姜 炅,董 蕾,宋亞華,王 晶,程 妍,戴社教(西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710004;通訊作者,E-mail:daishejiao@163.com)

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類模式識別受體,能夠識別存在于病原微生物體內(nèi)的病原體相關分子模式,產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應激活天然免疫,調節(jié)獲得性免疫[1]。研究表明TLRs激動劑具有較強的抗腫瘤作用,不僅可以對抗感染,提高獲得性免疫[2],還可以直接誘導腫瘤細胞發(fā)生程序性死亡[3-5]。咪喹莫特(imiquimod,IMQ)是一種人工合成的咪唑喹啉類異環(huán)胺類藥物,是目前最為熟悉的選擇性TLR7激動劑[6],被美國FDA批準用于治療外陰疣,光化角化病及淺表基底細胞癌[7]。咪喹莫特的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在逆轉腫瘤細胞產(chǎn)生的免疫抑制,通過刺激TLR7激活樹突狀細胞介導的MyD88依賴途徑分泌INF-α,IL-6、TNF-α等炎癥因子,實現(xiàn)調節(jié)免疫、治療腫瘤的目的[6,8]。此外咪喹莫特還可以直接誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡,雖然TLR7不依賴于膜結合的死亡受體,但是過度表達Bcl-2或者抑制caspase信號途徑的活化都可以抵抗咪喹莫特誘導的細胞凋亡[9,10]。近些年的研究發(fā)現(xiàn),咪喹莫特對一些實體腫瘤如乳腺癌[11]、髓系白血病[12]、口腔癌[13]等也具有一定的抑制作用,并且咪喹莫特對腫瘤細胞的抑制作用是通過誘導多種形式的程序性死亡而實現(xiàn)的。

細胞自噬是不同于細胞凋亡的另外一種程序性死亡,在介導細胞增殖和死亡中具有重要作用。大量研究表明一些人類腫瘤出現(xiàn)自噬基因拷貝缺失、表達水平下調,提示調控自噬可能成為治療腫瘤的方向之一[14],并且許多抗腫瘤藥物正是通過誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬而在腫瘤的治療中表現(xiàn)出了良好的療效。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)不同類型的胃癌細胞株中及胃癌組織中均有TLR7的表達,其激動劑咪喹莫特對SGC-7901細胞生長表現(xiàn)出良好的抑制作用并且能夠誘導其發(fā)生凋亡[15]。除此之外,我們的實驗還發(fā)現(xiàn)咪喹莫特存在誘導SGC-7901細胞發(fā)生其他類型程序性死亡的可能性,為了證實這一點,本研究在先前實驗的基礎上通過檢測藥物干預前后自噬相關基因表達變化探討咪喹莫特抑制胃癌細胞增殖的深入機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901由西安交通大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科實驗室提供。采用含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),常規(guī)加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素,37 ℃,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育細胞至對數(shù)生長期用于實驗。咪喹莫特購自美國Enzo life Sciences公司;兔抗人LC3抗體、Beclin1抗體分別購自美國Sigma公司及Epitomics公司;mTOR、p-mTOR、p-Akt、p70S6K、GPDH和二抗均購自南京巴傲得生物公司;p62兔抗人、Akt鼠抗人抗體購自美國Santa Cruz公司;反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司;本實驗所采用引物由北京奧科生物公司設計并合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 RT-PCR法檢測自噬相關基因表達改變 取對數(shù)生長期SGC-7901細胞以1×105/孔接種于6孔板,給予25,50,100 μg/ml咪喹莫特處理24 h,收集干預組及陰性對照組(0 μg/ml咪喹莫特)細胞,提取總RNA,紫外分光光度儀進行RNA含量及純度鑒定,建立逆轉錄反應體系:37 ℃ 15 min(逆轉錄反應),85 ℃ 5 s(逆轉錄酶失活反應)。合成的cDNA按下述條件進行擴增:預變性94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 35個循環(huán),延伸72 ℃ 7 min。合成引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 Western blot法檢測細胞自噬相關蛋白及Akt/mTOR通路相關蛋白表達變化 取對數(shù)生長期SGC-7901細胞以1×105/孔接種于6孔板,給予25,50,100 μg/ml咪喹莫特處理24 h,收集干預組及陰性對照組細胞;聯(lián)合應用mTOR抑制劑雷帕霉素24 h,收集聯(lián)合應用組(100 μg/ml咪喹莫特加100 nmol/L雷帕霉素)與100 μg/ml咪喹莫特組及陰性對照組細胞,PBS清洗2次,加入蛋白裂解液冰上裂解1 h,提取總蛋白,蛋白定量后分別取30 μg蛋白制備上樣蛋白,8%或10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,先后加入一抗(LC3 1 ∶500,Beclin1 1 ∶1 000,p62 1 ∶500,p-Akt 1 ∶500,Akt 1 ∶200,mTOR 1 ∶500,p-mTOR 1 ∶500,p70S6K 1 ∶500。4 ℃孵育過夜,TBST清洗3次,對應二抗(山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗1 ∶1 000)。室溫下孵育2 h,TBST清洗3次,PBS清洗1次,暗室中等比例加入化學發(fā)光液A和B作用1～3 min,進行顯影,定影及拍照。

1.2.3 透射電鏡下觀察細胞形態(tài)學改變 給與100 μg/ml咪喹莫特處理12 h,取干預組及陰性對照組對數(shù)生長期SGC-7901細胞以1×105/孔接種于6孔板,0.25%胰酶消化干預后細胞,1 500 r/min離心15 min,棄上清,1%四氧化鋨固定,隨后依次進行脫水、包埋、聚合及染色后,透射電鏡下觀察細胞超微結構的改變。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期SGC-7901細胞以5×103/孔接種于96孔板,聯(lián)合應用mTOR抑制劑雷帕霉素24 h,收集聯(lián)合應用組(100 μg/ml咪喹莫特加100 nmol/L雷帕霉素)與100 μg/ml咪喹莫特組及陰性對照組細胞,每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h,棄上清,加入150 μl/孔DMSO室溫震蕩儀上震蕩5 min,酶標儀490 nm波長處測定吸光度A值按以下公式計算細胞存活率。細胞存活率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結果

2.1 咪喹莫特誘導SGC-7901細胞自噬相關基因及蛋白表達改變

不同濃度組咪喹莫特處理24 h,LC3Ⅱ和Beclin1 mRNA及蛋白表達水平上調,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(LC3Ⅱ：F=84.508、P=0.000,F=48.891、P=0.000;Beclin1：F=12.276、P=0.002,F=54.518、P=0.000),且隨濃度增加表達水平相應上升。相反,p62 mRNA及蛋白表達水平隨濃度增加依次下降,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(F=22.786,P=0.000;F=81.208,P=0.000,見圖1)。

與0 μg/ml組相比,*P<0.05圖1 不同濃度咪喹莫特作用后LC3Ⅱ、Bclin 1和p62 mRNA及蛋白表達水平Figure 1 The mRNA and protein expression levels of LC3Ⅱ,Beclin1and p62 after treatment with imiquimod

2.2 咪喹莫特對SGC-7901細胞超微結構的影響

與對照組相比較,干預組細胞內(nèi)線粒體輕度腫脹,部分線粒體嵴溶解,粗面內(nèi)質網(wǎng)輕度擴張;細胞質內(nèi)自噬小體(AVi)常見(見圖2),自噬小體由雙層膜包繞,膜內(nèi)可見到完整的細胞器及細胞器碎片。

圖2 透射電鏡下觀察咪喹莫特處理SGC-7901細胞12 h細胞自噬情況Figure 2 Autophagy of SGC-7901 cells after treated with imiquimod for 12 h under electron microscopy

2.3 咪喹莫特誘導Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達改變

不同濃度咪喹莫特處理后各組總Akt和mTOR表達量無明顯差異,磷酸化Akt和mTOR隨劑量增加表達水平逐漸下降,其下游蛋白p70S6K表達也明顯下降。與對照組相比,聯(lián)合應用雷帕霉素組LC3Ⅱ和Beclin1表達水平明顯上升,細胞增殖活性下降(P<0.05,見圖3)。

與對照組相比,***P<0.01;與咪喹莫特組相比,###P<0.01圖3 咪喹莫特通過Akt/mTOR信號通路誘導SGC7901細胞發(fā)生自噬Figure 3 Imiquimod induced autophagy in SGC7901 cells through the Akt/mTOR signaling pathway

3 討論

胃癌是世界上排名第4位的最常見的惡性腫瘤,由于其較高的發(fā)病率及死亡率使其成為致死性腫瘤中排名第2位的惡性腫瘤[16]。多數(shù)病人尤其是老年人在發(fā)現(xiàn)時已進入中晚期,臨床治療以氟尿嘧啶或鉑類聯(lián)合化療為主,但療效欠佳。近些年,以人表皮生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子、免疫檢查點等為靶點的靶向藥物治療已成為晚期胃癌的研究熱點,雖然最大程度地提高了患者的生存率,控制了瘤組織進一步惡化,但術后復發(fā)、藥物副作用及遠期預后等整體療效仍不能令人十分滿意,因此開發(fā)及尋求新的更有效的輔助化療藥物是目前胃癌治療的新方向[17]。

大量研究表明咪喹莫特具有直接誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的作用,過度表達的Bcl-2或者抑制caspase信號途徑的活化都可以抵抗咪喹莫特誘導的細胞凋亡[9]。體外培養(yǎng)人皮膚鱗癌細胞SCL-1,150 μg/ml咪喹莫特可以明顯抑制SCL-1細胞增殖,早期凋亡比率上升,Fas基因表達上調而Bcl-2基因表達下調[18]。除此之外,咪喹莫特能夠誘導結腸癌細胞發(fā)生自噬及自噬性死亡,而凋亡相關基因未見明顯改變[19]。在對咪喹莫特抑制前列腺癌細胞增殖作用的研究中發(fā)現(xiàn),咪喹莫特通過線粒體依賴途徑誘導了TRAMP-C2細胞的直接凋亡[20]。上述研究表明咪喹莫特可以通過多種途徑影響不同類型的腫瘤細胞發(fā)生不同形式的細胞死亡。我們先前的研究發(fā)現(xiàn),采用不同濃度組咪喹莫特作用于SGC-7901細胞12～24 h,咪喹莫特對SGC-7901細胞的抑制作用呈時間及濃度依賴性[15]。100 μg/ml咪喹莫特在作用12 h時即可明顯抑制細胞增殖活性,但咪喹莫特誘導SGC-7901細胞發(fā)生的凋亡效應在藥物干預至少12 h之后,因此我們猜測咪喹莫特作用胃癌細胞早期可能先誘導發(fā)生了其他形式的死亡如Ⅱ型程序性死亡即自噬,然后進一步誘導發(fā)生細胞凋亡。

到目前為止透射電鏡被認為是鑒定自噬的金標準,本實驗通過透射電鏡觀察咪喹莫特處理12 h SGC-7901細胞超微結構的改變,結果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)存在大量囊泡性結構,在30 000倍視野下可以觀察到這些囊泡結構多為雙層膜包裹的細胞器如線粒體形成的AVi,在本階段沒有觀察到明顯的細胞凋亡形態(tài)學改變。而我們之前的研究表明,咪喹莫特處理24 h凋亡現(xiàn)象發(fā)生明顯增多,細胞皺縮、核凝聚、邊集,部分細胞可觀察到典型的凋亡小體出現(xiàn)[21]。由此可見,咪喹莫特可以同時誘導SGC-7901細胞發(fā)生凋亡和自噬,并且自噬現(xiàn)象發(fā)生早于凋亡。

除了透射電鏡外,檢測自噬相關基因的改變也是鑒定是否發(fā)生自噬的途徑之一。自噬的啟動和運行包括自噬體雙層膜結構的形成,自噬體與溶酶體的結合,自噬溶酶體的酸化、降解等過程均需要保守的自噬相關基因產(chǎn)物(Atg)的參與,LC3Ⅱ定位于自噬體內(nèi)外膜,一直結合在自噬體膜上,直到自噬體與溶酶體融合,因此LC3Ⅱ被認為是細胞內(nèi)自噬現(xiàn)象發(fā)生的標記物,LC3Ⅱ含量的多少在某種程度上反映了細胞自噬活性的強弱。Beclin1是另外一種和自噬關系密切的自噬基因,它是酵母Atg6/Vps30的同系物,在抑制腫瘤、延緩衰老、保護神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要作用,同時定位在內(nèi)質網(wǎng)上的Beclin1是誘發(fā)自噬的重要因子,Beclin1通過與Ⅲ型PI3K和UVRAG結合形成復合體調節(jié)其他Atg基因在自噬體形成中的定位,從而啟動自噬過程。本實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度咪喹莫特作用SGC-7901細胞24 h,LC3Ⅱ和Beclin1 mRNA及蛋白水平明顯上調,且隨濃度增加表達水平相應上升,而p62表達水平隨咪喹莫特濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,進而進一步證實咪喹莫特確實可以誘導胃癌細胞發(fā)生自噬。

調控自噬的信號途徑有很多種,其中Akt/mTOR信號通路是調控自噬最主要的途徑之一[22]。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中,Akt/mTOR信號通路失調是一個頻發(fā)事件,腫瘤中通常存在自噬能力下降和Akt/mTOR通路上調,因此目前針對該通路的抗腫瘤藥物也逐漸被開發(fā)出來。本實驗通過檢測Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達水平發(fā)現(xiàn),咪喹莫特可以使Akt和mTOR的磷酸化減少,其下游的信號分子p70S6激酶p70S6k表達下調,提示咪喹莫特可以負向調控該信號通路以發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用,使用mTOR選擇性的抑制劑雷帕霉素抑制該通路的活性不僅可以使SGC-7901細胞增殖活性進一步下降,而且可以促進自噬相關蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達上調,提示Akt/mTOR信號通路介導了咪喹莫特誘導的細胞自噬及自噬性死亡。

綜上所述,咪喹莫特可以誘導SGC-7901細胞發(fā)生自噬,其機制是部分抑制Akt/mTOR信號通路,激活自噬相關蛋白表達及自噬體的形成,從而達到抑制胃癌細胞生長的作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程錯綜復雜,單一環(huán)節(jié)的治療效果有限,復合治療具有更明顯的優(yōu)勢,TLRs激動劑具有用量小、副作用少,與多種化療藥物合用有助于減輕用藥負擔,增加藥物療效,因此TLRs激動劑在基礎研究和臨床應用中都具有一定的潛在開發(fā)意義[23]。本研究在以往科研工作基礎上進一步探討了TLR7激動劑咪喹莫特抑制人胃癌細胞發(fā)生發(fā)展的分子機制,為日后進一步深入的研究奠定了理論基礎,同時為胃癌的治療提供了可能的新方向。