馬 帥，鄭世磊，趙 明，王 媛，張嚴(yán)琦，邴啟政，段笑笑，曹 志

（1.青島市動物疫病預(yù)防控制中心，青島 266100；2.青島易邦生物工程有限公司，青島 266114；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109）

豬瘟（Classical swine fever, CSF）也稱豬霍亂，是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起的豬和野豬的一種高度接觸性、高致死性傳染病，一年四季均可發(fā)生[1]。豬瘟是世界動物衛(wèi)生組織（Office international des épizooties, OIE）疫病名錄中須申報的陸生動物疫病。雖然通過嚴(yán)格的凈化措施，美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭和荷蘭等部分養(yǎng)豬國家已宣布消滅了豬瘟，但對于其他大多數(shù)養(yǎng)豬國家（如東歐、東亞及東南亞許多國家），豬瘟仍然是對養(yǎng)豬業(yè)危害較大的重要傳染病[2]。由于全國范圍的豬瘟疫苗接種政策，目前我國豬瘟疫情已得到較好的控制，大規(guī)模豬瘟疫情較少發(fā)生，但部分地區(qū)疫情仍呈點(diǎn)狀散發(fā)或地方性流行，非典型和繁殖障礙型豬瘟增多，成年豬帶毒現(xiàn)象嚴(yán)重[3]。尤其是一些中小型養(yǎng)殖場仍然存在病毒污染，控制和凈化工作仍然面臨不少困難和挑戰(zhàn)[4]。為最終控制和凈化豬瘟，我國應(yīng)持續(xù)強(qiáng)化生物安全措施，繼續(xù)對生豬實(shí)施豬瘟免疫，利用高效可靠的診斷技術(shù)對疑似病例進(jìn)行確診并剔除陽性患病豬。本文對我國豬瘟的分子生物學(xué)特征及豬瘟疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 豬瘟病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展

1.1 豬瘟病毒的結(jié)構(gòu)與功能CSFV是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科、瘟病毒屬。CSFV粒子直徑為40～60 nm，近似球形，由三種結(jié)構(gòu)脂蛋白囊膜包裹，表面有不規(guī)則形狀的纖突，其基因組大小為12.3 kb，由中間的開放閱讀框（opening reading frame, ORF）及兩側(cè)的5'和3'非翻譯區(qū)（Untranslated Regions, UTR）構(gòu)成，其ORF能夠編碼3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白前體；多聚蛋白在宿主細(xì)胞和病毒自身特異性蛋白酶作用下裂解成12個成熟的蛋白，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、E1、E2）和8種非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[3]。在編碼的結(jié)構(gòu)蛋白中，C蛋白為衣殼蛋白，具有保護(hù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，并包含Erns的信號序列和信號肽識別位點(diǎn)[5]。Erns和E2蛋白均為囊膜糖蛋白，兩者集中了CSFV的大部分抗原表位，其中E2蛋白保守性最低，是CSFV的主要保護(hù)抗原[6]。在非結(jié)構(gòu)蛋白中，Npro蛋白是CSFV ORF編碼的第一個蛋白質(zhì)，具有水解酶活性，其對于病毒的復(fù)制并非必不可少，但在CSFV的免疫逃避中發(fā)揮重要作用[7]。p7蛋白作為離子通道蛋白參與病毒的毒力，并且介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IL-1β的釋放[8]；其余蛋白均與病毒RNA復(fù)制相關(guān)，NS2蛋白的功能是調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，NS3、NS4A、NS4B、NS5A可以形成復(fù)制復(fù)合體，NS5B則具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，它們共同參與CSFV的復(fù)制過程[9]?；蚪M的5'-UTR和3'-UTR與CSFV的復(fù)制有關(guān)，但5'-UTR沒有甲基化帽子結(jié)構(gòu)，3'-UTR也沒有Poly（A）結(jié)構(gòu)，因此其與一般真核生物的翻譯起始機(jī)制不同[10]。CSFV的翻譯是通過5'-UTR內(nèi)核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site, IRES）與核糖體40S亞基的結(jié)合而啟動；而3'-UTR主要介導(dǎo)CSFV基因組的復(fù)制，RNA聚合酶通過結(jié)合在3'-UTR上而激發(fā)RNA的合成[11]。5'-UTR和3'-UTR都是CSFV基因組復(fù)制的主要調(diào)控位點(diǎn)，并且在屬內(nèi)高度保守。

1.2 豬瘟病毒的基因分型及全球地理分布通過對豬瘟流行毒株基因群和基因亞群進(jìn)行劃分，研究不同地區(qū)流行株間的親緣關(guān)系和遺傳進(jìn)化規(guī)律，對掌握病毒流行現(xiàn)狀、追溯傳播來源和傳播路徑具有重要科學(xué)意義。據(jù)文獻(xiàn)報道，目前常將5'-UTR、E1、E2、NS2、NS3、NS5B和3'-UTR等基因片段用于CSFV基因分型，其中5'-NTR、E2和NS5B 最為常用[12]?；?'-UTR中的150 nt堿基序列，E2蛋白中的190 nt堿基序列和NS5B蛋白中的409 nt堿基序列，通過序列比對分析可將CSFV分為3個基因型（1型、2型和3型）和11個亞型（1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3和3.4），2.1亞型又可進(jìn)一步分為2.1a、2.1b、2.1c和2.1d亞型[13]。全球范圍內(nèi)，所有分離自美洲的CSFV都屬于基因1型，其中古巴分離株主要為1.2亞型，而洪都拉斯和危地馬拉的分離株主要為1.3亞型，阿根廷、巴西、哥倫比亞和墨西哥的分離株在1.1亞型中產(chǎn)生了四個分辨率較差的簇。另有研究表明，古巴分離株與其他已知的CSFV基因1型分離株之間存在較大差異，并形成一個新的亞型，故將其命名為1.4亞型[3]。表1顯示了豬瘟病毒各基因亞型的全球分布?；?型主要由20世紀(jì)80～90年代歐洲的分離毒株組成，能夠引起流行性感染且病死率較高，為過去幾十年普遍流行的基因型。基因3型包括大多數(shù)分布于不同程度的天然隔離區(qū)域，如韓國、泰國、日本、和英聯(lián)邦等地區(qū)的毒株。近年來，從遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，在歐洲和亞洲的CSFV流行正從1型和3型向2型轉(zhuǎn)換[14-16]。

表1 豬瘟病毒基因型的全球分布Table 1 Global distribution of CSFV subgenotypes

1.3 我國豬瘟病毒的分子流行病學(xué)分析我國開展CSFV分子流行病學(xué)研究工作起步較晚，但在解放軍軍需大學(xué)、蘭州獸醫(yī)研究所等科研單位不懈努力下，我國CSFV遺傳發(fā)生關(guān)系及流行態(tài)勢日漸清晰。我國CSFV的分群研究大部分是基于E2、E0基因序列。1990年代，涂長春[17]通過對全國191株CSFV流行株的E2基因序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)我國CSFV分為2個基因型，4個基因亞型，即基因2型中的2.1、2.2、2.3亞型和基因1型中的1.1亞型。近期研究表明，自21世紀(jì)初以后2.2和2.3亞型的流行優(yōu)勢逐漸減弱。目前2.1亞型為我國流行的亞型，其中2.1b亞亞型已成為流行的優(yōu)勢毒株[18]，2.1c亞亞型主要在我國南方流行[13]。Jiang等[19]對2011-2012年在湖南分離的8個流行毒株進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)5個分離株與廣東、廣西分離株一起形成了2.1亞型的一個進(jìn)化分支，形成該新分支的分離株被稱為2.1c亞亞型，而2.1c亞亞型在泰國和老撾也有分布。彭志成等[20]將2011年從廣東分離的15個2.1亞型毒株進(jìn)一步分為2.1b、2.1c和2.1d三種亞亞型，而且2.1c亞亞型和2.1d亞亞型的流行在廣東被首次報道[21-22]。

為進(jìn)一步了解我國CSFV的遺傳多樣性，對2004-2012年廣東和廣西分離的39個CSFV分離株進(jìn)行了序列分析。通過對E2基因片段（190 nt）和E2基因全長（1119 nt）序列分析表明，當(dāng)前流行的CSFV2.1亞型可進(jìn)一步分為10個亞亞型（2.1a～2.1j），Peng等[3,20]以前鑒定為2.1d亞亞型的分離株被重新分類為2.1g亞亞型。根據(jù)時間和空間分布特征，當(dāng)前最流行的亞亞型為2.1b，其次為2.1d和2.1g亞亞型，而不流行的亞亞型為2.1a、2.1e和2.1f[23]。

總之，2.1亞型是流行最廣泛的，其次是地方性散發(fā)的1.1、2.2和2.3亞型。在C株疫苗（1.1亞型）的選擇壓力下，1.1亞型的流行程度逐漸降低，2.2和2.3亞型呈消亡趨勢，剩下的2.1亞型是與疫苗株遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)的毒株，也是我國目前最流行的CSFV毒株[24]。我國CSFV流行株遺傳多樣性較強(qiáng)，廣泛流行的2型毒株與歐洲流行株有一定的親緣關(guān)系，可能源自相同的病毒祖先。盡管我國尚無CSFV基因3型毒株流行的報道，但有必要保持監(jiān)測以防止其從中國周邊地區(qū)如韓國、日本等傳入[3]。

1.4 我國CSFV的遺傳變異與疫苗保護(hù)豬瘟弱毒疫苗的普遍使用改變了原有病毒群落和生態(tài)環(huán)境，全世界的豬瘟流行特點(diǎn)也隨之發(fā)生重大變化，以溫和型豬瘟為主。我國進(jìn)行豬瘟疫苗免疫已60多年，豬瘟疫情雖已得到有效控制，但并未徹底根除，近年來呈零星散發(fā)趨勢，既有高死亡率的急性癥狀，又有持續(xù)發(fā)生的溫和型豬瘟癥狀，疫情多樣復(fù)雜[3]。因此，了解豬瘟流行毒株的遺傳變異和流行毒株與豬瘟疫苗株的差異，對我國豬瘟的防治具有重要意義。

E2蛋白是CSFV誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，是CSFV抗原表位集中的地方，具有高度的免疫原性，研究E2蛋白的變異對制定豬瘟防控策略具有重大意義。表2顯示了豬瘟病毒亞型E2基因之間的同源性百分比[3]。我們注意到2.1亞型與1.1亞型（疫苗株）的同源性最低，這也說明了2.1亞型在我國廣泛流行的原因。

表2 CSFV各亞型間E2基因同源性百分比Table 2 Percent nucleotide homology of full-length E2 between CSFV genotypes

綜合國內(nèi)其他研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國CSFV流行毒株的變異呈多樣性，以遠(yuǎn)離疫苗株的變異株為主。為研究現(xiàn)有疫苗能否對此類變異株產(chǎn)生有效保護(hù)，Zhou等[3]將C株E2基因同2010年～2015年從中國不同地區(qū)分離的流行株E2基因進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)它們有79.4%～99.0%的核苷酸同源性和78.0%～97.9%氨基酸同源性。此外，Wang等[25]研究了C株疫苗對中國9個不同基因型及致病性流行株的免疫保護(hù)作用，結(jié)果表明C株疫苗對1.1、2.1和2.2亞型毒株均能產(chǎn)生有效保護(hù)，且接種試驗毒株的免疫豬沒有排毒現(xiàn)象。這些結(jié)果為我國繼續(xù)使用C株疫苗提供了科學(xué)依據(jù)，但要最終凈化經(jīng)典豬瘟，這還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。為了應(yīng)對未來的危機(jī)，中國應(yīng)在繼續(xù)接種傳統(tǒng)疫苗的同時，研發(fā)使用新的替代疫苗，并持續(xù)強(qiáng)化生物安全，以最終實(shí)現(xiàn)豬瘟的凈化。

2 豬瘟疫苗的研究進(jìn)展

目前防控豬瘟的策略是“非免疫撲殺”和“預(yù)防免疫”。新型疫苗應(yīng)有已商業(yè)化疫苗同等效力的同時，兼具能夠區(qū)分疫苗免疫還是自然野毒感染（differentiate infected from vaccinated animals, DIVA）的效果。除了常規(guī)弱毒疫苗以外，當(dāng)前主流研究方向是基于CSFV保護(hù)性抗原E2的重組質(zhì)粒、表達(dá)蛋白或合成肽段的開發(fā)。

2.1 商業(yè)化豬瘟疫苗

2.1.1 豬瘟弱毒活疫苗 豬瘟弱毒活疫苗（modified live vaccine, MLV）包括中國的C株、日本的GPE（guinea-pig exaltation-negative）株、法國的Thiverval株以及墨西哥PAV-250株，常用于亞洲、南美洲中部等豬瘟流行地區(qū)的常規(guī)免疫[26]。豬瘟疫苗C株是由高致病力毒株（石門株）致弱而來[27]。C株免疫接種后5 d即可提供完整的免疫保護(hù)，并可持續(xù)6～18個月[28]；誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)能夠抵抗CSFV不同基因型（包括基因1、2、3型）強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)機(jī)制使其能刺激保護(hù)性抗體產(chǎn)生和活化T細(xì)胞反應(yīng)[29]。

2.1.2 CSFV E2亞單位疫苗 CSFV的主要抗原表位均位于E2基因中?；贑SFV E2或Erns蛋白的亞單位疫苗具有區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的特點(diǎn)，對豬瘟的凈化非常有意義。

雖然國際上利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研發(fā)的CSFV E2蛋白重組亞單位疫苗已經(jīng)全面評估并商業(yè)化（分別是拜耳公司BAYOVAC?CSF標(biāo)記疫苗和英特威公司Porcilis?Pestiwith標(biāo)記疫苗），但未見在市場流通，尚缺乏臨床數(shù)據(jù)。

目前為止，天康生物股份有限公司研制的豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗（Rb-03株）已獲得新獸藥注冊證書，是將豬瘟病毒E2基因重組于桿狀病毒內(nèi)，在昆蟲細(xì)胞上培養(yǎng)表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白而制成的新型基因工程疫苗。該疫苗是國內(nèi)首個豬瘟亞單位疫苗（能夠區(qū)分野毒感染和疫苗免疫），可用于鑒別診斷，能區(qū)分豬瘟野毒感染和疫苗免疫動物；并具有良好的安全性，不存在因突變或與野毒發(fā)生重組使其毒力返強(qiáng)的危險。

2.2 其他在研的豬瘟基因工程疫苗基于細(xì)胞表達(dá)平臺構(gòu)建基因工程亞單位疫苗目前已成為國內(nèi)生物制品企業(yè)研究開發(fā)熱點(diǎn)，其優(yōu)勢在于構(gòu)建的攜帶目標(biāo)基因的工程細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)灌流或懸浮化培養(yǎng)，大大降低了生產(chǎn)成本。此外，人5型復(fù)制缺陷型腺病毒活載體豬瘟病毒疫苗和嵌合豬瘟病毒疫苗均能誘導(dǎo)完全的免疫保護(hù)，免疫效果與常規(guī)的弱毒疫苗相當(dāng)，并且由于腺病毒載體的復(fù)制缺陷，使其兼具滅活苗的安全性和活苗的效力。其他在研新型的豬瘟基因工程疫苗主要有DNA疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗等。合成肽疫苗能夠誘導(dǎo)豬瘟特異性中和抗體的產(chǎn)生，但臨床應(yīng)用時其對機(jī)體提供不了有效的保護(hù)，這可能是不同CSFV基因型之間的抗原表位發(fā)生變異。

2.2.1 HEK293T細(xì)胞表達(dá)CSFV E2蛋白的亞單位疫苗 CSFV亞單位疫苗是由青島易邦生物工程有限公司合作研發(fā)，目前正在進(jìn)行新獸藥證書的申報環(huán)節(jié)。該疫苗是將豬瘟病毒E2基因分別插入慢病毒表達(dá)載體，并利用慢病毒能夠感染宿主細(xì)胞的特性，將E2基因整合到宿主細(xì)胞染色體中進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄表達(dá)，可以讓細(xì)胞持續(xù)分泌表達(dá)的E2蛋白。將E2蛋白加佐劑和細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑制備成疫苗，免疫動物后，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生充分的體液免疫反應(yīng)。該疫苗在豬體經(jīng)二次免疫能完全抵抗強(qiáng)毒攻擊（數(shù)據(jù)尚未公開）。

2.2.2 人5型復(fù)制缺陷型腺病毒載體豬瘟疫苗（rAdVE0-E2） rAdV-E0-E2是由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和青島易邦生物工程有限公司聯(lián)合研發(fā)，目前已通過轉(zhuǎn)基因生物安全評價，進(jìn)入臨床試驗階段。該疫苗是將豬瘟病毒E0和E2基因分別插入人5型復(fù)制缺陷性腺病毒載體CMV啟動子下游中進(jìn)行表達(dá)，充分發(fā)揮了腺病毒載體的高效表達(dá)外源基因能力。（數(shù)據(jù)尚未公開）。

2.2.3 人5型復(fù)制缺陷型腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗（rAdV-SFV-E2） rAdV-SFV-E2是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)，目前已通過轉(zhuǎn)基因生物安全評價，進(jìn)入臨床試驗階段。該疫苗是將甲病毒復(fù)制子載體的復(fù)制子插入人5型復(fù)制缺陷性腺病毒載體中，進(jìn)而構(gòu)建了一株表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合病毒[30-31]，充分發(fā)揮了腺病毒載體高效遞送的優(yōu)勢和甲病毒載體復(fù)制子載體高效表達(dá)外源基因的優(yōu)勢。

2.2.4 DNA疫苗 DNA疫苗均基于主要保護(hù)性抗原CSFV E2蛋白進(jìn)行的質(zhì)粒構(gòu)建[32-35]。為了提高其免疫效果，通常配合使用一些細(xì)胞因子（IL-2、IL-12，IL-18）或者細(xì)胞表面調(diào)節(jié)分子（CD154、CD40和CD81）等[32-33]。然而，臨床數(shù)據(jù)表明只有多次、高劑量的免疫接種才能獲得足夠的免疫保護(hù)，進(jìn)而導(dǎo)致免疫成本的增加[33]。因此，DNA疫苗只是停留在實(shí)驗室階段的研發(fā)。

2.2.5 基因缺失疫苗 基因缺失疫苗是基于CSFV全基因感染性克隆的構(gòu)建，通過對某一段基因的缺失或替換，在保留免疫原性的條件下使其毒力大大降低，同時具有DIVA特性。CSFV Erns、E2、Npro基因缺失疫苗株能夠自主復(fù)制，且不產(chǎn)生子代病毒（復(fù)制子）。研究證實(shí)，此類基因缺失疫苗免疫豬后能夠提供安全有效的免疫保護(hù)[35-38]。

3 展望

我國擁有世界上最大規(guī)模的養(yǎng)豬業(yè)，生豬產(chǎn)量占全球產(chǎn)量一半以上。豬瘟是一種具有高度感染性和致死性的傳染病，一旦發(fā)生，會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此豬瘟的控制和凈化問題一直備受世界各國關(guān)注[39]。目前世界上有預(yù)防性免疫和全面撲殺兩種控制豬瘟的策略，我國長期以接種兔化弱毒疫苗作為預(yù)防豬瘟的主要手段。但長期的疫苗免疫壓力、持續(xù)性感染的存在以及與其它病原微生物混合感染的發(fā)生，使得CSFV在我國的流行特征和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了較大變化，凸顯了我國豬瘟防控的復(fù)雜性。

自2018年8月3日首例非洲豬瘟（ASF）在沈陽被確診以來，ASF已相繼在我國多個省份發(fā)生，造成數(shù)百億直接經(jīng)濟(jì)損失[40]。而CSF和ASF的臨床癥狀和病理變化極其相似，會干擾彼此的診斷。根據(jù)巴西的防控經(jīng)驗，做好ASF的防控有利于CSF的凈化，而做好CSF的免疫和防控有利于ASF的診斷和防控。加之目前針對ASF沒有有效的疫苗和治療措施，在此背景下，更加凸顯了生物安全以及CSF控制和凈化的重要性。在加大ASF的防控和監(jiān)測力度的同時，加強(qiáng)CSF和其他重大豬病的免疫，并應(yīng)用標(biāo)記疫苗結(jié)合監(jiān)測和陽性豬淘汰等手段逐步實(shí)現(xiàn)CSF在規(guī)?；i場的凈化是可行的。

目前，我國豬瘟防控面臨的主要挑戰(zhàn)是防止中小型豬場豬瘟的零星暴發(fā)。因大型豬場的豬瘟免疫率及生物安全水平較高，而中小型豬場存在豬瘟免疫率低、免疫程序不規(guī)范以及缺乏抗體檢測等問題。此外，針對CSFV流行株的變異及毒力改變問題，應(yīng)該持續(xù)開展豬瘟流行毒株分子流行病學(xué)的調(diào)查，密切關(guān)注我國流行毒株的分布及變化，以及時調(diào)整豬瘟防控策略。加強(qiáng)CSFV病毒學(xué)、分子生物學(xué)及其免疫機(jī)制等基礎(chǔ)性研究，加快研制適應(yīng)未來需要的新型豬瘟疫苗及檢測方法，既能克服抗體監(jiān)測過程中各種干擾因素又能提供快速安全的免疫保護(hù)，最終實(shí)現(xiàn)我國豬瘟的控制和凈化。