商靖 陸勁羽 逄洪波 李雪梅 王艷秋 李玥瑩

摘要 [目的]研究SbGA20ox1、SbGA20ox3和SbGA2ox3基因?qū)Ω吡黄贩N赤霉素表達(dá)水平的影響。[方法]以不同高粱品種為試材（9544.7057為父本與不同母本進(jìn)行雜交得到子代：遼夏梁1號(hào)、遼2297、遼2697、遼5397、01-26B;以及01-26A為母本與不同父本進(jìn)行雜交得到子代：遼雜35、0-01、9544.7057、3550、遼2697），利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較不同時(shí)期（拔節(jié)期、抽穗期、成熟期），不同品種的高粱之間SbGA20ox1基因、SbGA20ox3基因、SbGA2ox3基因表達(dá)含量規(guī)律。[結(jié)果]SbGA20ox1基因在同一父本不同母本高粱組的基因表達(dá)規(guī)律基本符合抽穗期>成熟期>拔節(jié)期;SbGA2ox3基因在同一父本不同母本高粱組的基因表達(dá)規(guī)律基本符合抽穗期>成熟期>拔節(jié)期，SbGA2ox3基因在同一母本不同父本高粱組的基因表達(dá)規(guī)律基本符合拔節(jié)期>成熟期>抽穗期。而SbGA20ox1基因在同一母本不同父本高粱組的基因表達(dá)以及SbGA20ox3基因在各品種高粱的基因表達(dá)并未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律，各時(shí)期基因的相對(duì)表達(dá)量大部分品種間無明顯差異。[結(jié)論]該研究一定程度上揭示了SbGA20ox1、SbGA20ox3和SbGA2ox3基因在多個(gè)高粱品種各時(shí)期的基因表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究調(diào)控赤霉素水平的小基因家族的作用機(jī)制提供啟示。

關(guān)鍵詞 高粱;相對(duì)表達(dá)量;實(shí)時(shí)熒光定量;赤霉素;小基因家族

中圖分類號(hào) S 188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2022）02-0105-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of SbGA20ox1，SbGA20ox3 and SbGA2ox3 Genes on the Expression of Gibberellin in Sorghum Varieties

SHANG Jing，LU Jin-yu，PANG Hong-bo et al （School of Life Sciences，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034）

Abstract [Objective]To study the effects of SbGA20ox1，SbGA20ox3 and SbGA2ox3? on the expression of gibberellin in sorghum varieties.[Method]Different sorghum varieties were used as test materials （9544.7057 was used as the male parent and different female parents were crossed to obtain offspring：Liaoxialiang 1，Liao 2297，Liao 2697，Liao 5397，01-26B;and 01-26A was used as the female parent crossing with different male parents to obtain offspring：Liaoza 35，0-01，9544.7057，3550，Liao 2697）. Real-time fluorescent quantitative PCR technology was used to compare the expression levels of SbGA20ox1，SbGA20ox3，and SbGA2ox3 genes between different periods （joining stage，heading stage，maturity stage） and different varieties of sorghum.[Result] The gene expression pattern of SbGA20ox1 gene in the same male parent and different female parent sorghum groups basically accorded with heading date>mature stage>joining stage;the gene expression law of SbGA2ox3 gene in the same male parent and different female parent sorghum groups basically accorded with heading date>mature stage>joining stage，the gene expression pattern of SbGA2ox3 gene in the same female parent and different male parent sorghum groups basically accorded with jointing stage>mature stage>heading stage. However，the gene expression of SbGA20ox1 gene in the same female parent and different male parent sorghum groups and the gene expression of SbGA20ox3 gene in various varieties of sorghum did not find obvious regularities，and the relative expression levels of genes in each period showed no significant difference among most varieties.[Conclusion]This study revealed to a certain extent the gene expression regularity of SbGA20ox1，SbGA20ox3 and SbGA2ox3 genes in multiple sorghum varieties at various stages，and provided enlightenment for further research on the mechanism of the small gene family that regulates gibberellin levels.

Key words Sorghum;Relative expression level;Real-time fluorescence quantification;Gibberellin;Small gene family

基金項(xiàng)目

遼寧省教育廳重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（LZD201901）;遼寧省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（LZD202004）;財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06）。

作者簡介 商靖（1996—），女，遼寧北票人，碩士研究生，研究方向：植物基因工程。*共同通信作者：王艷秋，研究員，碩士，從事高粱育種與栽培工作;李玥瑩，教授，博士，從事植物基因工程研究。

收稿日期 2021-04-16

高粱屬禾谷類作物，是世界第五大作物[1-2]。作為糧食，高粱的籽粒內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如淀粉、蛋白質(zhì)、鐵、鎂等[3]，且在邊緣土地上，相較于其他可作為糧食的作物，生產(chǎn)和生物量更高[4]，在非洲和很多發(fā)展中國家的許多干旱及半干旱地區(qū)都是重要食物來源[5]。高粱作為糧食已有悠久的歷史。除了可作為糧食，高粱還具有許多其他用途。比如作為飼料，可以最小化差異地替代玉米，進(jìn)而更節(jié)約成本[6]。在釀酒中，相較于小麥、大米、糯米等，高粱整體協(xié)調(diào)風(fēng)格評(píng)價(jià)最高[7];此外，高粱還可以作為能源[8]，具有很高的利用價(jià)值 [9-10]。

赤霉素是植物激素，屬于雙萜類化合物 [11]，是高等植物重要的五大內(nèi)源激素之一[12] ，也是重要的植物生長調(diào)節(jié)劑[13]。赤霉素能夠促進(jìn)細(xì)胞的伸長[14]，并參與植物生長發(fā)育的許多方面，如種子萌發(fā)、莖的伸長以及植物籽粒生物量的提高等[4]。

植物中赤霉素的水平受許多小基因家族的表達(dá)的調(diào)控。如2-氧化戊二酸-依賴加雙氧酶赤霉素20-氧化酶1（SbGA20ox1）基因和2-氧化戊二酸-依賴加雙氧酶赤霉素20-氧化酶3（SbGA20ox3）基因?qū)Τ嗝顾厮接姓{(diào)節(jié)作用，2-氧化戊二酸-依賴加雙氧酶 赤霉素2-氧化酶3（SbGA2ox3）基因?qū)Τ嗝顾厮接胸?fù)調(diào)節(jié)作用[15]。

該試驗(yàn)探究SbGA20ox1、SbGA20ox3和SbGA2ox3基因在不同品種高粱各時(shí)期的基因表達(dá)量規(guī)律，為進(jìn)一步探究赤霉素受小基因家族的調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 供試高粱品種由遼寧省農(nóng)科院提供，分別是以9544.7057為同一父本的子代，遼夏梁1號(hào)、遼2297、遼2697、遼5397、01-26B 5個(gè)高粱品種，以及以01-26A為同一母本的子代，遼雜35、0-01、9544.7057、3550、遼2697 5個(gè)高粱品種。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成。取約30 mg樣品于已放入20顆研磨用小鋼珠的2 mL離心管中，使用研磨儀進(jìn)行樣品研磨，隨后根據(jù)RNA提取試劑盒 （Promega） 說明書，進(jìn)行總RNA的提取，隨后根據(jù) PrimeScript RT Master Mix （TaKaRa） 試劑盒說明書，進(jìn)行 RNA 的反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA 備用。

1.2.2 引物的選取。參照文獻(xiàn)[16]，選取SbActin基因?yàn)閮?nèi)參基因，另選取 SbGA2ox 1、 SbGA20ox 3、SbGA20ox 3為引物，對(duì)影響赤霉素水平的SbGA20ox1、SbGA20ox3和SbGA2ox3基因進(jìn)行基因表達(dá)檢測。引物由生工生物工程上海 （股份） 有限公司合成，具體見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （TaKaRa） 進(jìn)行 RT—PCR 擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為20.0 μL：10.0 μL 2× SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.8 μL Forward Primer （10 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer （10 μmol/L），6.4 μL ddH 2O，2.0 μL cDNA模板。

PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s 40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動(dòng)生成Ct值[17]。

1.2.4 基因表達(dá)檢測。得到的Ct值用Comparative Delta-delta Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用IBM SPSS 23軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)[18]，使用Origin 8.6軟件進(jìn)行柱狀圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbGA20ox1基因在不同高粱品種各時(shí)期的基因表達(dá)規(guī)律 對(duì)同一父本9544.7037的遼夏梁1號(hào)、遼2297、遼2697、遼5397、01-26B的測定分析結(jié)果表明，拔節(jié)期，SbGA20ox1基因表達(dá)量在這5個(gè)高粱品種中的表達(dá)量都非常低，且品種間無顯著差異。抽穗期，遼2697的SbGA20ox1基因表達(dá)量最高（6.28），遼5397的SbGA20ox1基因表達(dá)量最低（1.5）。成熟期，遼2297的SbGA20ox1基因表達(dá)量最高（7.99），遼5397的SbGA20ox1基因表達(dá)量最低（0.4）。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，除品種遼2297外，遼夏梁1號(hào)、遼2697、遼5397、01-26B，4個(gè)品種SbGA20ox1基因表達(dá)量均符合抽穗期>成熟期>拔節(jié)期。而品種遼2297的SbGA20ox1基因表達(dá)量為成熟期>抽穗期>拔節(jié)期（圖1 a）。

對(duì)同一母本01-26A的遼雜35、0-01、9544.7057、3550、遼2697的測定分析結(jié)果表明，拔節(jié)期，9544.7057的SbGA20ox1基因表達(dá)量最高（6.02），顯著高于其他4個(gè)品種，0-01的SbGA20ox1基因表達(dá)量最低（0.05）。抽穗期，3550的SbGA20ox1基因表達(dá)量最高（1.0），0-01的SbGA20ox1基因表達(dá)量最低（0.09）。成熟期，遼2697的SbGA20ox1基因表達(dá)量最高（2.6），遼雜35的SbGA20ox1基因表達(dá)量最低（0.16）。遼雜35、9544.7057在拔節(jié)期的基因表達(dá)量尤其高外，其他品種均為成熟期的基因表達(dá)量最高，但相比于其他2個(gè)時(shí)期沒有很大差異（圖1 b）。

2.2 SbGA20ox3基因在不同高粱品種各時(shí)期的基因表達(dá)規(guī)律 對(duì)同一父本9544.7037的遼夏梁1號(hào)、遼2297、遼2697、遼5397、01-26B的測定分析結(jié)果表明，拔節(jié)期，遼2697的SbGA20ox3基因表達(dá)量最高（2.0），遼2297的SbGA20ox3基因表達(dá)量最低（0.31）。抽穗期，遼2697的SbGA20ox3基因表達(dá)量最高（7.84），與其他4個(gè)品種表達(dá)量相差較大，遼2297的SbGA20ox3基因表達(dá)量最低（0.24）。成熟期，遼2697的SbGA20ox3基因表達(dá)量最高（1.52），略高于01-26B，遼5397的SbGA20ox3基因表達(dá)量最低（0.23），略低于遼夏梁1號(hào)（圖2 a）。

對(duì)同一母本01-26A的遼雜35、0-01、9544.7057、3550、遼2697的測定分析結(jié)果表明，拔節(jié)期，0-01的SbGA20ox3基因表達(dá)量最高（13.43），顯著高于其他品種，遼雜35的SbGA20ox3基因表達(dá)量最低（1.29）。抽穗期，遼雜35的SbGA20ox3基因表達(dá)量最高（3.45），9544.7057的SbGA20ox3基因表達(dá)量最低（0.39）。成熟期，0-01的SbGA20ox3基因表達(dá)量最高（6.06），遼2697的SbGA20ox3基因表達(dá)量最低（0.79）（圖2 b）。

2.3 SbGA2ox3基因在不同高粱品種各時(shí)期的基因表達(dá)規(guī)律 對(duì)同一父本9544.7037的遼夏梁1號(hào)、遼2297、遼2697、遼5397、01-26B的測定分析結(jié)果表明，拔節(jié)期，遼5397的SbGA2ox3基因表達(dá)量最高（0.95），遼2697的SbGA2ox3基因表達(dá)量最低（0.37）。抽穗期，01-26B的SbGA2ox3基因表達(dá)量最高（9.01），顯著高于其他4個(gè)品種;遼夏梁1號(hào)的SbGA2ox3基因表達(dá)量最低（0.86）。成熟期，遼夏梁1號(hào)的SbGA2ox3基因表達(dá)量最高（3.46），遼5397的SbGA2ox3基因表達(dá)量最低（1.45）。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，除遼夏梁1號(hào)外，遼2297、遼2697、遼5397、01-26B的基因表達(dá)量均符合抽穗期>成熟期>拔節(jié)期。而遼夏梁1號(hào)的基因表達(dá)量符合拔節(jié)期<抽穗期<成熟期（圖3 a）。

對(duì)同一母本01-26A的遼雜35、0-01、9544.7057、3550、遼2697的測定分析結(jié)果表明，拔節(jié)期，3550的SbGA2ox3基因表達(dá)量最高（3.86），遼2697的SbGA2ox3基因表達(dá)量最低（0.98）。抽穗期，遼雜35的SbGA2ox3基因表達(dá)量最高（0.40），9544.7057的SbGA2ox3基因表達(dá)量最低（0.14），但與品種3550、0-01的SbGA2ox3基因表達(dá)量相差無幾。成熟期，3550的SbGA2ox3基因表達(dá)量最高（3.09），0-01的SbGA2ox3基因表達(dá)量最低（0.43）。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，遼雜35、0-01、9544.7057、3550、遼2697 5個(gè)品種的高粱SbGA2ox3基因表達(dá)量均符合拔節(jié)期>成熟期>抽穗期（圖3 b）。

3 討論

高粱可以用作多種營養(yǎng)食品，其功能特性和作為食品的應(yīng)用已廣為人知[5]。 赤霉素在非生物脅迫耐受性中起重要作用[19]。已有研究表明，赤霉素能促進(jìn)細(xì)胞的分裂和伸長，且在植物的整個(gè)生命周期內(nèi)都起作用[9]。而赤霉素在植物各時(shí)期的水平受許多小基因家族調(diào)控，其中SbGA20ox1基因和SbGA20ox3基因?qū)τ诔嗝顾厮接姓{(diào)節(jié)作用，SbGA2ox3基因?qū)τ诔嗝顾厮接胸?fù)調(diào)節(jié)作用。

該研究表明，SbGA20ox1基因在相同父本不同母本高粱組，拔節(jié)期的基因表達(dá)量很低，且除遼2297品種外均符合抽穗期>成熟期>拔節(jié)期規(guī)律。SbGA20ox1基因在相同母本不同父本高粱組的3個(gè)時(shí)期，表達(dá)量差異不大，無明顯規(guī)律。SbGA20ox3基因在相同父本不同母本高粱組，除品種遼2297外的品種，拔節(jié)期的基因表達(dá)量最高，但各時(shí)期間基因表達(dá)量的差異并不大。SbGA20ox3基因在相同母本不同父本高粱組，除遼雜35外的高粱品種在拔節(jié)期的基因表達(dá)量最高。SbGA2ox3基因在相同父本不同母本高粱組，拔節(jié)期的基因表達(dá)量偏低，除遼夏梁1號(hào)外，其余高粱品種基因表達(dá)量均符合抽穗期>成熟期>拔節(jié)期。SbGA2ox3基因在相同母本不同父本高粱組，抽穗期的基因表達(dá)量很低，5個(gè)高粱品種基因表達(dá)量均符合拔節(jié)期>成熟期>抽穗期。

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