張皓冰，陳慧慧，文 琳，孫 妍，趙紅燕，高建芳

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

蛇毒是由肽類與蛋白質(zhì)構(gòu)成的混合物，是有毒蛇類重要的捕食與防御敵害的生化武器[1-2].蛇毒的組成與含量存在較大的種內(nèi)、種間差異，如眼鏡蛇科物種的蛇毒主要含有三指結(jié)構(gòu)毒素(3FTx)與磷脂酶A2(PLA2)等組分，蝰科物種的蛇毒主要含有金屬蛋白酶(SVMP)、磷脂酶A2與絲氨酸蛋白酶(SVSP)等組分；同種不同年齡、性別、季節(jié)和地理等來(lái)源的蛇毒在組分的相對(duì)含量上也會(huì)存在不同程度的差異[2].得益于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，系統(tǒng)闡釋蛇毒蛋白組構(gòu)成特征的全貌，推進(jìn)蛇毒的進(jìn)化機(jī)制與功能解釋深度、蛇傷的精準(zhǔn)化診療以及天然活性藥物的挖掘，成為當(dāng)前蛇毒組學(xué)研究工作興起的重要內(nèi)容.蛇毒組學(xué)研究策略的構(gòu)建以及大規(guī)模研究結(jié)果的報(bào)道為抗蛇毒血清制備策略的優(yōu)化完善以及效價(jià)評(píng)估新方法的構(gòu)建提供了基礎(chǔ).

1 蛇毒組學(xué)研究的興起與研究策略的發(fā)展

自1994年澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams提出“蛋白質(zhì)組學(xué)”概念[3]以來(lái)，人們開(kāi)始不斷嘗試各種方法分離并鑒定復(fù)雜混合蛋白樣品中的組分，進(jìn)而表征整個(gè)蛋白樣品的組成、相對(duì)含量以及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等信息.隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的成熟，尤其是質(zhì)譜鑒定方法，高通量表征復(fù)雜蛋白樣品的研究變得日益廣泛，全球范圍有關(guān)蛇毒組成的研究也同樣獲得了一次新的發(fā)展.2004年，Calvete實(shí)驗(yàn)室開(kāi)創(chuàng)性地提出了“蛇毒組學(xué)(snake venomics)”[4]研究思路與策略，并于2007年啟動(dòng)大范圍蛇毒組學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目[5].至今，在全球科學(xué)家的共同努力下，已完成200多種蛇毒全蛋白組構(gòu)成特征的解析.

蛇毒組學(xué)研究策略一般涉及蛇毒的分離與高通量鑒定方法的優(yōu)化組合，當(dāng)前主要遵循的是自下而上(bottom-up)的方法組合(圖1).其中，分離方法主要涉及基于凝膠(gel-based)的電泳技術(shù)和無(wú)凝膠(gel-free)的層析技術(shù)兩大類.一般來(lái)說(shuō)，以分子量大小為分離基礎(chǔ)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，也即一維電泳)和以等電點(diǎn)結(jié)合分子量大小為分離基礎(chǔ)的二維電泳(2-DE，也稱雙向電泳)是兩種主要分離蛇毒蛋白的電泳方法.前者無(wú)論操作還是設(shè)備，均較為簡(jiǎn)單，作為主要或輔助手段在蛇毒蛋白分離中至今被廣泛使用；后者在蛇毒蛋分離中的應(yīng)用始于1998年，由Rioux首次從二維尺度上比較了藍(lán)灰扁尾海蛇(Laticaudacolubrina)和陸棲圓斑蝰(Viperarusselli)蛇毒蛋白構(gòu)成特征的差異[6].由于設(shè)備條件的限制，二維電泳在蛇毒蛋白分離研究中的應(yīng)用遠(yuǎn)沒(méi)有一維電泳來(lái)得廣泛，且在過(guò)去的10年中正逐漸被研究者遺忘.此外，凝膠電泳不易表征等電點(diǎn)與分子量極端的蛇毒蛋白，且對(duì)低豐度組分的分辨能力也存在較大的局限性.層析技術(shù)被認(rèn)為在一定程度上可彌補(bǔ)凝膠電泳的不足，且可實(shí)現(xiàn)不同規(guī)模的蛇毒組分分離要求.其中，凝膠排阻(GF)、離子交換(IEX)和親和吸附(AF)為主的低壓液相層析(FPLC)以及疏水分離為基礎(chǔ)的反相高效液相層析(RP-HPLC)技術(shù)伴隨著設(shè)備的迭代，自動(dòng)化水平獲得了極大提升，在蛇毒活性成分的分離純化研究中已成為常規(guī)手段.不過(guò)，單純依靠層析技術(shù)，在蛇毒分離中同樣會(huì)存在不足.2004年，Li等以4種不同的組合方法(GF+2-DE、GF+酶解+RP-HPLC、酶解+RP-HPLC和SDS-PAGE+酶解+RP-HPLC)分離并鑒定短尾蝮蛇毒和舟山眼鏡蛇毒發(fā)現(xiàn)，不同方法所解析的蛇毒蛋白組構(gòu)成特征存在較大差異，方法間的相互組合可能有助于提高蛇毒蛋白的分離效果[7].事實(shí)上，在過(guò)去10余年中興起的蛇毒組學(xué)研究工作正是大范圍采用了RP-HPLC與SDS-PAGE技術(shù)組合以實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜前蛇毒蛋白的分離(圖1B-C)[5,8]，并輻射至其他生物毒素組學(xué)的研究工作[9-10].

一般認(rèn)為，末端(N端)測(cè)序技術(shù)較早被用于蛇毒蛋白的鑒定，Rioux等正是采用Edman降解法與氨基酸分析明確了兩種蛇毒的蛋白組構(gòu)成差異[6].末端測(cè)序雖然精準(zhǔn)，但測(cè)序的長(zhǎng)度有限，且可能受N端封閉等因素的影響，目前在高通量解析蛇毒蛋白組特征中的應(yīng)用較少.20個(gè)世紀(jì)80年代，以電離噴霧(ESI)和基質(zhì)輔助激光解析(MALDI)為基礎(chǔ)的質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)始出現(xiàn)在生物大分子的檢測(cè)研究中，相關(guān)技術(shù)的發(fā)展成熟為大規(guī)模解析蛇毒蛋白組構(gòu)成特征提供了重要支撐.一般，高通量分離的蛇毒蛋白被酶解后形成的肽段由質(zhì)譜掃描獲取其一級(jí)和二級(jí)離子峰圖，經(jīng)解析和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后確定蛋白類型.早期蛇毒蛋白組鑒定時(shí)常以一級(jí)質(zhì)譜(也稱為肽質(zhì)量指紋圖譜)為主，并搭配末端測(cè)序補(bǔ)充測(cè)定前者無(wú)法鑒定的組分[4,11].隨著各種形式的二級(jí)質(zhì)譜(如傅里葉、四極桿、離子阱和靜電軌道阱等)鑒定技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)始逐漸出現(xiàn)一級(jí)質(zhì)譜搭配二級(jí)質(zhì)譜鑒定蛇毒蛋白組[5,7,12-13]，或者末端測(cè)序與二級(jí)質(zhì)譜組合鑒定蛇毒蛋白組，而一級(jí)質(zhì)譜僅用于測(cè)定各蛇毒組分的分子量[14-17].此外，共享數(shù)據(jù)庫(kù)(如NCBI、UniProt)中蛇毒蛋白與相關(guān)編碼基因(尤其是轉(zhuǎn)錄組和基因組)序列數(shù)據(jù)的大量釋放，以及檢索軟件關(guān)于肽段de novo解析功能的強(qiáng)化，使得眾多有關(guān)蛇毒組學(xué)的研究熱衷于用二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行組分鑒定(圖1D-E)[18-23].

蛇毒組學(xué)研究策略的最后環(huán)節(jié)是確定各組分的含量，所有鑒定組分一般依據(jù)其所在液相峰、電泳條帶的相對(duì)含量以及特征性肽段的質(zhì)譜峰強(qiáng)度等參數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量，這成為多數(shù)研究評(píng)估各毒素家族占全毒比重的主要方法(圖1F)，簡(jiǎn)潔直觀的數(shù)據(jù)結(jié)果在進(jìn)行不同蛇毒比較時(shí)也十分方便.此外，同位素標(biāo)記的相對(duì)定量檢測(cè)也同樣被應(yīng)用于蛇毒組學(xué)的比較研究，但相關(guān)工作迄今只有兩例[24-25].盡管確定各組分的絕對(duì)含量對(duì)蛇毒組學(xué)研究更有意義，迄今只有Calderón-Celis等在2017年發(fā)表了一例相關(guān)工作，主要以同位素32S/34S信號(hào)強(qiáng)度比為標(biāo)準(zhǔn)參照，利用三重四極桿和電噴霧四極桿質(zhì)譜對(duì)多種蛇毒中不同組分進(jìn)行了絕對(duì)含量的測(cè)定[26].無(wú)論相對(duì)定量還是絕對(duì)定量，蛇毒組學(xué)研究大規(guī)模解析的各種蛇毒全蛋白組構(gòu)成信息，為理解蛇毒功能、蛇傷臨床癥狀以及抗蛇毒血清的制備完善以及臨床應(yīng)用提供了豐富的數(shù)據(jù)參考，同時(shí)也為毒素組學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ).

圖1 蛇毒組學(xué)常規(guī)研究策略示意圖Fig.1 Schematic representation of a routine strategy in snake venomic analysis

2 傳統(tǒng)評(píng)估抗蛇毒血清效價(jià)的方法

毒蛇咬傷如救治不及時(shí)，容易引發(fā)較高的死亡率和致殘率.動(dòng)物源性抗蛇毒血清自發(fā)明以來(lái)，已被實(shí)踐證實(shí)為臨床治療毒蛇咬傷的最佳藥物.20世紀(jì)抗蛇毒血清的制備技術(shù)經(jīng)過(guò)一系列改良完善后，形成一套可提煉臨床用高效價(jià)的完整免疫球蛋白IgG或免疫球蛋白片段F(ab’)2/Fab的抗蛇毒藥物精制品的工藝[27].然而，接受免疫的動(dòng)物可能因生理狀態(tài)以及個(gè)體差異等原因，對(duì)注入的外源性蛇毒會(huì)出現(xiàn)不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答，進(jìn)而導(dǎo)致同批蛇毒免疫制備的抗蛇毒血清呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的效價(jià).此外，蛇毒組分與含量還存在顯著的種內(nèi)種間差異，使得現(xiàn)行臨床用抗蛇毒血清往往只對(duì)特定蛇種或特定區(qū)域的蛇種具有較好的治療效果.因此，無(wú)論是免疫不同階段抗蛇毒血清效價(jià)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)還是最終精制品效價(jià)的評(píng)估，都應(yīng)借助可靠的檢測(cè)方式予以嚴(yán)格把關(guān).

傳統(tǒng)評(píng)估抗蛇毒血清效價(jià)是以體外與體內(nèi)檢測(cè)相結(jié)合的方式進(jìn)行的.體外檢測(cè)方式通常包括雙向免疫擴(kuò)散、蛋白印跡(western blot)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)等，可供動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)動(dòng)物在接受免疫不同階段對(duì)蛇毒的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，也可用于評(píng)估精制抗蛇毒血清的效價(jià).體內(nèi)檢測(cè)則以待測(cè)抗蛇毒血清中和蛇毒致死毒性(半數(shù)致死劑量LD50)的能力(半數(shù)有效劑量ED50)為主，中和肌肉毒性、出血毒性、促凝活性及疽死活性等為輔[28]，因此需涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠)的使用，是精制抗蛇毒血清商業(yè)使用前的必檢環(huán)節(jié).事實(shí)上，傳統(tǒng)體外評(píng)估抗蛇毒血清效價(jià)的方法往往只能提供一個(gè)籠統(tǒng)的定性(雙向免疫擴(kuò)散、蛋白印跡)或定量(ELISA)結(jié)果，無(wú)法同步實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定性定量效果.此外，隨著人們對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3Rs使用原則[28]的日益重視，優(yōu)化使用、少用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或以其他方法替換實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用成為新的準(zhǔn)則，這同樣向傳統(tǒng)體內(nèi)評(píng)估抗蛇毒血清效價(jià)的方法提出了挑戰(zhàn).當(dāng)然，毒蛇咬傷未必致死，但會(huì)導(dǎo)致患者組織損傷和一些永久性的后遺癥，某些特定的癥狀也往往只與某一類或幾類蛇毒組分相關(guān).因此，尋求新的方法以供精準(zhǔn)測(cè)定抗蛇毒血清對(duì)蛇毒不同組分的中和能力成為完善抗蛇毒血清效價(jià)臨床前綜合評(píng)估方法的迫切工作，這一要?jiǎng)?wù)更是被納入了《世界衛(wèi)生組織抗蛇毒血清生產(chǎn)與質(zhì)控指南》[29].

3 抗毒素組學(xué)策略評(píng)估抗蛇毒血清效價(jià)

在過(guò)去的10多年中，基于質(zhì)譜技術(shù)的蛇毒組學(xué)研究使人們對(duì)蛇毒成分的了解快速增長(zhǎng)，與此關(guān)聯(lián)的“抗毒素組學(xué)(antivenomics)[30]”應(yīng)運(yùn)而生，是抗蛇毒血清效價(jià)臨床前評(píng)估方法的重要革新.抗毒素組學(xué)被認(rèn)為是一種翻譯性的蛇毒組學(xué)，是以大規(guī)模解析蛇毒蛋白組構(gòu)成特征為前提結(jié)合免疫沉淀/親和吸附技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)研究策略，旨在完善傳統(tǒng)抗蛇毒血清效價(jià)的體內(nèi)臨床前評(píng)估策略的不足.其原理是將蛇毒與抗蛇毒血清按一定的含量比予以孵育，通過(guò)檢測(cè)抗蛇毒血清中和/吸附蛇毒不同組分及含量來(lái)衡量抗蛇毒血清對(duì)蛇毒的免疫中和能力.盡管一些研究基于毒素組學(xué)的結(jié)果，直接應(yīng)用ELISA或western blot等技術(shù)評(píng)估抗蛇毒血清對(duì)蛇毒不同液相分離峰的中和效果[31-35]，但各類毒素組分可能因分子量等理化特性的差異影響其被固相材料(如96孔酶標(biāo)板)吸附效果的均一性或轉(zhuǎn)膜速度的一致性，不利于評(píng)估的精準(zhǔn)性.目前，抗毒素組學(xué)策略已更新迭代至第三代，能夠?qū)崿F(xiàn)可視化評(píng)估抗蛇毒血清對(duì)蛇毒的定性定量識(shí)別吸附能力，可較為準(zhǔn)確地計(jì)量抗蛇毒血清對(duì)蛇毒中各種毒素蛋白的最大結(jié)合能力.

基于抗原抗體免疫沉淀原理，第一代抗毒素組學(xué)是將蛇毒與抗蛇毒血清按一定的配比(眼鏡蛇科蛇毒1∶8，蝰科蛇毒1∶20)進(jìn)行孵育，隨后用RP-HPLC表征上清液中尚未被抗體識(shí)別的蛇毒組分(包括部分被免疫沉淀和無(wú)法被免疫沉淀的組分)[30,35].液相分離峰與事先經(jīng)液相分離-凝膠電泳-質(zhì)譜表征的蛇毒組學(xué)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，具有相同保留時(shí)間的分離峰被認(rèn)為是相同組分，以峰面積量化各組分的相對(duì)含量，最終基于上清液中所留存的蛇毒組分的類型與含量來(lái)評(píng)估抗蛇毒血清對(duì)蛇毒的免疫識(shí)別能力[30].第一代抗毒素組學(xué)策略(圖2)自2008年首次提出后一直被沿用至2012年，至少在10種商用或?qū)嶒?yàn)室制備的抗蛇毒血清的效價(jià)評(píng)估中成功獲得了實(shí)踐[30,35-36].然而，該方法涉及的抗蛇毒血清需一次性消耗使用，不利于結(jié)果的重復(fù)檢驗(yàn)，且易造成抗蛇毒血清的浪費(fèi).

圖2 第一代抗毒素組學(xué)策略流程圖(改編自Petras等[35])Fig.2 Schematic representation of the first generation antivenomics (adapted from Petras et al.[35])

第二代抗毒素組學(xué)以抗蛇毒血清親和吸附蛇毒組分為設(shè)計(jì)理念，將抗蛇毒血清分子固定在固相基質(zhì)(如CNBr活化的瓊脂糖4B或NHS活化的瓊脂糖4FF)上，制成抗蛇毒血清親和吸附柱(圖3A).隨后將蛇毒與親和柱孵育(蛇毒與抗蛇毒血清孵育比例同第一代抗毒素組學(xué))，分別收集未被吸附和被吸附的蛇毒組分流穿液(圖3A)，兩種組分的液相分離峰與全蛇毒進(jìn)行定性定量比較后確定抗蛇毒血清對(duì)蛇毒的免疫識(shí)別能力(圖3B).相比于第一代抗毒素組學(xué)，第二代抗毒素組學(xué)色譜痕跡更平滑，可獲得更好的分辨率和更準(zhǔn)確的定量結(jié)果，且掛載有抗蛇毒血清分子的親和吸附柱經(jīng)再生處理后可重復(fù)使用，極大地提高了抗毒素組學(xué)的易推廣性、經(jīng)濟(jì)性和結(jié)果的可重復(fù)性，有效改良了第一代抗毒素組學(xué)的不足[28,37].第二代抗毒素組學(xué)策略的應(yīng)用實(shí)例要比第一代抗毒素組學(xué)策略來(lái)得多[28]，由于蛇毒與抗蛇毒血清仍沿用經(jīng)驗(yàn)性孵育比，不同的蛇毒組分與抗蛇毒血清分子的結(jié)合效率可能因孵育比的不同而存在差異，因此無(wú)法深入探討抗蛇毒血清對(duì)不同含量的蛇毒的中和識(shí)別能力.

圖3 第二代抗毒素組學(xué)策略流程圖(改編自Gao等[38])Fig.3 Schematic representation of the second generation antivenomics (adapted from Gao et al.[38])

2017年，Calvete實(shí)驗(yàn)室再次提出一項(xiàng)方案以優(yōu)化第二代抗毒素組學(xué)策略，并將其定義為第三代抗毒素組學(xué)[39].迭代后的策略仍遵循免疫親和吸附原理(圖3A)，相較于第二代抗毒素組學(xué)策略，在親和吸附柱掛載抗蛇毒血清含量一定的前提下改變蛇毒孵育量，形成多個(gè)蛇毒與抗蛇毒血清孵育的梯度(圖4A).通過(guò)比較全蛇毒、吸附組分以及未吸附組分的液相表征結(jié)果，并結(jié)合已有的蛇毒組數(shù)據(jù)來(lái)確定抗蛇毒血清對(duì)蛇毒不同組分的最大吸附能力以及動(dòng)態(tài)吸附效果，最終構(gòu)建可視化的量效關(guān)系(圖4B).由于第三代抗毒素組學(xué)策略增加了孵育梯度的數(shù)量，明顯改善了蛇毒與抗蛇毒血清中和反應(yīng)量效關(guān)系的分辨率.迭代后的策略雖然優(yōu)勢(shì)明顯，但工作量卻增加不少，目前其應(yīng)用僅涉及4種抗蛇毒血清對(duì)5種蛇毒中和效價(jià)的評(píng)估[39-42].

圖4 第三代抗毒素組學(xué)策略流程圖[39]Fig.4 Schematic representation of the third generation antivenomics[39]

4 展望

盡管相較于當(dāng)前主流的自下而上的蛇毒組學(xué)研究策略，自上而下(top-down)的策略無(wú)論在體現(xiàn)肽段與目標(biāo)蛋白的覆蓋度還是解析相似度極高的蛋白質(zhì)變體(proteoform)時(shí)，均具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能極大提高蛇毒組分鑒定的精準(zhǔn)性和可靠性，但受限于技術(shù)設(shè)備、數(shù)據(jù)庫(kù)等條件，在蛇毒組學(xué)研究中的應(yīng)用實(shí)例較少[43-46].此外，抗體分子在固相基質(zhì)上的吸附能力決定著毒素組學(xué)研究結(jié)果可靠性，蛇毒組分的復(fù)雜度和變異度也同樣會(huì)增加抗蛇毒血清效價(jià)評(píng)估時(shí)的難度.但不可否認(rèn)的是，蛇毒組學(xué)研究結(jié)果為系統(tǒng)闡釋蛇毒功能與蛇傷癥狀的復(fù)雜性、優(yōu)化完善抗蛇毒血清制備方案提供了豐富的依據(jù)，抗毒素組學(xué)將抗蛇毒血清對(duì)蛇毒組分的免疫識(shí)別的評(píng)估與蛇毒組學(xué)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，為抗蛇毒血清的同源或準(zhǔn)特異性功效推斷提供了依據(jù).此外，相較于傳統(tǒng)的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估抗蛇毒血清效價(jià)的方法，抗毒素組學(xué)策略具備更精準(zhǔn)有效的結(jié)果，有望推動(dòng)減少乃至徹底替代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在抗蛇毒血清效價(jià)評(píng)估中的使用.隨著技術(shù)與分析方法的發(fā)展，蛇毒組學(xué)與抗毒素組學(xué)面臨的問(wèn)題也將逐漸解決，它也將憑借著其優(yōu)勢(shì)在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用.