歐陽(yáng)愛(ài)國(guó)，劉曉龍，李斌，林同征，劉燕德，黃敏，宋燁

1.華東交通大學(xué)智能機(jī)電裝備創(chuàng)新研究院， 南昌 330013； 2. 江南大學(xué)輕工過(guò)程先進(jìn)控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122； 3.濟(jì)南果品研究院， 濟(jì)南 250000

柑橘是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。目前，柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到各種病害的侵襲和威脅，其中，柑橘黃龍病是柑橘生產(chǎn)中威脅最大的毀滅性病害[2]。柑橘黃龍病的發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為患病植株長(zhǎng)勢(shì)衰退，抽梢短而小，樹(shù)葉出現(xiàn)斑駁性黃化和整體黃化枯萎，柑橘植株果實(shí)變小且果柄端橘紅色，其余部分青色，俗稱(chēng)紅鼻子果[3-4]。對(duì)發(fā)病輕的柑橘果樹(shù)，挖除病株后可采用無(wú)病苗補(bǔ)植，然后加強(qiáng)對(duì)黃龍病的監(jiān)測(cè)和防治；當(dāng)柑橘黃龍病發(fā)生的范圍很廣時(shí)，應(yīng)將全園的苗木都挖掉，重新栽種未受該病影響的苗木。找到一種快速、有效、無(wú)損的柑橘葉片黃龍病檢測(cè)方法，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

柑橘黃龍病的傳統(tǒng)診斷方法主要有田間癥狀診斷法、電鏡觀察法以及PCR檢測(cè)法等[4-6]。由于黃龍病癥狀非常復(fù)雜，上述檢測(cè)方法在對(duì)柑橘黃龍病檢測(cè)中都存在不足之處。其中，田間癥狀診斷法的缺點(diǎn)是主觀性較強(qiáng)，準(zhǔn)確率不高[6-7]；病菌分布大小不均勻和采集方法不正確會(huì)導(dǎo)致電鏡觀察法準(zhǔn)確率不高[7]；血清學(xué)檢測(cè)法抗體的制備技術(shù)復(fù)雜以及檢測(cè)范圍較窄[8]；PCR檢測(cè)則成本較高，不適合用于大田果園批量檢測(cè)[9]。為此，研究人員嘗試采用無(wú)損檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)或及時(shí)發(fā)現(xiàn)病樹(shù)，如王凡等[10]利用高光譜技術(shù)對(duì)黃龍病進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)病害進(jìn)行了分類(lèi)；劉燕德等[11]采用近紅外光譜對(duì)感染黃龍病的柑橘葉片、缺素葉片及健康葉片等樣品進(jìn)行了分析。但高光譜和近紅外存在圖譜結(jié)合比較復(fù)雜、測(cè)定精度不高等缺點(diǎn)。激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)(laser-induced breakdown spectroscopy,LIBS)[12]能夠檢測(cè)試驗(yàn)樣品中元素的光譜強(qiáng)度，可以用于農(nóng)業(yè)研究。如章琳穎等[13]運(yùn)用九點(diǎn)平滑(SM)結(jié)合多元散射校正(MSC)對(duì)臍橙果汁進(jìn)行LIBS數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后采用主成分分析(PCA)結(jié)合多層感知器神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(MLP)和徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(RBF)模型對(duì)健康和感染黃龍病的臍橙進(jìn)行快速判別。劉燕德等[14]采用MSC光譜預(yù)處理方法和PCA分類(lèi)法，并建立三維模型分析，可以很好地將感染炭疽病的油茶葉片和健康油茶葉片區(qū)分開(kāi)來(lái)，建立的PLS-DA模型的識(shí)別率為90%。

LIBS在植物病害檢測(cè)中具有比較簡(jiǎn)單、方便、新穎和突出等特點(diǎn)，目前有關(guān)LIBS應(yīng)用于柑橘葉片病害檢測(cè)的研究報(bào)道不多。柑橘葉片的生長(zhǎng)情況可直接反映柑橘果樹(shù)及整個(gè)種植區(qū)柑橘果實(shí)的健康程度。本研究基于健康柑橘葉片和感染黃龍病柑橘葉片的LIBS及其光譜響應(yīng)，建立基于LIBS的柑橘葉片黃龍病檢測(cè)方法，旨在進(jìn)一步擴(kuò)展LIBS的應(yīng)用范圍，并為柑橘葉片營(yíng)養(yǎng)元素的檢測(cè)提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

1)樣品采集。2020年10月在江西省贛州市的果園采集柑橘的健康葉片、中度感染黃龍病的葉片和重度感染黃龍病的葉片各100片。將摘取到的鮮葉放入保鮮袋中保存，并將冰袋放入其中保證柑橘葉片的新鮮度。

2)樣品制備。采用去離子水反復(fù)沖洗葉片表面，去除柑橘葉片表面上灰塵和泥垢；再用吸水紙擦拭，在通風(fēng)處放置2 h，讓其自然晾干，以減少水珠對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。最后裝袋并分類(lèi)標(biāo)號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

本研究采用的LIBS試驗(yàn)設(shè)備為MX2500+(海洋光學(xué))，其系統(tǒng)原理圖如圖1所示。Nd：YAG激光器在納秒量級(jí)的范圍內(nèi)激發(fā)出能量較高、脈寬較大的激光，經(jīng)反射后由透鏡聚焦到柑橘葉片表面，然后擊打葉片表面產(chǎn)生等離子體。由光纖收集后傳輸?shù)?通道多譜儀。通過(guò)MX2500+所配套的MaxLIBS軟件對(duì)元素的波長(zhǎng)和光譜強(qiáng)度進(jìn)行采集。

圖1 LIBS系統(tǒng)原理圖Fig.1 A schematic diagram of LIBS system

激光能量設(shè)置為50 mJ，光譜儀的波長(zhǎng)范圍為198.71～727.69 nm，光學(xué)分辨率0.1 nm，延遲時(shí)間設(shè)定為2 μs。在采集過(guò)程中，每個(gè)葉片樣品重復(fù)采集6個(gè)LIBS光譜數(shù)據(jù)，這樣可以涉及葉片的不同部位。再將采集到的6個(gè)LIBS光譜數(shù)據(jù)的平均值作為試驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，目的是為了減小誤差和樣品的不平整性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)預(yù)處理的目的在于除去數(shù)據(jù)中含有的噪音和無(wú)用的信息，如激光器激光能量的波動(dòng)、光譜儀分辨率的差異、外部環(huán)境的差異以及樣品不均勻等因素，提高建立模型的預(yù)測(cè)精度，增強(qiáng)建立模型的穩(wěn)健性[14]。本研究采用歸一化(normalization)、多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(standard normal variate,SNV)和正交信號(hào)校正(orthogonal signal correction,OSC)4種光譜預(yù)處理方法[15]。

偏最小二乘是最常用的多元線(xiàn)性校正技術(shù)，可以同時(shí)分解光譜矩陣X和濃度矩陣Y，消除無(wú)用的噪聲信息，使其在實(shí)際應(yīng)用中具有更強(qiáng)的魯棒性[16]。模型公式如下：

Y=bX+e

(1)

式(1)中，b表示回歸系數(shù)的向量，e表示模型殘差。

根據(jù)NIST的標(biāo)準(zhǔn)原子光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)選光譜P(Ⅱ)645.999 nm，Mn(Ⅰ)279.483 nm，Mn(Ⅰ)280.379 nm，Si(Ⅰ)251.432 nm和Fe(Ⅰ)252.285 nm這5條LIBS光譜作為分析感染黃龍病柑橘葉片的譜線(xiàn)。這些微量元素與柑橘葉片組織密切相關(guān)，即能區(qū)分柑橘葉片是否健康。采用Unscrambler10.1軟件中的Normalization、MSC、SNV和OSC 4種預(yù)處理方法和偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)對(duì)LIBS光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片LIBS光譜特征分析

P(Ⅱ)的LIBS特征光譜如圖2所示。由圖2可知，P(Ⅱ)的特征光譜在波長(zhǎng)645.999 nm處，健康柑橘葉片的P(Ⅱ)特征光譜強(qiáng)度明顯高于感染黃龍病的柑橘葉片，并且健康柑橘葉片、中度感染黃龍病的柑橘葉片和重度感染黃龍病的葉片的P(Ⅱ)特征光譜強(qiáng)度呈線(xiàn)性下降。P有利于植物的新陳代謝，能使葉片變得更加耐旱和耐寒。如果柑橘葉片中的P含量較低，就會(huì)影響植物的新陳代謝。

圖2 柑橘葉片在644～650 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)P(Ⅱ)的LIBS光譜Fig.2 P(Ⅱ) LIBS spectra of citrus leaves in the wavelength range of 644-650 nm

Mn(Ⅰ)的LIBS特征光譜如圖3所示。由圖3可知，Mn(Ⅰ)的特征光譜譜線(xiàn)在279.483 nm和280.379 nm處?？梢园l(fā)現(xiàn)感染黃龍病柑橘葉片中Mn(Ⅰ)的特征光譜強(qiáng)度明顯低于健康柑橘葉片中的Mn(Ⅰ)的特征光譜強(qiáng)度。原因是Mn是維持葉綠體結(jié)構(gòu)必不可少的微量元素。當(dāng)葉片非常缺乏Mn時(shí)，葉脈間會(huì)逐漸出現(xiàn)黃化。

Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的LIBS特征光譜如圖4所示。由圖4可知，Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)在波長(zhǎng)251.432 nm和252.285 nm處有明顯的特征峰，通過(guò)對(duì)比圖4中的強(qiáng)度值，健康柑橘葉片中Si(Ⅰ)的特征光譜強(qiáng)度明顯高于感染黃龍病柑橘葉片中Si(Ⅰ)的特征峰。Si在植物生長(zhǎng)中扮演著重要的角色，并且能抵抗攻擊植物的病原體。健康柑橘葉片中高含量的Si對(duì)抗病原體有著很重要的作用；但感染黃龍病的柑橘葉片中Si含量較低，是因?yàn)槭艿搅它S龍病的危害。此外，健康柑橘葉片中Fe(Ⅰ)的特征光譜強(qiáng)度要比感染黃龍病柑橘葉片中Fe(Ⅰ)的特征光譜強(qiáng)度高，原因是Fe是形成葉綠素不可或缺的微量元素之一，健康柑橘葉片中含有的大量Fe參與氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)氮素代謝，并且能增強(qiáng)植株的抗原體，而感染黃龍病的柑橘葉片的表面上出現(xiàn)病斑且病斑周?chē)实S色，出現(xiàn)缺鐵變黃的癥狀。

圖3 柑橘葉片在278～281 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)Mn(Ⅰ)的LIBS光譜Fig.3 LIBS spectra of Mn(Ⅰ)in citrus leaves in the wavelength range of 278-281 nm

圖4 柑橘葉片在250～254 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi) Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的LIBS光譜Fig.4 LIBS spectra of Si(Ⅰ)and Fe(Ⅰ)in the wavelength range of 250-254 nm in citrus leaves

綜上，感染黃龍病的柑橘葉片中P(Ⅱ)、Mn(Ⅰ)、Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的特征光譜強(qiáng)度顯著低于健康柑橘葉片中P(Ⅱ)、Mn(Ⅰ)、Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的特征光譜強(qiáng)度。而且柑橘葉片中的P、Mn、Si和Fe的LIBS信號(hào)強(qiáng)度與葉片的健康狀態(tài)有著很強(qiáng)的相關(guān)性，LIBS信號(hào)強(qiáng)度隨著葉片的病害加重而逐漸減弱。因此，選用P(Ⅱ)645.999 nm、Mn(Ⅰ)279.483 nm、Mn(Ⅰ)280.379 nm、Si(Ⅰ)251.432 nm和Fe(Ⅰ)252.285 nm等5條LIBS特征光譜對(duì)健康、中度感染和重度感染黃龍病的柑橘葉片等3種情形進(jìn)行分析。

2.2 單個(gè)特征光譜和特征光譜融合的PLS-DA

使用300個(gè)樣本用于建立偏最小二乘判別模型，其中健康柑橘葉片、中度感染黃龍病和重度感染黃龍病的柑橘葉片分別為100片。首先人為設(shè)定健康柑橘葉片樣品為1，感染中度黃龍病的柑橘葉片為2，感染重度黃龍病的柑橘葉片為3。若預(yù)測(cè)值介于0.5和1.5之間則判定為健康柑橘葉片，若預(yù)測(cè)值介于1.5和2.5之間則判定為中度感染黃龍病的柑橘葉片，若預(yù)測(cè)值介于2.5和3.5之間則判定為是重度感染黃龍病的柑橘葉片。然后將300個(gè)柑橘葉片樣本按照3∶1的比例隨機(jī)分為建模集(225個(gè)樣本)和預(yù)測(cè)集(75個(gè)樣本)。

從表1中可知，在沒(méi)有預(yù)處理的情況下，當(dāng)5個(gè)特征光譜單獨(dú)用PLS-DA建模分析時(shí)， Fe(Ⅰ)的建模集均方根誤差(root mean square error of calibration,RMSEC)為0.394，建模集相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient of calibration,Rc)為0.871，總誤判率為23.1%；預(yù)測(cè)集均方根誤差(root mean square error of prediction,RMSEP)為0.454，預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient of prediction,Rp)為0.841，總誤判率為26.6%。將5條特征光譜進(jìn)行光譜融合，可以看到建模效果有所提高，模型的RMSEC為0.341，Rc為0.905，總誤判率為15.5%，RMSEP為0.395，Rp為0.867，總誤判率為22.7%。圖5為元素Fe(Ⅰ)特征光譜的建模模型結(jié)果，圖6 為5種特征光譜融合的建模模型結(jié)果。

表1 單個(gè)特征光譜和5個(gè)特征光譜融合的PLS-DA模型結(jié)果 Table 1 The results of PLS-DA model combining single feature spectra and five feature spectra

A:建模集 Modeling set; B:預(yù)測(cè)集 Prediction set； H:健康的柑橘葉片 Citrus leaf of healthy; MI：中度感染黃龍病的柑橘葉片 Citrus leaf moderately infected with Huanglongbing; SI：重度感染黃龍病的柑橘葉片Citrus leaf severely infected with Huanglongbing。下同 The same as below.

A:建模集 Modeling set; B:預(yù)測(cè)集模型 Prediction set.圖6 5個(gè)特征光譜融合的PLS-DAFig.6 PLS-DA model for the fusion of five feature spectra

2.3 基于不同預(yù)處理方法的PLS-DA

5個(gè)特征光譜融合之后，根據(jù)3∶1比例劃分好的建模集和預(yù)測(cè)集建立柑橘葉片的PLS模型，并使用4種預(yù)處理方法(Normalization、MSC、SNV、OSC)對(duì)光譜進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)表2。由于OSC是通過(guò)正交投影除去光譜陣中無(wú)關(guān)的信息，再進(jìn)行多元校正運(yùn)算，以達(dá)到簡(jiǎn)化模型以及提高模型預(yù)測(cè)能力的目的。因此，選取OSC預(yù)處理后，所建立的模型最佳，其中RMSEC為0.027，Rc為0.994，總誤判率為0；RMSEP為0.023，Rp為0.995，總誤判率為0。圖7為結(jié)合預(yù)處理后最優(yōu)的PLS-DA模型。

表2 不同預(yù)處理方法的PLS-DA模型結(jié)果 Table 2 PLS-DA model results of different pretreatment method

A:建模集 Modeling set; B:預(yù)測(cè)集 Prediction set.圖7 OSC預(yù)處理后的PLS-DAFig.7 PLS-DA model after OSC pretreatment

3 討 論

營(yíng)養(yǎng)元素的變化作為判別植物是否染病的重要指標(biāo)之一，對(duì)早期柑橘黃龍病的檢測(cè)具有重要的意義。本研究分析了柑橘葉片中P(Ⅱ)、Mn(Ⅰ)、Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)元素的LIBS光譜特征，發(fā)現(xiàn)這4種元素的LIBS信號(hào)特征光譜的強(qiáng)度與柑橘葉片是否感染黃龍病有關(guān)，隨著柑橘葉片感染黃龍病的程度加重，LIBS信號(hào)特征光譜的強(qiáng)度逐漸降低。另外，F(xiàn)e(Ⅰ)的特征光譜用PLS-DA建模判別，建模集的誤判率為23.1%，預(yù)測(cè)集的誤判率為26.6%；將5條特征光譜融合在一起用PLS-DA建模判別，建模集的誤判率為15.5%，預(yù)測(cè)集的誤判率為22.7%。進(jìn)一步利用OSC預(yù)處理方法并用PLS-DA建模方法進(jìn)行建模判別，模型的識(shí)別率能達(dá)到100%，可以較好地區(qū)分健康柑橘葉片、中度感染黃龍病的柑橘葉片和重度感染黃龍病的柑橘葉片這3種狀態(tài)，并且RMSEC、RMSEP均有所降低，Rc和Rp均有所提高，說(shuō)明模型經(jīng)過(guò)預(yù)處理優(yōu)化后剔除了大量噪聲信息，從而提高了模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。研究顯示，采用激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)結(jié)合OSC光譜預(yù)處理、PLS-DA建模方法識(shí)別柑橘葉片黃龍病具有一定可行性。后續(xù)研究可以將葉片中的其他營(yíng)養(yǎng)元素、其他病害用于實(shí)驗(yàn)分析，并與黃龍病病害進(jìn)行對(duì)比分析，并改進(jìn)預(yù)處理方法、波段篩選的方法以及建模方法來(lái)進(jìn)一步提高模型的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和適用性。