膜蛋白配體hMSH2在肺癌中的可溶性表達(dá)及影響因素①

代玉梅 張昭勇 （廣州醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)療中心臨床檢驗(yàn)部，廣州市兒研所，廣州510623）

肺癌是起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，已成為我國(guó)癌癥死亡的首要病因，且年發(fā)病率和病死率仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。過去20年，肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）治療取得了重要進(jìn)展，但總體治愈率和存活率仍較低，轉(zhuǎn)移性肺癌療效、預(yù)后更差［1］。

γδ T 細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤與抗感染免疫中發(fā)揮重要作用，主要包括Vδ1 T細(xì)胞和Vδ2 T細(xì)胞（即Vγ 9Vδ2 T 細(xì)胞）兩個(gè)最重要的亞群。前者主要存在于黏膜相關(guān)淋巴組織和上皮組織，經(jīng)膜抗原識(shí)別受體TCR 及NKG2D 直接識(shí)別并殺傷靶細(xì)胞，是抵御消化道、呼吸道、食管等黏膜相關(guān)淋巴組織惡變的第一道防線；后者是循環(huán)γδ T 細(xì)胞的主要組成部分，占外周血循環(huán)γδ T 細(xì)胞的50%～95%，經(jīng)與NK細(xì)胞相似的細(xì)胞毒作用、免疫分泌、免疫調(diào)節(jié)等多種方式參與免疫應(yīng)答，在機(jī)體抗腫瘤及抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

諸多研究表明，人γδ T 細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮的重要天然免疫監(jiān)視作用受宿主細(xì)胞表面表達(dá)的多種保守的、腫瘤或感染相關(guān)內(nèi)源性應(yīng)激分子精密調(diào)控。這些內(nèi)源性應(yīng)激分子包括目前已知的主要組織相容性分子鏈相關(guān)抗原A/B（MICA/B）、UL 結(jié)合蛋白（UL binding protein，ULBP）、熱休克蛋白（hot shock protein，HSP）、低分子量磷酸化抗原（low molecular weight phospho-antigen，Low-MW pAg）等。人MutS同源蛋白2（human MutS homologue 2，hMSH2）是本課題組前期鑒定的能被Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞識(shí)別的腫瘤相關(guān)內(nèi)源性新蛋白配體，在正常上皮組織細(xì)胞表面表達(dá)較低或幾乎無表達(dá)，但在上皮來源腫瘤細(xì)胞表面存在較為普遍的膜異位表達(dá)，且不同組織來源上皮腫瘤細(xì)胞膜異位表達(dá)程度不一［2］。這種異位表達(dá)在上皮來源腫瘤細(xì)胞表面的hMSH2 被TCRγδ 和NKG2D 識(shí)別后可顯著上調(diào)Vγ9Vδ2 T 細(xì)胞對(duì)靶腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，促進(jìn)機(jī)體腫瘤免疫應(yīng)答［2-3］。

本課題組前期在肺癌細(xì)胞系NCI-H520 的全細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)存在可溶性（soluble，s）hMSH2，推測(cè)肺癌患者血清可能存在hMSH2 的可溶形式并與肺癌的天然免疫監(jiān)視及免疫逃逸有關(guān)［4］。本研究檢測(cè)并比較肺癌、肺結(jié)節(jié)及健康人群血清shMSH2 表達(dá)，并進(jìn)一步探討其表達(dá)與肺癌患者年齡、性別、吸煙史［5-6］、家族史及常見肺癌血清輔助診斷標(biāo)志物C-反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）、血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、角質(zhì)蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）、癌胚抗原（carcinoma-embryonic antigen，CEA）及神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）水平的相關(guān)性，為揭示shMSH2 在肺癌血清中的表達(dá)、影響因素及其在肺癌天然免疫中的作用和意義提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 血清樣本收集自中山大學(xué)腫瘤防治中心，-80 ℃分裝貯存。肺癌、肺結(jié)節(jié)及健康對(duì)照人群納入標(biāo)準(zhǔn)如下。肺癌組：①依據(jù)人民衛(wèi)生出版社第8版《內(nèi)科學(xué)》所列肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的肺癌患者；②有完整臨床病歷資料；③入組者依據(jù)2009年7 月國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)（IASLC）公布的第7 版肺癌TNM 分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期。肺結(jié)節(jié)組：①依據(jù)人民衛(wèi)生出版社第8版《內(nèi)科學(xué)》所列肺結(jié)節(jié)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的肺結(jié)節(jié)患者；②有完整臨床病歷資料。健康對(duì)照組：①影像學(xué)檢查無任何肺部腫瘤提示；②無家族遺傳病史；③基本資料完整。血清標(biāo)本收集及臨床病歷資料采集均經(jīng)受試者同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器 hMSH2 ELISA 定量檢測(cè)試劑盒（OKEH01843，北京AVIVA 生物技術(shù)有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；KHBST-360 酶標(biāo)儀（深圳愛康公司）；PW-960（D）洗板機(jī)（深圳匯深公司）。

1.2 方法 凍存樣本置于4 ℃過夜融化。shMSH2定量分析嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。正式實(shí)驗(yàn)前將所需試劑、微孔板預(yù)平衡至室溫并按要求提前2 h 預(yù)配制標(biāo)準(zhǔn)品（5 000 pg/ml 貯存液梯度稀釋）和足量Biotinylated MSH2 Detector Antibody（1×）、HRP-Avidin Conjugate（1×）、Washing Buffer（1×）、Streptavidin-HRP（1×）試劑。按說明書100 μl/孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣品，設(shè)置2個(gè)平行復(fù)孔，37 ℃孵育2 h。開蓋棄液后加入100 μl 預(yù)配制的Biotinylated MSH2 Detector Antibody（1×）37 ℃孵育1 h。再次棄液后用Washing Buffer（1×）機(jī)洗3 次，300 μl/孔；拍凈余液后加入HRP-Avidin Conjugate（1×）37 ℃孵育1 h。機(jī)洗5次后加入90 μl TMB底物37 ℃避光孵育15～30 min 后加入50 μl 終止液，混勻后檢測(cè)A450/A540，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算shMSH2的血清濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.2 軟件統(tǒng)計(jì)制圖。除肺癌血清常用腫瘤輔助診斷標(biāo)志物表達(dá)以mean±SD顯示外，其他數(shù)據(jù)均以mean±SE顯示。組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)、Mann-Whitney檢驗(yàn)或One-way ANOVA 等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者血清shMSH2 表達(dá) ELISA 結(jié)果顯示，肺癌、肺結(jié)節(jié)及健康對(duì)照人群血清均存在不同水平的shMSH2 表達(dá)。其中，肺癌患者血清shMSH2表達(dá)為（682±76）pg/ml，明顯低于肺結(jié)節(jié)組［（796±114）pg/ml］和健康對(duì)照組［（762±62）pg/ml］，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 肺癌患者血清shMSH2表達(dá)Fig.1 Serum shMSH2 expression in patients with lung cancer

2.2 影響肺癌患者血清shMSH2表達(dá)的因素

2.2.1 肺癌類型的影響 肺鱗癌、肺腺癌是肺癌的兩種主要組織類型。明確分型的39 例研究對(duì)象中，肺鱗癌約占12.8%（5/39），肺腺癌約占66.7%（26/39），提示華南地區(qū)肺癌分布的組織類型以腺癌為主。ELISA 定量分析結(jié)果顯示，肺鱗癌患者血清shMSH2 表達(dá)［（748±227）pg/ml］明顯高于肺腺癌患者［（608±123）pg/ml］。其他類型肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)如下：小細(xì)胞肺癌（764±249）pg/ml，大細(xì)胞肺癌740 pg/ml，腺鱗癌926 pg/ml，淋巴上皮型肺癌847 pg/ml，外周型肺癌（563±395）pg/ml，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 肺癌組織類型對(duì)shMSH2表達(dá)的影響Fig.2 Effect of lung cancer different histotype on shMSH2 expression

2.2.2 肺癌轉(zhuǎn)移的影響 圖3 所示為肺癌轉(zhuǎn)移與肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)的關(guān)系。除T3 外，T1a～T2b 至T4 期shMSH2 表達(dá)呈逐漸升高趨勢(shì)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 肺癌轉(zhuǎn)移對(duì)shMSH2表達(dá)的影響Fig.3 Effect of lung cancer metastasis on shMSH2 expression

2.2.3 吸煙史、家族史的影響 將肺癌受試者按是否有吸煙史、家族史分組，比較組間血清shMSH2表達(dá)差異，結(jié)果顯示，有吸煙史肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)［（592±99）pg/ml］明顯低于無吸煙史肺癌患者［（757±113）pg/ml］，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有癌癥家族史肺癌患者血清shMSH2表達(dá)［（649±88）pg/ml］明顯低于無癌癥家族史肺癌患者［（714±164）pg/ml］，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 肺癌患者吸煙史/癌癥家族史對(duì)shMSH2表達(dá)的影響Fig.4 Effect of smoking history/family history on shMSH2 expression

2.2.4 常用肺癌血清診斷標(biāo)志物與shMSH2 表達(dá)常用肺癌診斷相關(guān)血清學(xué)診斷標(biāo)志物L(fēng)DH、CRP、SAA、CYFRA21-1、CEA 及NSE 分析結(jié)果見表1。其中，SAA、CYFRA21-1、CEA 三項(xiàng)指標(biāo)均值均高出正常范圍。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)與上述腫瘤相關(guān)血清標(biāo)志物表達(dá)無顯著相關(guān)性（P＞0.05，圖5）。

表1 肺癌患者血清常見腫瘤標(biāo)志物表達(dá)（）Tab.1 Common serum biomarkers in patients with lung cancer（）

表1 肺癌患者血清常見腫瘤標(biāo)志物表達(dá)（）Tab.1 Common serum biomarkers in patients with lung cancer（）

Items LDH/（U·L-1）CRP/（mg·L-1）SAA/（mg·L-1）CYFRA21-1/（ng·ml-1）CEA/（ng·ml-1）NSE/（ng·ml-1）Concentration 187.14±87.50 7.19±14.42 27.67±50.86 6.59±12.23 16.75±39.24 14.42±13.34 Reference interval 109～245＜10 0.068～8.200＜3.3＜5.0＜16.3

圖5 肺癌患者血清shMSH2表達(dá)與常見腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性分析Fig.5 Relationship between serum shMSH2 expression and common serum lung cancer biomarkers

3 討論

肺癌是癌癥死亡的主要原因。因肺癌病例異質(zhì)性所致的可適性生長(zhǎng)降低了治療成功率，但也促進(jìn)了基于新抗原、肺癌基質(zhì)、免疫細(xì)胞、靶向基因和白細(xì)胞分化抗原等個(gè)性化生物療法的出現(xiàn)和發(fā)展，以及對(duì)因治療誘導(dǎo)的肺癌進(jìn)行性轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)臨床結(jié)局生物標(biāo)志物的探索研究［7-12］。

hMSH2 是本課題組前期研究鑒定出的一個(gè)內(nèi)源性、應(yīng)激性腫瘤和EBV 感染相關(guān)蛋白抗原，在上皮來源腫瘤及EBV 感染細(xì)胞表面存在較廣泛的異位表達(dá)［2-3，13］。這種異位表達(dá)的膜hMSH2 作為腫瘤及EBV感染相關(guān)的內(nèi)源性配體參與Vδ2 T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答［2，13］。已有研究發(fā)現(xiàn)Vδ2 T 細(xì)胞識(shí)別的某些配體的可溶形式參與介導(dǎo)上皮來源腫瘤免疫逃逸，明確肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)，闡述其可溶性表達(dá)的影響因素及與常用肺癌血清診斷標(biāo)志物的相關(guān)性，對(duì)揭示shMSH2 在肺癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值，以及進(jìn)一步鑒定其在肺癌血清中的存在形式、揭示其在肺癌天然免疫中的功能與機(jī)制有著非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義［14］。

本研究首次對(duì)肺癌、肺結(jié)節(jié)及健康對(duì)照人群血清shMSH2 表達(dá)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)其在肺癌、肺結(jié)節(jié)及健康人群血清均存在不同水平的可溶性表達(dá)。與sMICs、sHSPs等其他能被γδ T細(xì)胞識(shí)別的可溶性腫瘤相關(guān)蛋白配體不同的是，肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)略低于肺結(jié)節(jié)及健康對(duì)照人群。推測(cè)生理?xiàng)l件下shMSH2 的產(chǎn)生可能與宿主細(xì)胞壞死、凋亡或機(jī)體既往病理應(yīng)激有關(guān)。hmsh2是一個(gè)管家基因，在宿主細(xì)胞和組織中存在較廣泛的表達(dá)。正常細(xì)胞凋亡、崩解時(shí)內(nèi)源性hMSH2 蛋白可能會(huì)分泌、釋放至體液，導(dǎo)致健康人群血清存在較高水平的shMSH2。這種shMSH2 可能會(huì)與宿主細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體及其他互作蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，參與相關(guān)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控宿主細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、細(xì)胞損傷與凋亡及B 細(xì)胞抗體類別轉(zhuǎn)換。shMSH2在健康人群血清中的基線水平可能會(huì)對(duì)hMSH2 的亞細(xì)胞分布產(chǎn)生一定影響。

肺結(jié)節(jié)形成大部分由局部炎癥所致。hMSH2本身是一個(gè)感染相關(guān)的內(nèi)源性、應(yīng)激性免疫預(yù)警分子，肺結(jié)節(jié)患者血清shMSH2 表達(dá)最高可能與局部感染、炎癥時(shí)產(chǎn)生的各種刺激因子密切相關(guān)。癌癥狀態(tài)對(duì)宿主而言也是一種惡性應(yīng)激，因機(jī)體的免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫清除能力減低，患者常伴隨不同程度發(fā)熱、體重減輕、炎癥等癥狀。本課題組前期在宮頸癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等多種上皮細(xì)胞來源腫瘤細(xì)胞膜及腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)hMSH2 異位表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)較肺結(jié)節(jié)和健康對(duì)照人群呈降低趨勢(shì)，提示腫瘤應(yīng)激狀態(tài)下惡變上皮細(xì)胞表面異常表達(dá)的hMSH2 可能多以糖基化（或其他修飾形式）的膜蛋白形式存在，以分泌或蛋白酶水解等方式產(chǎn)生的shMSH2 較少。當(dāng)然，腫瘤發(fā)生時(shí)惡變細(xì)胞增殖及永生化能力增強(qiáng)、凋亡或壞死減少，可能也是導(dǎo)致肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)偏低的重要因素。此外，紫外線、發(fā)熱、病毒感染、氧化應(yīng)激等物理、生物、化學(xué)因素均可誘導(dǎo)hMSH2 在惡變細(xì)胞表面的異位表達(dá)。因正常情況下宿主細(xì)胞膜基本無hMSH2 異常表達(dá)，肺癌、肺結(jié)節(jié)患者血清中shMSH2 的產(chǎn)生可能還與惡變宿主細(xì)胞膜hMSH2脫落、降解有關(guān)。鑒于癌癥患者血清中的shMSH2可能會(huì)與膜hMSH2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合天然免疫細(xì)胞的抗原識(shí)別受體，利于腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，對(duì)shMSH2 在肺癌血清中的存在形式和表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)研究結(jié)果將另外發(fā)表。

本研究分析肺癌組織類型對(duì)血清shMSH2 表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌患者血清shMSH2 表達(dá)較肺腺癌患者高，無家族史肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)較有家族史肺癌患者高，提示shMSH2 的血清表達(dá)與患者肺癌組織類型、家族史存在一定聯(lián)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無差異可能因分層后亞組樣本量少，受試者個(gè)體差異大所致。擴(kuò)大研究規(guī)?？蛇M(jìn)一步確定二者對(duì)肺癌血清shMSH2 表達(dá)的影響并排除統(tǒng)計(jì)學(xué)分析造成的假陰性。有研究發(fā)現(xiàn)煙草暴露所致的基因突變是肺癌發(fā)生的重要驅(qū)動(dòng)因素［15］。全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果證實(shí)NSCLC 患者吸煙和非吸煙人群基因克隆模式存在多樣性［6］。但依據(jù)當(dāng)前研究結(jié)果，課題組認(rèn)為暫時(shí)不宜得出肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)受肺癌組織類型、吸煙史、家族史影響的結(jié)論。

炎癥是癌癥的主要伴發(fā)癥狀之一［16］。本研究同時(shí)對(duì)用于評(píng)估急性時(shí)相反應(yīng)進(jìn)程的CRP、SAA 進(jìn)行了檢測(cè)（二者在炎癥及腫瘤惡性轉(zhuǎn)移時(shí)常會(huì)顯著升高），此外還分析了CYFRA21-1、CEA、LDH、NSE等對(duì)NSCLC 具有重要輔助診斷價(jià)值的血清腫瘤診斷標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然肺癌患者血清SAA、CY?FRA21-1、CEA 表達(dá)明顯高于正常值，shMSH2 水平卻與這些指標(biāo)無顯著相關(guān)性，提示將其聯(lián)合用于肺癌臨床輔助診斷的前景并不樂觀?？紤]到現(xiàn)有市售ELISA 檢測(cè)試劑盒可能存在方法學(xué)局限性，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大研究規(guī)模（尤其是分層后各亞組樣本納入量），嘗試采用更先進(jìn)、更靈敏、更特異的方法（如基因芯片、RNAseq、化學(xué)發(fā)光等）結(jié)合免疫印跡、免疫共沉淀等技術(shù)，對(duì)肺癌患者血清shMSH2 表達(dá)、存在形式、互作蛋白和臨床意義進(jìn)行深入研究。

此外，γδ T 細(xì)胞識(shí)別的已知可溶性表達(dá)的腫瘤或感染相關(guān)內(nèi)源性抗原MICA/B、HSPs 等，均可作為免疫細(xì)胞識(shí)別配體或Toll受體啟動(dòng)機(jī)體天然或適應(yīng)性免疫應(yīng)答。shMSH2作為hMSH2在肺癌血清中的可溶形式，在Vγ9Vδ2 T細(xì)胞介導(dǎo)的肺癌免疫監(jiān)視和免疫逃逸中的作用和意義亦有待深入研究。

致謝：衷心感謝臨床檢驗(yàn)部、臨床生物資源庫(kù)全體同事對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持。