翟栓麗，侯心然，張強(qiáng)，李琪，李天元，邢穎娜，傅曉文

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生態(tài)研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250103）

油田開(kāi)采區(qū)多位于鹽堿區(qū)域，長(zhǎng)期的石油開(kāi)采造成了大量的石油污染鹽堿土壤，其修復(fù)治理研究備受關(guān)注。微生物修復(fù)是重要的石油烴污染土壤的修復(fù)方法，、、、、、、、以及等高效石油烴降解菌株在以往研究中均有報(bào)道。然而，上述微生物主要為非耐鹽微生物，在鹽堿環(huán)境中無(wú)法正常發(fā)揮降解作用。高鹽環(huán)境中的石油烴降解只能通過(guò)耐鹽或嗜鹽的石油烴降解微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前對(duì)耐鹽石油烴降解菌的報(bào)道主要集中在、、、、、等屬中。不同屬來(lái)源的菌株對(duì)高鹽的耐受及對(duì)石油烴的降解特性有較大差別，這些不同種屬來(lái)源菌株的耐鹽范圍多集中在12%~25%，有些菌株對(duì)鹽的耐受性更高，但降解污染物的最佳鹽濃度多在5%~10%，高鹽會(huì)導(dǎo)致微生物的代謝活性降低而使降解效率下降。

盡管國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)高鹽環(huán)境下石油烴的微生物降解過(guò)程進(jìn)行了許多探索，但這些研究多針對(duì)石油烴的某些組分的降解。雖然也有嗜鹽菌對(duì)原油降解研究的相關(guān)報(bào)道，但未見(jiàn)鹽度變化與嗜鹽菌降解不同石油烴組分之間的相關(guān)性的研究。本文研究了勝利油田油泥中篩選出的一株鹽單胞菌（sp1-3）的耐鹽生長(zhǎng)性能以及鹽度變化對(duì)菌株降解石油烴的特性的影響，對(duì)我國(guó)部分油田的高聚、高黏石油烴降解修復(fù)具實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菌株分離自勝利油田孤島采油廠產(chǎn)生的油泥。菌株經(jīng)分離并純化后，加入30%（∶）滅菌甘油，-80℃超低溫保存。對(duì)其進(jìn)行16SrDNA測(cè)序并在NCBI中通過(guò)Blast同源性比對(duì)，初步鑒定為鹽單胞菌，命名為sp.1-3。

試驗(yàn)用原油取自勝利油田孤島采油廠，基本參數(shù)為：密度0.948 3 g·cm，運(yùn)動(dòng)黏度（50℃）309.5 mm·s，蠟含量5.1%，庚烷瀝青質(zhì)含量3.2%。

石油烴（C~C）標(biāo)準(zhǔn)溶液：=31 000 mg·L，各正構(gòu)烷烴濃度均為1 000 mg·L，溶劑為正己烷，購(gòu)自上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

ONR7a培養(yǎng)基（人工模擬海水培養(yǎng)基）：每升含NaCl 22.79 g、KCl 0.72 g、NaSO3.98 g、TAPSO 1.30 g、NHCl 0.27 g、NaHPO·7HO 0.72 g、NaBr 83 mg、NaHCO31 mg、HBO27 mg、NaF 2.6 mg、MgCl·6HO 11.18 g、CaCl·2HO 1.46 g、SrCl·6HO 24 mg、FeSO·7HO 2.8 mg，其中NaCl的濃度根據(jù)1.3.2小節(jié)以及1.3.3小節(jié)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行調(diào)整。

原油培養(yǎng)基：在250 mL錐形瓶中加入100 mL ONR7a培養(yǎng)基，添加終濃度為1%（∶）的原油，調(diào)節(jié)pH為7.2，121℃滅菌30 min。

菌種活化培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 100 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌30 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

從-80℃冰箱取出菌種，室溫自然解凍后接種100μL至100 mL滅菌的菌種活化培養(yǎng)基，置于30℃搖床中，150 r·min條件下活化培養(yǎng)48 h。

培養(yǎng)結(jié)束后菌液于4℃、8 000 r·min下離心5 min，棄上清液，收集菌體，再用滅菌的PBS溶液洗滌菌體2次，最后用滅菌PBS溶液重懸并稀釋至OD600值為1.0（約7.2×10CFU·mL），用于進(jìn)行菌株的耐鹽培養(yǎng)試驗(yàn)及石油烴降解試驗(yàn)。

1.3.2sp1-3耐鹽培養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)NaCl濃度梯度，以獲取適宜菌株培養(yǎng)的NaCl濃度范圍，調(diào)節(jié)原油培養(yǎng)基的NaCl終濃度分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%，在100 mL培養(yǎng)基中接種5%（∶）活化并重懸后的菌種，30℃、150 r·min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3組平行，每隔12 h取樣并測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.3.3sp1-3菌株在不同NaCl濃度條件下對(duì)石油烴的降解

為研究菌株適宜降解石油烴的NaCl濃度范圍，試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[13-14]選擇5個(gè)NaCl濃度梯度進(jìn)行。調(diào)節(jié)原油培養(yǎng)基的NaCl終濃度分別為1%、5%、10%、15%和20%，100 mL培養(yǎng)基接入10%活化并重懸的菌種，搖床中30℃、150 r·min條件下培養(yǎng)15 d，以不接菌為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3組平行，測(cè)定菌株在不同鹽度條件下對(duì)石油烴的降解率及殘留成分的組成。1.3.4sp1-3對(duì)石油烴表觀降解率測(cè)定方法

用25 mL二氯甲烷萃取降解體系中的石油烴，室溫25℃、300 W條件下超聲振蕩10 min，置于分液漏斗中靜置分層，取下層萃取液，上層溶液繼續(xù)重復(fù)萃取2次后，混合3次萃取液并加入足量的無(wú)水硫酸鈉脫水，抽濾去除硫酸鈉，旋蒸至二氯甲烷完全揮發(fā)，室溫放置2 d至恒質(zhì)量，以不接菌的原油培養(yǎng)基的萃取油樣為對(duì)照，質(zhì)量法計(jì)算石油烴的表觀降解率：

降解率=（對(duì)照原油質(zhì)量-處理原油質(zhì)量）/對(duì)照原油質(zhì)量×100%

此條件下石油烴的回收率為（98.72±0.87）%。

1.3.5 石油烴組分的測(cè)定

樣品按照1.3.4小節(jié)的方法萃取、脫水后，石油溶液旋蒸濃縮至約1 mL，轉(zhuǎn)移至硅酸鎂填料柱凈化，12 mL正己烷淋洗凈化柱，收集淋洗液，再次旋蒸濃縮并定容至1.0 mL。GC-MS（Agilent 7890A，美國(guó)）分析萃取液中的石油烴組分，色譜條件為：頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣，HP-5苯基-甲基聚硅氧烷柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱分離；初始柱溫為50℃，保持2 min，然后以40℃·min的速率升至230℃，再以20℃·min的速率升至320℃保持20 min；載氣（高純N）流速為1.5 mL·min，氫氣流速30 mL·min，空氣流速300 mL·min；進(jìn)樣口溫度300℃，不分流進(jìn)樣；檢測(cè)器溫度325℃，進(jìn)樣量1μL。按生態(tài)環(huán)境部標(biāo)準(zhǔn)《土壤和沉積物石油烴（C-C）的測(cè)定氣相色譜法》（HJ 1021—2019）中的方法進(jìn)行結(jié)果分析和計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株Halomonas sp.1-3耐鹽生長(zhǎng)特性

利用MEGA 7.0.26軟件Neighbor-joining法構(gòu)建了該菌株基于16SrDNA序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。結(jié)果顯示，與菌株序列相似性最高的為GeneBank中公布的伸長(zhǎng)鹽單胞菌strain BA-AB8KJ185379.1，初步鑒定該菌株為鹽單胞菌，命名為sp.1-3。

圖1 菌株Halomonas sp.1-3基于16s rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 1 Phylogenetic tree of strain Halomonas sp.1-3 based on 16SrDNA sequence homology

菌株sp1-3在不同NaCl濃度下的生長(zhǎng)特征見(jiàn)圖2，由圖2可知，3%NaCl條件下培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)適應(yīng)期較短，迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36 h時(shí)菌體濃度達(dá)到最高，隨后立即進(jìn)入衰亡期，最終保持較低的菌體密度。在6%NaCl條件下，菌株在培養(yǎng)24~60 h時(shí)維持在穩(wěn)定期，但60 h后菌密度迅速下降。從9%開(kāi)始，隨著NaCl濃度的增加，延滯期逐漸延長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)變慢，菌株培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，但穩(wěn)定期也更長(zhǎng)。

嗜鹽菌在低鹽濃度條件下細(xì)胞內(nèi)外離子濃度平衡被打破，細(xì)胞吸水膨脹，最終引起胞壁破裂，菌體自溶，細(xì)胞密度迅速下降。NEIFAR等將在10%NaCl的條件下培養(yǎng)，結(jié)果顯示接種6 d后達(dá)到穩(wěn)定期，而且穩(wěn)定期能夠持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，與本文結(jié)論一致。高鹽度條件下細(xì)胞生理活性下降，菌體對(duì)高鹽生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)期較長(zhǎng)，延滯期延長(zhǎng)。

2.2 不同NaCl濃度條件下Halomonas sp.1-3對(duì)石油烴的表觀降解

在NaCl濃度1%~20%范圍內(nèi)菌株sp.1-3對(duì)石油烴的降解率隨NaCl濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，NaCl濃度為5%時(shí)，15 d后的降解率最高，顯著高于其他鹽度和反應(yīng)時(shí)間下的降解率（圖3）。NaCl濃度為1%時(shí)石油烴降解啟動(dòng)早，但不具有持續(xù)性，隨著菌體的快速衰亡，降解過(guò)程迅速終止。NaCl濃度為5%~10%時(shí)降解效率高，表明菌株在中鹽度條件下對(duì)石油的降解效果最佳，與中等NaCl濃度條件下菌株繁殖迅速并能保持較高的細(xì)胞濃度的結(jié)果一致。黃中子等也發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌對(duì)有機(jī)物的降解在NaCl濃度為5%左右時(shí)降解過(guò)程啟動(dòng)快，隨著鹽度的升高，降解過(guò)程啟動(dòng)延遲，終降解率逐漸降低。NaCl濃度大于10%時(shí)，菌株sp1-3對(duì)石油烴的降解率隨NaCl濃度的升高而降低。高鹽條件下雖然有較高的細(xì)胞濃度，但石油烴降解相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致嗜鹽菌對(duì)石油烴的降解能力隨著鹽分的升高而降低。WANG等對(duì)嗜鹽菌群在高鹽環(huán)境下降解PAHs的研究也證明了降解代謝基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著鹽度的增加而降低，高鹽度會(huì)限制嗜鹽菌群落中的微生物活性。

圖3 不同NaCl濃度條件下Halomonas sp.1-3對(duì)石油烴的降解Figure 3 Petroleum-degradation by strain Halomonas sp.1-3 under different NaCl concentrations

韋娜等的研究結(jié)果顯示，在鹽度3%~25%范圍內(nèi)對(duì)BRF的降解率隨著鹽度的升高先升后降，其中5%鹽度下的降解效果最佳，與本文結(jié)果一致。HADDADI等研究降解苯酚的性能時(shí)也得到類似結(jié)果，即7%NaCl濃度時(shí)苯酚的降解效率最高，降解率隨著NaCl濃度的升高而降低，生物量也隨之降低。

2.3 Halomonas sp.1-3對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度石油烴的降解特征

復(fù)雜污染場(chǎng)地中污染物的毒性取決于污染物的組合方式，因此研究菌株對(duì)石油烴不同組分的降解特性對(duì)其應(yīng)用至關(guān)重要。菌株sp1-3在NaCl濃度為1%、5%以及10%條件下培養(yǎng)15 d后對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度石油烴降解特性（圖4）表明，NaCl濃度為5%時(shí)石油烴中C~C的降解率在55%~85%，說(shuō)明sp1-3底物范圍較廣，在石油污染修復(fù)方面具有較好的應(yīng)用潛力。1%和10%NaCl濃度時(shí)降解規(guī)律基本一致，對(duì)較短碳鏈（C~C）及較長(zhǎng)碳鏈（C~C）的石油烴有較高的降解效率。MNIF等研究了對(duì)石油的降解，發(fā)現(xiàn)其降解范圍廣，中長(zhǎng)鏈烴降解較完全，但中短碳鏈的石油烴（C、C、C）有殘留，與MOHAMMAD等研究的對(duì)石油烴的降解特性有所差別。MOHAM?MAD等發(fā)現(xiàn)該菌能首先完全利用短鏈烴（C和C）以及長(zhǎng)鏈烴（C和C），中等鏈長(zhǎng)的石油烴在培養(yǎng)過(guò)程的后期逐漸被去除。研究結(jié)果的差異可能是由于試驗(yàn)菌株雖然都屬于鹽單胞菌屬，但不同的菌種來(lái)源對(duì)石油烴降解有差異。原油性質(zhì)差別也可能對(duì)降解過(guò)程產(chǎn)生影響，本文所用石油樣品黏度大、膠質(zhì)含量高，對(duì)生物降解會(huì)產(chǎn)生不利影響。

圖4 菌株Halomonas sp.1-3對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度石油烴的降解特性Figure 4 Degradation characteristics of petroleum hydrocarbonswith different carbon numbers by Halomonas sp.1-3

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，菌株sp1-3對(duì)石油烴降解初期會(huì)形成中間產(chǎn)物的明顯積累，由于石油組分復(fù)雜，中間產(chǎn)物引起的生物毒性的變化會(huì)影響生物修復(fù)的效果，因此在應(yīng)用該菌株進(jìn)行生物修復(fù)時(shí)，在考慮最適宜生物處理?xiàng)l件的同時(shí)，還要延長(zhǎng)修復(fù)時(shí)間，使石油烴盡可能完全降解。

2.4 Halomonas sp.1-3對(duì)石油烴不同餾分分段的降解

參考美國(guó)總石油烴標(biāo)準(zhǔn)工作組對(duì)石油烴組分的劃分，以及國(guó)內(nèi)學(xué)者結(jié)合我國(guó)國(guó)情對(duì)石油烴污染風(fēng)險(xiǎn)控制綜合因素的考慮，本研究對(duì)石油烴的碳鏈長(zhǎng)度分段并對(duì)不同NaCl濃度下降解特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（圖5），菌株sp1-3對(duì)石油烴降解15 d后，NaCl濃度為5%時(shí)各分段石油烴的降解率均最高，顯著高于其他NaCl濃度時(shí)相應(yīng)碳鏈長(zhǎng)度分段石油烴的降解率，總降解率達(dá)到63.5%。當(dāng)NaCl在10%~20%范圍時(shí)，C~C較短碳鏈的石油烴降解率隨著鹽濃度的升高呈下降趨勢(shì)，C~C中長(zhǎng)鏈?zhǔn)蜔N的降解率差異不顯著，而C~C長(zhǎng)鏈?zhǔn)蜔N降解率呈上升趨勢(shì)。文獻(xiàn)中未見(jiàn)NaCl濃度升高對(duì)不同石油烴餾分分段降解影響的報(bào)道，但黃新顏等研究NaCl對(duì)瀝青的侵蝕時(shí)發(fā)現(xiàn)，高鹽導(dǎo)致飽和分、芳香分、膠質(zhì)減少，認(rèn)為瀝青中羧酸類和酚類等輕質(zhì)含氧化合物在鹽離子溶液中會(huì)發(fā)生一定的溶解和電離，羧酸與Na、K等堿金屬離子生成的低價(jià)高級(jí)有機(jī)酸鉀鹽和鈉鹽屬于典型的皂類化合物，易溶于水，導(dǎo)致其生物有效性提高。因此，本文中高NaCl濃度下中長(zhǎng)碳鏈的石油烴的降解率升高可能與其生物有效性的提高有關(guān)。

圖5 菌株Halomonas sp.1-3對(duì)石油烴不同餾分分段降解Figure 5 Degradation performance of petroleum hydrocarbons fractions by Halomonas sp.1-3

3 結(jié)論

（1）為較快獲得降解菌sp.1-3且保持在培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性，該菌適宜在ONR7a培養(yǎng)基中NaCl濃度為9%~15%條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的原油。

（2）降解菌sp.1-3在NaCl濃度為5%~10%時(shí)對(duì)石油烴降解效率較高，且能持續(xù)有效降解，其中NaCl濃度5%時(shí)菌株對(duì)石油烴的降解效率最高。

（3）降解菌sp.1-3對(duì)C~C的石油烴均有降解能力，且隨著NaCl濃度的升高，短鏈的石油烴（C~C）降解效率降低，而長(zhǎng)鏈?zhǔn)蜔N（C~C）的降解效率逐漸升高。