謝正林，吳夢(mèng)雅，許俊齊，趙婉寧，代升飛

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2.江蘇農(nóng)林檢測(cè)中心，江蘇 句容 212400）

近年來，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量日益提升，在消耗大量栽培原料的同時(shí)，菌渣產(chǎn)量也不斷增加。面對(duì)大量菌渣的產(chǎn)生，為避免環(huán)境污染，提高生態(tài)效益，推動(dòng)綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，菌渣高效循環(huán)利用產(chǎn)業(yè)化也初見雛形。

食用菌菌渣作為優(yōu)質(zhì)資源在農(nóng)作物種植、園藝作物栽培基質(zhì)、養(yǎng)殖飼料等產(chǎn)業(yè)上發(fā)揮著不小作用。菌渣主要是棉子殼、玉米芯、木屑等一些作物秸稈，在經(jīng)過菌絲降解后，農(nóng)藥殘留一部分會(huì)轉(zhuǎn)移到食用菌中，大部分還會(huì)殘留在菌渣中。目前，面對(duì)食品安全，人們大部分注意力放在食用菌農(nóng)殘的檢測(cè)上，而對(duì)于食用菌菌渣安全利用，關(guān)注度不夠。因而，建立一種安全有效的菌渣農(nóng)殘檢測(cè)，分析菌渣中農(nóng)藥殘留成分，防控菌渣中農(nóng)藥殘留進(jìn)一步轉(zhuǎn)移，對(duì)菌渣資源化安全循環(huán)利用有重要意義。為此，本研究基于氣相色譜法檢測(cè)農(nóng)藥殘留的基礎(chǔ)上，探討菌渣中9 種農(nóng)藥多殘留：乙烯菌核利、三唑酮、腐霉利、異菌脲、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氟氨氰菊酯的檢測(cè)方法，以期為菌渣資源化利用過程中安全使用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

氣相色譜儀（Agilent 7890A，配ECD 檢測(cè)器）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：sigma G-26C 最大轉(zhuǎn)速，26 000 轉(zhuǎn)·min（賽多利斯）；電子天平：ME204E/02（梅特勒上海有限公司）；漩渦混合器：Mixplus（艾本森）；超聲波儀：SB25-12DTD（寧波新芝）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA（上海亞榮公司）；全自動(dòng)平行濃縮儀：AutoEVA-60（廈門?？乒荆?；分散機(jī)：IKAT10（德國IKA 公司）；磨粉機(jī)：SS-1022（圣順機(jī)械）；離心管、移液器以及其它實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備等。

1.2 試劑、耗材

乙腈、丙酮、正己烷：HPLC 級(jí)德國默克公司；固相萃取柱：弗羅里矽柱（Florisil），容積6 mL，填充物1 000 mg；濾膜：0.2 μm，有機(jī)溶劑膜，鋁箔；菌渣：秀珍菇菌渣，由江蘇農(nóng)林食用菌教學(xué)工場(chǎng)提供；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品采購于天津阿爾塔科技有限公司，濃度均為1 000 mg·mL。

1.3 儀器條件

色譜柱：Agilent 色譜柱HP-5MS（30 m×0.250 mm×0.25 mm-60～325 ℃）；柱流量：1.0 mL·min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氮?dú)饧兌取?9.99%；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；升溫程序：150℃保持0.5 min，10 ℃·min升至260 ℃保持5 min，25 ℃·min升至300 ℃，保持12 min。

1.4 樣品前處理

1.4.1 試樣的制備與保存 取新鮮菌渣，高速勻漿，放入離心管中，于-20～-18 ℃條件下保存，備用。

1.4.2 試樣前處理 參考NY/T 761-2008 標(biāo)準(zhǔn)：準(zhǔn)確稱取25.0 g 菌渣置離心管中，移取50.0 mL 乙腈，高速振蕩2 min 后，超聲提取，濾液收集到裝有7 g NaCl 的具塞量筒中，收集濾液40～50 mL，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，在室溫下靜置，使乙腈相和水相分層。

濃縮：吸取10.00 mL 上清液置于試管中，將試管插入全自動(dòng)平行濃縮儀，50 ℃氮吹至近干，用2.0 mL 正己烷復(fù)溶，密封，待凈化。

凈化：將萃取柱依次用5.0 mL 丙酮+正己烷（1∶9，V/V）、5.0 mL 正己烷潤洗活化，隨后立即倒入待凈化液，收集過濾液，用5.0 mL 丙酮+正己烷（1∶9，V/V）沖洗萃取柱，并重復(fù)1 次。收集的過濾液置于全自動(dòng)平行濃縮儀上，50 ℃氮吹至4 mL，用正己烷定容至5.0 mL，混勻，移入儀器進(jìn)樣品瓶中，待測(cè)。

1.5 菌渣中9 種農(nóng)藥多殘留提取條件優(yōu)化

在前期檢測(cè)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別設(shè)定超聲時(shí)間、靜置時(shí)間、氮吹時(shí)間范圍對(duì)農(nóng)殘回收率和精密度的具體影響，具體水平詳見表1，以回收率和精密度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在其它條件相同的情況下，重復(fù)3 次前處理提取回收，每次做3 個(gè)平行。

表1 提取條件優(yōu)化試驗(yàn)因素水平

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 準(zhǔn)確移取乙烯菌核利、三唑酮、腐霉利、異菌脲、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氟氨氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶解配制成40 mg·L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于0～4 ℃保存。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 外標(biāo)法：分別將9 種農(nóng)藥儲(chǔ)備液配制成0.001，0.002，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1 mg·L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 檢出限和定量限

1.7.1 檢出限 9 種農(nóng)藥組分添加濃度為0.001 mg·kg的樣品的信噪比，根據(jù)式（1）可計(jì)算得檢出限。

1.7.2 定量限 9 種農(nóng)藥組分添加濃度為0.001 mg·kg的樣品的信噪比，根據(jù)式（2）可計(jì)算得定量限。

1.8 方法能力驗(yàn)證試驗(yàn)

取不含本底的菌渣樣品共18 份，按照優(yōu)化提取方法進(jìn)行高中低3 濃度添加回收試驗(yàn)，測(cè)定出9 種農(nóng)藥組分的含量，以峰面積分別計(jì)算9 種農(nóng)藥組分在不同添加水平的回收率，分別計(jì)算9 種農(nóng)藥組分平均添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間對(duì)回收率和精密度影響

超聲波高頻振動(dòng)可以使菌渣基質(zhì)中的農(nóng)藥和提取液充分接觸，利于提高回收率。由表2 可知，各試驗(yàn)在超聲10 min 后，回收率基本變化小，且與其他組相比，差異不顯著，考慮到試驗(yàn)成本和效率，選擇超聲時(shí)間控制在10 min 最佳。

表2 超聲時(shí)間對(duì)回收率和精密度影響

2.2 靜置時(shí)間對(duì)回收率和精密度影響

由表3 可知，隨著靜置時(shí)間推移，9 種農(nóng)藥組分回收率也逐漸增加，但超過10 min 后，回收率增加并不明顯。當(dāng)靜置15 min 時(shí)，雖然回收率達(dá)到最高96.2%，但是精密度為4.34%～16.7%，，提取率雖達(dá)到檢測(cè)要求，但精密度超過了10%，故不選擇為最佳靜置時(shí)間。當(dāng)靜置20 min 后，提取率在77.2%～94.4%，精密度在控制在10%以下，達(dá)到檢測(cè)要求，綜合以上，選擇靜置時(shí)間控制在20 min 時(shí)最佳。

表3 靜置時(shí)間對(duì)回收率和精密度的影響

2.3 氮吹時(shí)間對(duì)回收率和精密度影響

氮吹濃縮時(shí)間對(duì)農(nóng)藥回收率有至關(guān)重要，由表4 可知，隨著時(shí)間推移，回收率逐漸提高，當(dāng)?shù)档?9 min 時(shí)，回收率達(dá)到最高94.4%，精密度在3.45%～7.42%之間，符合既定的檢測(cè)要求，隨著氮吹濃縮時(shí)間進(jìn)一步延長，回收率隨之減低，故認(rèn)為氮吹時(shí)間控制在29 min 時(shí)最佳。

表4 氮吹時(shí)間對(duì)回收率和精密度的影響

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

在優(yōu)化后的試驗(yàn)條件下，根據(jù)峰面積對(duì)9 種農(nóng)藥的相應(yīng)濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定其線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，詳見表5，其相關(guān)系數(shù)均＞0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好。

表5 9 種農(nóng)藥線形回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.5 檢出限和定量限

由表6 可知，菌渣9 種農(nóng)藥的檢出限和定量限均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)要求，且均低于標(biāo)準(zhǔn)檢出限，可滿足實(shí)際樣品的測(cè)定。由表7 可知，在截取0.5～0.6 min范圍內(nèi)，9 種農(nóng)藥組分的信噪比均大于3，達(dá)到儀器可檢出要求。

表6 9 種農(nóng)藥組分的檢出限和定量限

表7 9 種農(nóng)藥組分的信噪比

2.6 方法能力驗(yàn)證

取不含本底的菌渣樣品共18 份，進(jìn)行3 檔濃度添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度6 個(gè)平行。按優(yōu)化好的試驗(yàn)方法先分別測(cè)定出的9 種農(nóng)藥含量，以峰面積計(jì)算9 種農(nóng)藥在不同添加水平的回收率，計(jì)算9 種農(nóng)藥組分平均添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（表8），樣品中各組分的平均加標(biāo)回收率范圍控制在76.5%～112.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是1.60%～11.9%，符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

表8 樣品回收率及精密度（n=6）

2.7 方法應(yīng)用

2.7.1 空白樣品農(nóng)藥殘留測(cè)定 空白樣品譜圖見圖1，圖中可知空白中未出現(xiàn)9 種待測(cè)農(nóng)藥。由圖2 可知，9 種農(nóng)藥色譜圖如下，各農(nóng)藥峰形較好，響應(yīng)值較高。因此，可利用優(yōu)化好的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行農(nóng)藥提取，并進(jìn)行檢測(cè)。2.7.2 菌渣樣品農(nóng)藥殘留量測(cè)定 按照優(yōu)化好提取的方法，對(duì)菌渣樣品進(jìn)行農(nóng)藥殘留提取及測(cè)定。用于定量的標(biāo)樣濃度為0.01 mg·L，質(zhì)控回收樣添加濃度為0.05 mg·kg，加標(biāo)樣品平行2 次，待測(cè)菌渣樣品平行2 次。采用2.3 所述中的儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表8。由表8 可知，空白樣均未檢出目標(biāo)農(nóng)藥，9 種農(nóng)藥加標(biāo)樣平均回收率為94.0%～104.2%，RSD 值為0.206%～8.71%，說明檢測(cè)方法與檢測(cè)能力均可達(dá)到檢測(cè)要求。菌渣樣品中乙烯菌核利、三唑酮、甲氰菊酯、氟氨氰菊酯4 種農(nóng)藥未檢出，但腐霉利、異菌脲、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氟氰戊菊酯5 種農(nóng)藥有檢出，平均含量分別為：3.535，0.278，0.428，0.129，0.134 mg·kg。

圖1 空白樣品色譜圖

表8 菌渣樣品檢測(cè)結(jié)果

圖2 9 種農(nóng)藥氣相色譜圖

3 結(jié)論與討論

本研究建立了測(cè)定菌渣中9 農(nóng)藥多殘留量的方法，反復(fù)試驗(yàn)確定前處理最佳提取條件為，超聲時(shí)間10 min、靜置時(shí)間20 min、氮吹時(shí)間29 min。

通過前處理和儀器檢測(cè)方法確定9 種農(nóng)藥組分檢出限分別為：乙烯菌核利0.140 μg·kg、三唑酮0.069 μg·kg、腐霉利0.048 μg·kg、異菌脲0.417 μg·kg、甲氰菊酯0.085 μg·kg、高效氯氟氰菊酯0.732 μg·kg、氟氯氰菊酯0.133 μg·kg、氟氰戊菊酯0.055 μg·kg、氟氨氰菊酯0.349 μg·kg；經(jīng)過低、中、高多次方法驗(yàn)證試驗(yàn)表明，樣品中9 種農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率范圍控制為76.5%～112.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.60%～11.9%，均符合檢測(cè)要求，具備檢測(cè)菌渣未知樣能力。對(duì)未知菌渣樣的檢測(cè)結(jié)果表明：菌渣9 種農(nóng)藥殘留未檢出4 種，檢出5 種，且5 種檢出農(nóng)藥殘留的含量均小于限定值，表明菌渣的安全利用較為樂觀。

本研究建立了菌渣中農(nóng)藥多殘留量檢測(cè)方法，且該方法具有前處理簡便、操作可控性高、儀器設(shè)備需求小、靈敏度高、檢測(cè)準(zhǔn)確，且安全等特點(diǎn)，對(duì)于食用菌產(chǎn)業(yè)中菌渣高效循環(huán)利用具有重要意義。