大腸癌（colorectal can?cer，CRC）的重要手段，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致CRC 預(yù)后不佳的重要原因［1］。免疫抑制是腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視的重要途徑，腫瘤細(xì)胞分泌的TNF-α和可溶性白細(xì)胞介素-2 受體（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）抑制細(xì)胞免疫，從而促進(jìn)CRC 的增殖和轉(zhuǎn)移［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種短的、不具備編碼能力的單鏈RNA，miRNA 可靶向結(jié)合信使RNA（message RNA，mRNA）的3'端非翻譯區(qū)域（3'-ntranslated region，3'-UTR）并抑制其翻譯，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用［3］。miR-152 是一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的miRNA，一項(xiàng)研究顯示miR-152 在CRC 中水平降低，且低水平的miR-152預(yù)示不良預(yù)后，提示miR-152 在CRC 中具有抑癌作用，但其作用機(jī)制尚不清楚［4］。一項(xiàng)最新研究結(jié)果顯示miR-152 可通過(guò)抑制Wnt 通路抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖，但關(guān)于miR-152 與CRC 的關(guān)系僅通過(guò)了臨床的相關(guān)性分析得到，而關(guān)于miR-152 對(duì)CRC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和分子機(jī)制仍不清楚［5］。此外，最新研究顯示W(wǎng)nt也參與腫瘤的免疫抑制，結(jié)直腸癌細(xì)胞可通過(guò)Wnt/β-catenin 通路促進(jìn)IL-17a 表達(dá)，從而抑制T 細(xì)胞的免疫能力，但Wnt/β-catenin 與CRC 免疫抑制的關(guān)系尚不明確，且miR-152 調(diào)控CRC 的機(jī)制是否與Wnt/β-catenin 通路有關(guān)也不清楚［6］。綜上，本文主要分析miR-152調(diào)控Wnt通路對(duì)CRC 細(xì)胞生物學(xué)行為和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人CRC 細(xì)胞系SW116（ATCC 公司，美國(guó)）；DMEM 培養(yǎng)基血清和抗體、LipofectamineTM2000（Invitrogen公司，美國(guó)）；miR-152類似物（mimic）和抑制劑（inhibitor）以及相應(yīng)的陰性對(duì)照（negative control，NC，GenePharma 公司，中國(guó)）；miRNeasy Mini試劑盒；TaqMan miRNA 試劑盒、ECL 顯色試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國(guó)）；MiScript SYBR Green PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；CCK-8 試劑盒和結(jié)晶紫染色試劑盒（Beyotime 生物技術(shù)研究所，中國(guó)）；Transwell 小室、基質(zhì)膠基質(zhì)（Corning，Becton Dickinson 公司，美國(guó)）；FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀和Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）試劑盒（BD Biosci?ences 公司，加拿大）；抗體MTDH 和山羊抗兔IgG H&L（HRP，Abcam 公司，美國(guó)）；PVDF 膜（Bio-Rad公司，美國(guó)）；ELISA 試劑盒（碧云天公司，中國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將DMEM 培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW116細(xì)胞分為3組：NC組、mimic組和inhibitor組。mimic組和inhibitor組通過(guò)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn) 染50 nmol/L 的miR-152 mimic 或in?hibitor 上調(diào)或抑制miR-152 水平，NC 組轉(zhuǎn)染等量的NC 空載質(zhì)粒作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染條件為7 ℃、5%CO2、48 h。通過(guò)RT-qPCR分析轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 RT-qPCR 使用miRNeasy Mini 試劑盒提取總miRNA，并通過(guò)TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒形成cDNA。利用MiScript SYBR Green PCR 試劑盒對(duì)互補(bǔ)DNA進(jìn)行擴(kuò)增（95 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)）。通過(guò)比較循環(huán)閾值并以U6 作為內(nèi)參計(jì)算miR-152相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將100 μl 細(xì)胞懸浮液添加到96 孔板中，孵育24 h、48 h 和72 h 后，將10 μl CCK-8 溶液添加到每個(gè)孔中孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下每個(gè)孔的光密度（OD）值。

1.2.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將培養(yǎng)接種于6 孔板中的1×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)至約90%融合。使用200 μl的移液器吸頭刮擦細(xì)胞，拍照（此時(shí)為0 h）。在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。通過(guò)細(xì)胞的圖像使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，劃痕前緣遷移距離百分比（%）=（0 h寬度-48 h寬度）/0 h寬度×100%。

1.2.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲 37 ℃下將細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清DMEM 中，將細(xì)胞（5×104個(gè)/ml）進(jìn)行血清饑餓處理24 h。然后將細(xì)胞接種至24 孔Tran?swell 裝置的上部腔室，將含有15%胎牛血清的DMEM 充滿下部腔室。24 h 后清洗掉未侵入的細(xì)胞，并將滲透到下腔室中的細(xì)胞用95%乙醇固定，并在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。在400 倍視野下計(jì)隨機(jī)5個(gè)視野中細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 將處理后的各組細(xì)胞使用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，將1×106個(gè)細(xì)胞先后用預(yù)冷的PBS 和5%牛血清白蛋白（BSA）洗滌3 次，以2 000 r/min 離心收集。然后向細(xì)胞中加入300 μl 的5%BSA 和700 μl 的70%的預(yù)冷乙醇，低溫過(guò)夜。將細(xì)胞以2 000 r/min離心5 min收集并使用PBS 洗滌，細(xì)胞與100 μl 結(jié)合緩沖液和5 μl的Annexin-V-FITC（20 μg/ml）靜置15 min 在黑暗中孵 化，然 后 將150 μl 結(jié) 合 緩 沖 液 和10 μl 的PI（50 μg/ml）加入試管中靜置15 min 在黑暗中孵化，通過(guò)FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀測(cè)量凋亡率。

1.2.7 Western blot 細(xì)胞裂解后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集總蛋白。通過(guò)8%SDS-PAGE 分離每個(gè)樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過(guò)在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h 封閉非特異性抗原。隨后，將膜與TNF-α、sIL-2R、Wnt1、β-catenin、c-myc 抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后將膜與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，Quantum One軟件分析灰度計(jì)算相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0 軟件。數(shù)據(jù)以±s 表示，計(jì)數(shù)資料使用率（%）表示，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較通過(guò)SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中miR-152水平比較 轉(zhuǎn)染后，mimic組的miR-152 水平（5.94±0.58）顯著高于對(duì)照組（1.17±0.20）（P＜0.01），inhibitor 組的miR-152 水平（0.26±0.09）顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），提示轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞中miR-152水平比較Fig.1 Comparison of miR-152 levels of each group

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較 在培養(yǎng)第2 天和第3天，mimic組的OD值顯著低于NC組，而inhibitor組的OD 值顯著高于NC 組（P＜0.05），提示miR-152可抑制SW116細(xì)胞增殖，見表1。

表1 各組細(xì)胞OD值比較（±s）Tab.1 Comparison of cell OD value of each group（±s）

表1 各組細(xì)胞OD值比較（±s）Tab.1 Comparison of cell OD value of each group（±s）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Groups NC mimic inhibitor 1 d 0.46±0.05 0.41±0.04 0.49±0.05 2 d 0.67±0.07 0.52±0.061）0.85±0.091）3 d 1.08±0.10 0.84±0.091）1.46±0.181）

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 mimic 組細(xì)胞劃痕前緣遷移距離百分比顯著低于NC組，而inhibitor組（87.56±6.38）%顯 著 高 于NC 組（P＜0.05），提 示miR-152可抑制SW116細(xì)胞遷移，見表2、圖2。

圖2 劃痕愈合試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力Fig.2 Scratch healing test to detect cell migration ability

表2 各組細(xì)胞劃痕前緣遷移距離比較（±s，%）Tab.2 Comparison of migration distance of leading edge of scratch in each group（±s，%）

表2 各組細(xì)胞劃痕前緣遷移距離比較（±s，%）Tab.2 Comparison of migration distance of leading edge of scratch in each group（±s，%）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Groups NC mimic inhibitor Percentage of migration distance 63.74±3.74 35.71±3.051）87.56±6.381）

2.4 各組細(xì)胞侵襲能力比較 mimic 組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于NC組，而inhibitor組顯著高于NC組（P＜0.05），提示miR-152 可抑制SW116 細(xì)胞侵襲，見表3、圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力Fig.3 Transwell assay to detect cell invasion ability

表3 各組侵襲細(xì)胞數(shù)目比較（s）Tab.3 Comparison of number of invasive cells in each group（s）

表3 各組侵襲細(xì)胞數(shù)目比較（s）Tab.3 Comparison of number of invasive cells in each group（s）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Groups NC mimic inhibitor Number of invasive cells 97.64±7.86 60.16±7.311）169.43±11.751）

2.5 各組細(xì)胞凋亡情況比較 mimic 組細(xì)胞凋亡率顯著高于NC組，而inhibitor組顯著低于NC組（P＜0.05），提示miR-152 可促進(jìn)SW116 細(xì)胞凋亡，見表4、圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.4 Flow cytometry to detect apoptosis

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）Tab.4 Comparison of apoptosis rate of each group（±s，%）

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）Tab.4 Comparison of apoptosis rate of each group（±s，%）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Groups NC mimic inhibitor Apoptosis rate 6.79±0.95 12.20±1.681）3.65±0.641）

2.6 各組免疫功能的影響 mimic 組的TNF-α、sIL-2R 蛋白水平顯著低于NC 組（P＜0.05），inhibitor組的TNF-α、sIL-2R 蛋白水平顯著高于NC 組（P＜0.05），見表5、圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)各組TNF-α、sIL-2R蛋白水平Fig.5 Western blot detection of TNF-α and sIL-2R protein levels in each group

表5 各組TNF-α、sIL-2R水平比較（ˉ±s）Tab.5 Comparison of TNF-α and sIL-2R levels in each group（±s）

表5 各組TNF-α、sIL-2R水平比較（ˉ±s）Tab.5 Comparison of TNF-α and sIL-2R levels in each group（±s）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

2.7 各組Wnt通路相關(guān)蛋白比較 mimic 組Wnt1、β-catenin、c-myc蛋白水平顯著低于NC組（P＜0.05），inhibitor 組Wnt1、β-catenin、c-myc 蛋白水平顯著高于NC組（P＜0.05），見表6、圖6。

表6 各組Wnt1、β-catenin、c-myc蛋白比較（xˉ±s）Tab.6 Comparison of Wnt1，β-catenin and c-myc proteins in each group（xˉ±s）

圖6 Western blot 檢測(cè)各組Wnt1、β-catenin、c-myc 蛋白水平Fig.6 Western blot detection of Wnt1，β-catenin and c-myc protein level in each group

3 討論

CRC 是消化道系統(tǒng)常見腫瘤，一項(xiàng)全球性的統(tǒng)計(jì)調(diào)查結(jié)果顯示，2018 年全年新發(fā)CRC 患者共704 376 例，占所有腫瘤的3.9%，排名第八，2018 年死于CRC 的患者有310 394 例，占所有腫瘤的3.2%，排名第十［7］。現(xiàn)階段治療CRC 的方法主要是手術(shù)治療、放療、化療和免疫療法，雖然大多數(shù)CRC在短期內(nèi)會(huì)得到有效緩解，但其長(zhǎng)期療效仍不理想，大多數(shù)CRC 患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并最終導(dǎo)致患者死亡，探究CRC 發(fā)生進(jìn)展的機(jī)制具有重要意義［8］。

miRNA 可通過(guò)堿基配對(duì)方式與mRNA 的3'-UTR 區(qū)域結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平。miRNA 在CRC 轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中有顯著作用，如miR-4319、miR-32 等［9-10］。miR-152 是一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的miRNA，在乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌作用［11-12］。本研究通過(guò)CRC 細(xì)胞系SW116構(gòu)建miR-152 過(guò)表達(dá)或抑制的細(xì)胞模型，結(jié)果顯示提高miR-152水平可顯著抑制細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲功能，并在體外顯示出促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，抑制miR-152 得到相反的結(jié)果。ARDAVAN等［13］的研究結(jié)果顯示miR-152可能通過(guò)AKT通路抑制CRC 細(xì)胞的增殖和侵襲。LI 等［14］的研究結(jié)果提示miR-152可顯著抑制CRC細(xì)胞增殖。以上研究表明，在CRC 中miR-152 發(fā)揮抑癌作用，并且可抑制TNF-α、sIL-2R 表達(dá)，TNF-α、sIL-2R 起到免疫抑制作用，不但可以使CRC 細(xì)胞被免疫系統(tǒng)清除，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［15］。提示miR-152還可以發(fā)揮免疫抑制的作用。

Wnt 通路在CRC 的進(jìn)展中具有重要作用，Wnt1的激活及β-catenin 可調(diào)控原癌基因轉(zhuǎn)錄，c-myc 是Wnt 通路的下游靶基因，具有促進(jìn)CRC 增殖和轉(zhuǎn)移的作用［16］。此外，Wnt 通路也具有促進(jìn)免疫抑制的作用，研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin 通路可促進(jìn)sIL-2R 或抑制TNF-α 的水平抑制組織中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞功能和活力，從而使腫瘤細(xì)胞免受機(jī)體免疫系統(tǒng)清除［17］。本研究結(jié)果顯示上調(diào)miR-152 水平會(huì)限制Wnt1/β-catenin 途徑的蛋白水平以及下游靶蛋白c-myc 水平，而下調(diào)miR-152 的水平會(huì)促進(jìn)Wnt 通路。有研究顯示miR-152 的降低或促進(jìn)Wnt 通路，從而激活炎癥通路［18］。SUN 等［19］的研究顯示在CRC 中miR-152 通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡并抑制增殖。miR-152 的上調(diào)可抑制經(jīng)典Wnt 途徑的激活，并抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖［20］。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，抑制miR-152 可通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt 通路促進(jìn)增殖和成骨分化［21］。此外，近年來(lái)研究也發(fā)現(xiàn)了Wnt 通路活化與局部免疫有關(guān)，并認(rèn)為抑制Wnt通路緩解免疫抑制可能成為癌癥的輔助治療手段［22］。PIAZZA 等［23］的研究也顯示抑制Wnt 通路可以通過(guò)解除免疫抑制，促進(jìn)TNF-α 等具有腫瘤細(xì)胞殺傷力的細(xì)胞因子表達(dá)。提示在CRC中，miR-152 也具有緩解細(xì)胞的免疫抑制狀態(tài)的作用，而這種作用可能與miR-152 具有抑制Wnt 通路的功能有關(guān)。

綜上所述，本次體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了miR-152 可通過(guò)抑制Wnt 途徑緩解CRC 細(xì)胞的免疫抑制狀態(tài)，抑制增殖、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)凋亡。關(guān)于miR-152 通過(guò)抑制Wnt 抑制CRC 的作用仍需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其作用機(jī)制值得深入研究。