陳玉林 劉玉芳 儲(chǔ)明星

摘要 [目的]探究綿羊發(fā)情相關(guān)基因KITLG、MAPK1、NOTCH4和NR5A2在小尾寒羊性腺軸組織（大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管）中的表達(dá)差異，為闡明綿羊高繁殖力的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。[方法]以FecB BB型小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測上述4個(gè)基因在小尾寒羊發(fā)情周期（黃體期和卵泡期）性腺軸相關(guān)的7種組織中的表達(dá)差異。[結(jié)果] KITLG基因在小尾寒羊卵泡期輸卵管組織中的表達(dá)量最高，其在黃體期小腦與垂體中的表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05）;MAPK1基因在小尾寒羊卵泡期大腦組織中的表達(dá)量最高且極顯著高于黃體期（P<0.01），其在黃體期下丘腦和小腦組織中的表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05），而其在卵泡期輸卵管組織中的表達(dá)量顯著高于黃體期（P<0.05）;NOTCH4基因在小尾寒羊黃體期下丘腦中的表達(dá)量最高，而其在黃體期子宮中的表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05）;NR5A2基因在小尾寒羊黃體期卵巢組織中的表達(dá)量最高，其在黃體期子宮組織中的表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05）。[結(jié)論]KITLG、MAPK1、NOTCH4和NR5A2基因可作為潛在的候選基因來調(diào)控綿羊繁殖力。該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明綿羊高繁殖力的分子機(jī)理提供了新思路。

關(guān)鍵詞 綿羊;發(fā)情相關(guān)基因;性腺軸;組織表達(dá)

中圖分類號(hào) S 826? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）01-0092-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.023

Study on the Expression Profile of Estrus-related Genes in the Gonadal Axis Tissues of Small Tail Han Sheep

CHEN Yu-lin1，2， LIU Yu-fang1，2， CHU Ming-xing1

（1.Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193;2. College of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan， Hebei 056001）

Abstract [Objective] To explore the expression difference of estrus-related genes KITLG， MAPK1， NOTCH4 and NR5A2 in the gonadal axis tissues （brain， cerebellum， hypothalamus， pituitary， uterus， ovary， fallopian tube） of Small Tail Han Sheep， and provide the theoretical basis for clarifying the molecular mechanism of high-fertility sheep. [Method]Using FecB BB type Small Tail Han Sheep as the research objects， real-time quantitative PCR was used to detect the expression difference of the four genes in seven kinds of tissues related to the gonadal axis of Small Tail Han Sheep in the estrus period（luteal phase and follicular phase）. [Result]The expression level of KITLG gene in the oviduct tissues of Small Tail Han Sheep in the follicular phase was the highest， its expression levels in the cerebellum and pituitary tissues of Small Tail Han Sheep in the luteal phase were significantly higher than that in the follicular phase （P<0.05）.The expression level of MAPK1 gene in the brain tissues of Small Tail Han Sheep in the follicular phase was the highest， which was extremely significantly higher than that in the luteal phase（P>0.01）. Its expression levels in hypothalamus and cerebellum tissues of Small Tail Han Sheep in the luteal phase were significantly higher than that in the follicular phase （P<0.05）， and its expression level in fallopian tube tissues in the? follicular phase was significantly higher than that in the luteal phase（P<0.05）. The expression level of NOTCH4 gene in the hypothalamus of Small Tail Han Sheep in the luteal phase was the highest， and the expression level in uterus tissues in the? luteal phase? was significantly higher than that in the follicular phase （P<0.05）. [Conclusion]KITLG， MAPK1， NOTCH4 and NR5A2 genes might be used as potential candidate genes to regulate the fecundity of sheep. The research provided a new idea for further clarifying the molecular mechanism of sheep’s high fertility.

Key words Sheep;Estrus-related genes;Gonadal axis;Tissue expression

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31772580）;國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-38）;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ZDRW202106，ASTIP-IAS13）;河北省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（C2019402261）。

作者簡介 陳玉林（1997—），男，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種。

通信作者：劉玉芳，講師，博士，從事動(dòng)物遺傳育種研究;儲(chǔ)明星，研究員，博士，從事羊優(yōu)異繁殖性狀分子機(jī)理研究。

收稿日期 2021-05-19

如何提高綿羊的繁殖力一直是畜牧業(yè)關(guān)注的問題[1]。發(fā)情期是動(dòng)物繁殖的重要時(shí)期，分為卵泡期和黃體期，卵母細(xì)胞必須經(jīng)過卵泡期的發(fā)育才能成熟進(jìn)而排卵，黃體期黃體的生長發(fā)育則釋放黃體酮等激素，為母體妊娠提供適宜的環(huán)境，為進(jìn)一步的繁殖做準(zhǔn)備[2]。綿羊的繁殖力受到其發(fā)情方式的直接影響，常年發(fā)情綿羊的繁殖力通常比季節(jié)性發(fā)情綿羊有更大的優(yōu)勢[3]。因此，研究綿羊的發(fā)情機(jī)制及其如何影響綿羊的繁殖力一直是一個(gè)備受關(guān)注的問題。小尾寒羊作為一種優(yōu)質(zhì)的常年發(fā)情綿羊，其高繁殖力的特點(diǎn)使其成為研究綿羊發(fā)情機(jī)制及繁殖力機(jī)制的完美模型。筆者篩選出幾個(gè)與動(dòng)物發(fā)情期相關(guān)的基因，旨在為闡明綿羊發(fā)情機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，為提高綿羊繁殖力提供新的研究思路。

KIT配體（KITLG）是c-KIT跨膜酪氨酸激酶受體（KIT）的配體，也被稱為干細(xì)胞因子、鋼鐵因子或肥大細(xì)胞生長因子。動(dòng)物模型顯示，顆粒細(xì)胞衍生的KITLG與卵母細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞衍生的KITLG之間的相互作用涉及卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)育的各個(gè)方面，包括卵巢中原始生殖細(xì)胞的形成、原始卵泡的激活、卵母細(xì)胞的存活和生長、顆粒細(xì)胞的增殖、膜細(xì)胞的募集和減數(shù)分裂停滯的維持[4]。MAPK1是MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）的成員之一，在MAPK通路中發(fā)揮其作用，是卵泡發(fā)育的一條重要途徑。MAPK通路的激活可以促進(jìn)瘦素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟[5]。NOTCH4是一個(gè)保守的跨膜受體家族成員，可通過與一些特定的配體相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞，在許多發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，影響細(xì)胞分化、增殖和凋亡[6-8]。Hernandez等[9]研究表明NOTCH4通過Notch信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)黃體細(xì)胞活力和類固醇合成的作用。NR5A2也被稱為胎兒蛋白轉(zhuǎn)錄因子（FTF）、肝臟受體同源1（LRH-1），是核激素受體（NR）轉(zhuǎn)錄因子亞家族的成員，NR5A2與哺乳動(dòng)物的類固醇合成、細(xì)胞增殖、卵泡發(fā)育、排卵和生育等多種過程有關(guān)[10]。

筆者利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對(duì)上述發(fā)情期相關(guān)候選基因在綿羊不同發(fā)情期（卵泡期和黃體期）性腺軸組織的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，為進(jìn)一步揭示KITLG、MAPK1、NOTCH4和NR5A2基因的功能和解析綿羊繁殖機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品的收集

隨機(jī)選取3周歲健康、經(jīng)產(chǎn)的空懷小尾寒羊卵泡期和黃體期母羊各3只，于2017年10月飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)羊場，所有試驗(yàn)羊的飼養(yǎng)環(huán)境和飼料均相同。2017年11月對(duì)試驗(yàn)羊進(jìn)行屠宰，取其大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢和輸卵管，取樣后迅速裝入1.8 mL RNase-Free凍存管中（最大樣品量為凍存管體積的2/3）。所有樣品采集要在屠宰后30 min內(nèi)完成，樣品采集完后迅速放入液氮中冷凍保存，用干冰帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-80 ℃冰箱中冷凍保存，備用。

1.2 RNA的提取及質(zhì)量檢測

將采集的小尾寒羊卵泡期和黃體期性腺軸7種組織研磨后，用Trizol試劑（Invitrogen，美國）進(jìn)行裂解，此后按照動(dòng)物組織RNA提取試劑盒（天根，北京）的說明書進(jìn)行總RNA的提取，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測提取RNA的質(zhì)量和濃度。經(jīng)檢驗(yàn)合格的組織總RNA于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的綿羊KITLG、MAPK1、NOTCH4、NR5A2基因序列（登錄號(hào)分別為NM_001267888.1、XM_027956867.1、XM_027958770.1、NM_001246280.1）信息，并使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以RPL19為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。各引物濃度均為10 μmol/L，引物序列詳細(xì)信息見表1。

1.4 cDNA的合成

利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PK0445）合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系如下：1.0 μL反轉(zhuǎn)錄混合引物，1.0 μL Oligo dT引物，1.0 μL隨機(jī)引物，4.0 μL熒光定量緩沖液，1.0 μL RNA，12.0 μL雙蒸水，全程在冰上操作。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將反轉(zhuǎn)錄完成后的cDNA產(chǎn)物稀釋后，用持家基因RPL19進(jìn)行PCR檢測，質(zhì)量合格后-20 ℃下保存，以備檢測基因mRNA表達(dá)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系及反應(yīng)程序。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系（總體積20 μL）：10.0 μL熒光定量Ex Taq引物Ⅱ，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，2.0 μL cDNA 模板，6.4 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

將cDNA樣本5倍稀釋后，進(jìn)行2倍梯度稀釋后獲得5個(gè)濃度梯度（1、1/2、1/4、1/8、1/16）的cDNA樣品。用這些cDNA為模板，對(duì)目的基因和持家基因進(jìn)行熒光定量PCR，以濃度梯度的對(duì)數(shù)值（以10為底數(shù)）為橫坐標(biāo)，以檢測所得Ct值為縱坐標(biāo)，繪制目的基因和持家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量檢測與數(shù)據(jù)分析。

使用Roche Light Cycler480 Ⅱ 型熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量檢測，使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用2-△△Ct的方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。獲得的表達(dá)量數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取

提取后的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28S條帶明顯比18S條帶更亮，且條帶完整性較好，表明該RNA質(zhì)量合格，能用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 4個(gè)基因在各組織中表達(dá)分析

2.2.1 KITLG基因組織表達(dá)檢測。

qPCR結(jié)果顯示，KITLG基因在7種組織中均有表達(dá)，其在小尾寒羊卵泡期輸卵管中的相對(duì)表達(dá)量最高，其在黃體期小腦與垂體組織中的相對(duì)表達(dá)量均大于卵泡期且差異顯著（P<0.05），在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量差異均不顯著（P>0.05）（圖1）。

2.2.2 MAPK1基因組織表達(dá)檢測。

MAPK1基因在小尾寒羊卵泡期大腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高且極顯著高于黃體期（P<0.01），在黃體期下丘腦組織中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于卵泡期（P<0.01）;其在黃體期小腦組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05），其在卵泡期輸卵管組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于黃體期（P<0.05）;其在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量差異均不顯著（P>0.05）（圖2）。

2.2.3 NOTCH4基因組織表達(dá)檢測。

如圖3所示，NOTCH4基因在小尾寒羊黃體期下丘腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，其在黃體期子宮組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05），而其在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量差異均不顯著（P>0.05）。

2.2.4 NR5A2基因組織表達(dá)檢測。

如圖4所示，NR5A2基因在小尾寒羊黃體期卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，其在黃體期子宮組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05），而其在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量均無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

動(dòng)物發(fā)情是研究動(dòng)物繁殖育種不可忽視的一環(huán)，其中發(fā)情方式、發(fā)情時(shí)間均受到多種遺傳因素的影響，研究綿羊發(fā)情期相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制對(duì)于提高綿羊繁殖力有著重大意義[11]。卵泡在發(fā)情期的生長發(fā)育狀況直接決定了綿羊的排卵數(shù)。排卵數(shù)是決定綿羊產(chǎn)羔數(shù)的直接因素，卵泡的生長發(fā)育與排卵數(shù)有著直接的聯(lián)系[12-14]。性腺軸是以下丘腦-垂體-卵巢為主的主要參與調(diào)控卵巢內(nèi)卵泡及黃體生長發(fā)育的相關(guān)組織，研究性腺軸組織中發(fā)情相關(guān)基因的表達(dá)為進(jìn)一步探究提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的方法提供了新思路[15]。

KITLG作為KIT的配體，是細(xì)胞表面錨定因子家族成員之一[16]。KIT/KITLG信號(hào)通路是生殖細(xì)胞生長發(fā)育過程中不可或缺的，其與生殖細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)[17]。研究表明，KITLG基因在多種動(dòng)物卵巢組織中均有表達(dá)，且對(duì)排卵前卵泡的生長發(fā)育起重要作用，已有試驗(yàn)證實(shí)KITLG基因多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)具有顯著關(guān)聯(lián)[18-19]。該試驗(yàn)中KITLG基因在性腺軸7種組織中均有表達(dá)，其在小腦和垂體中的相對(duì)表達(dá)量在2個(gè)時(shí)期間存在顯著差異（P<0.05），其在垂體中的相對(duì)表達(dá)量較少，其在2個(gè)時(shí)期卵巢組織中均有表達(dá)，但差異未達(dá)到顯著水平（P>0.05），推測該基因不參與卵泡期與黃體期的轉(zhuǎn)換調(diào)控過程，其在不同時(shí)期的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）作為MAPK通路中的重要成員，參與生殖過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可激活卵母細(xì)胞的成熟進(jìn)程，使其經(jīng)歷生發(fā)泡破裂等一系列過程[20-21]。該試驗(yàn)中MAPK1基因在卵泡期大腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高且極顯著高于黃體期（P<0.01），其在黃體期下丘腦組織中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于卵泡期（P<0.01），黃體期小腦組織中該基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05），在卵泡期輸卵管組織中該基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于黃體期（P<0.05），但除了卵泡期大腦組織外該基因在2個(gè)時(shí)期性腺軸各組織中的相對(duì)表達(dá)量均不高，推測其在小尾寒羊性腺軸對(duì)發(fā)情期的調(diào)控過程中沒有起到重要的調(diào)控作用。

NOTCH4在NOTCH通路中作為受體發(fā)揮作用，NOTCH信號(hào)通路在許多器官與細(xì)胞的發(fā)育中非常重要。雷俊川[22]研究表明其在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用。該試驗(yàn)中NOTCH4基因在小尾寒羊不同時(shí)期性腺軸7種組織中均有表達(dá)。NOTCH4基因在小尾寒羊黃體期子宮組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05），且其在卵泡期子宮中的相對(duì)表達(dá)量較低。根據(jù)前人研究結(jié)果，推測出其在子宮妊娠環(huán)境的建立過程中參與調(diào)控[23]。

NR5A2由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：DNA結(jié)合（DBD）和配體結(jié)合（LBD）結(jié)構(gòu)域、連接DBD和LBD的長Hinger（HR）以及修飾結(jié)構(gòu)域（MD）[24]。在成年哺乳動(dòng)物中，NR5A2基因主要在前脂肪細(xì)胞以及肝、腸、胰腺、卵巢和睪丸中均有表達(dá)，尤其在卵巢中高表達(dá)，該基因是卵泡發(fā)育和排卵的重要和多效性調(diào)節(jié)因子[7]。該試驗(yàn)中NR5A2基因在小尾寒羊黃體期和卵泡期大腦、小腦和垂體組織中低表達(dá)，其在黃體期子宮組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵泡期（P<0.05），其在卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，但黃體期與卵泡期之間無顯著差異。結(jié)合前人研究結(jié)果，推測出該基因在小尾寒羊卵泡和黃體生長發(fā)育過程中起到重要作用，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了KITLG、MAPK1、NOTCH4和NR5A2基因在小尾寒羊卵泡期和黃體期性腺軸7種組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KITLG、MAPK1、NOTCH4和NR5A2基因在卵泡期、黃體期性腺軸相關(guān)組織中的表達(dá)量有較大差異，這4個(gè)基因可能對(duì)綿羊發(fā)情周期的轉(zhuǎn)換具有一定的調(diào)控作用，可為進(jìn)一步闡明綿羊發(fā)情周期轉(zhuǎn)換的分子機(jī)理提供參考。

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