朱艷容 劉志新 楊靖 韓韻 陳果 徐祥

摘要 [目的]構(gòu)建假單胞菌毒性基因（oprD）缺失突變株，為進(jìn)一步探討其編碼的毒力因子功能奠定基礎(chǔ)。[方法]利用pEX18Gm質(zhì)粒作為基因敲除的載體，構(gòu)建假單胞菌oprD 基因重組自殺質(zhì)粒，通過(guò)同源重組并激活自殺基因方式，篩選到目的基因缺失的突變株，再利用pBBR1MCS-2質(zhì)粒作為目的基因回補(bǔ)的載體，構(gòu)建回補(bǔ)載體。[結(jié)果]同源重組后，經(jīng)過(guò)慶大霉素和氯霉素雙抗平板、蔗糖平板篩選和PCR鑒定，成功獲得了oprD基因缺失突變株，類(lèi)似操作獲得了回補(bǔ)菌株。[結(jié)論]基因缺失突變株的成功構(gòu)建可為下一步的毒性機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 假單胞菌;毒力因子;基因敲除;基因回補(bǔ)

中圖分類(lèi)號(hào) S 188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2022）02-0109-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.029

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Construction of oprD Gene Deletion and Complement Vector of Pseudomonas sp.

ZHU Yan-rong1，2，LIU Zhi-xin1，YANG Jing1 et al（1. Basic Medical College， Hubei University of Medicine， Shiyan， Hubei 442000; 2.Hanjiang River Bureau of Hydrology and Water Resources Survey， Xiangyang， Hubei 441000）

Abstract [Objective]To construct Pseudomonas virulence gene （oprD） deletion mutant，and lay the foundation of function for the virulence factor encoded.[Method]We constructed Pseudomonas oprD using pEX18GM plasmid as the vector of gene knockout.The mutant strain with target gene deletion was screened by homologous recombination and activation of suicide gene.The plasmid pBBR1MCS-2 was used as the vector of target gene complement，and the complement vector was constructed.[Result]The results showed that the mutant strain was subjected to gentamicin and chloramphenicol double resistance plate.Through sucrose plate screening and PCR identification，the oprD gene deletion mutant strain was successfully obtained.Similar operation obtained the complement strain gene deletion mutant strain.[Conclusion]The successful construction laid a foundation for further study of toxicity mechanism.

Key words Pseudomonas;Virulence factor;Knockout;Complement

基金項(xiàng)目 湖北省教育廳指導(dǎo)性項(xiàng)目（B2016113）。

作者簡(jiǎn)介 朱艷容（1985—），女，湖北咸寧人，高級(jí)工程師，碩士，從事水環(huán)境監(jiān)測(cè)研究。*通信作者，講師，碩士，從事病原微生物研究。

收稿日期 2021-05-12;修回日期 2021-06-15

假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌是桿狀或稍彎的革蘭染色陰性桿菌，菌體大小約為（0.5～1.0）μm ×（1.5～4.0）μm，不形成芽胞，有莢膜;某些假單胞菌株能產(chǎn)生熒光色素，如紅、藍(lán)、黃等水溶性色素，有些則具有較強(qiáng)的分解有機(jī)物的能力[1-3]。假單胞菌是廣泛存在的環(huán)境微生物，在土壤、空氣、水、動(dòng)植物體內(nèi)均有分布，該屬中有許多致病菌，能引發(fā)動(dòng)植物疾病[4-7];另外，假單胞菌屬細(xì)菌在生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域也有著巨大的潛力[8-10]。

該試驗(yàn)所用細(xì)菌是從東湖水域中篩選獲得高產(chǎn)鐵載體假單胞菌，其產(chǎn)鐵載體的機(jī)制與其他假單胞菌不同，前期研究表明，其發(fā)揮毒性作用而導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。由于其產(chǎn)鐵載體的機(jī)制與其他已知的假單胞菌不同，故其可能有特殊的毒性機(jī)制[11-13]。利用轉(zhuǎn)座子插入突變株的構(gòu)建和毒性相關(guān)基因的多次篩選，得到一些與細(xì)菌毒性相關(guān)的基因，以其中1個(gè)oprD為研究對(duì)象，擴(kuò)增目的基因上下游片段，再利用同源重組交換方法，構(gòu)建oprD基因缺失載體，同時(shí)構(gòu)建回補(bǔ)菌株，從分子生物學(xué)方向揭示HYS菌株的毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒。高產(chǎn)鐵載體假單胞菌、大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、克隆載體pEX18Gm、回補(bǔ)載體pBBR2由武漢大學(xué)謝志雄教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑。甘油（BIOSHARP）、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素（普博欣）;基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒（天根生物）;內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、2×PCR Taq Mix（Takara 公司）;Gold View（賽百盛生物）;三氯甲烷、異丙醇、乙醇、蔗糖、氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)）;蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（美國(guó)BD公司）。

1.1.3 引物及測(cè)序。引物根據(jù) NCBI 序列設(shè)計(jì)（表1），由生工生物工程合成。 該試驗(yàn)所有相關(guān) DNA 測(cè)序工作均由華大基因完成。

1.1.4 主要儀器。PCR 儀（Veriti，Applied Biosystem 公司）;全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple公司）;水平電泳儀（Bio-Rad 公司）;移液器、離心機(jī)（Eppendorf 公司）;恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱（上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 假單胞菌基因組提取。將活化后的HYS菌液按1%轉(zhuǎn)接到新的LB中培養(yǎng)6 h離心去上清;用天根生物試劑公司的基因組試劑盒抽提假單胞菌基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 基因敲除菌株的構(gòu)建。

1.2.2.1 待敲除基因上下游片段的擴(kuò)增與回收。根據(jù)已知的HYS基因序列，定位oprD基因上下游長(zhǎng)度約350 bp大小的序列通過(guò)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL：去離子水20 μL;2×Taq mix 25 μL; Primer 1 2 μL;Primer 2 2 μL; HYS DNA 1 μL。反應(yīng)程序105 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;58 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)后，用天根生物試劑公司的膠回收試劑盒對(duì)目的條帶回收。

1.2.2.2 基因上下游片段與敲除載體的連接。膠回收的上游基因片段用Xba Ⅰ 和Sac Ⅰ 雙酶切，下游片段用Sac Ⅰ 和Eco RⅠ 雙酶切，酶切體系20 μL，其中去離子水6 μL，10×FastDigest Buffer，2 μL，PCR purified （0.2 μg）10 μL，F(xiàn)astDigest enzyme 1 1 μL，F(xiàn)astDigest enzyme 2 1 μL。質(zhì)粒pEX18Gm用Xba Ⅰ 和 Eco RⅠ 雙酶切（圖1）。酶切體系20 μL，其中，去離子水13 μL，10×FastDigest Buffer 2 μL，plasmid DNA（1 μg）3 μL，F(xiàn)astDigest enzyme Xba I 1 μL，F(xiàn)astDigest enzyme Eco RI 1 μL。然后加T4連接酶放入16 ℃恒溫箱孵育3 h。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)化過(guò)程及轉(zhuǎn)化子鑒定。將孵育好的20 μL連接體系加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30 min后42 ℃熱激90 s，立即置于冰上，2 min后補(bǔ)加LB液體培養(yǎng)基，37 ℃水浴。離心去上清后用LB懸浮細(xì)胞并涂布抗性平板。37 ℃孵育過(guò)夜。選取平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)體系10 μL，其中，去離子水4.0 μL，2×Taq max 5.0 μL，M13F 0.5 μL，M13R 0.5 μL，菌落（轉(zhuǎn)化子）1個(gè)。反應(yīng)程序：105 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火90 s;72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)后，凝膠電泳并觀測(cè)所得條帶是否正確。正確條帶的菌株送公司測(cè)序。

1.2.2.4 假單胞菌與轉(zhuǎn)化子的同源交換。取過(guò)夜培養(yǎng)的HYS菌液和鑒定正確的轉(zhuǎn)化子菌液分別稀釋后等體積混合均勻，滴入LB后放入30 ℃恒溫箱孵育36～48 h，用20%甘油將LB平板上的菌苔洗脫下來(lái)記為100，然后進(jìn)行梯度稀釋至10-6。取后3個(gè)稀釋度的菌液涂布慶大霉素和氯霉素雙抗平板，對(duì)照做同樣處理培養(yǎng)24 h，從平板上挑單個(gè)菌落接種到同樣雙抗的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h，然后轉(zhuǎn)接到?jīng)]有抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，梯度稀釋菌液至10-6，并取最后3個(gè)稀釋度下的菌液涂布5%蔗糖平板，12 h后PCR鑒定單菌落是否為敲除株。

1.2.3 基因的回補(bǔ)菌株及其過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建。

1.2.3.1 回補(bǔ)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。

以HYS為模板，設(shè)計(jì)引物將目的基因擴(kuò)增后用Eco RⅠ 和 Xho Ⅰ 雙酶切并回收，再與用相同內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒載體pBBR1MCS-2進(jìn)行連接，并通過(guò)轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中，鑒定正確后得到帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的菌株。具體操作參照敲除質(zhì)粒的構(gòu)建（圖2）。

1.2.3.2 假單胞菌的基因回補(bǔ)。通過(guò)接合使重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入已構(gòu)建好的基因敲除菌株和野生型HYS菌株中，接合時(shí)間為12 h，洗脫后，將菌液稀釋至10-4～10-6涂布到有雙抗性（卡那霉素和氯霉素）的篩選平板。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組構(gòu)建帶有質(zhì)粒載體pBBR1MCS-2的基因敲除菌株和HYS菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因片段克隆 根據(jù)HYS基因組上oprD基因上下游序列設(shè)計(jì)引物，得到與預(yù)期大小一致的條帶，上下游均約為350 bp。雙酶切上下游片段和pEX18Gm（5 831 bp）載體，瓊脂糖凝結(jié)結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.2 基因缺失載體的構(gòu)建 將雙酶切回收后的片段與載體進(jìn)行三段酶連，所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌感受態(tài)，涂布于抗性平板。所得轉(zhuǎn)化子5個(gè)，以通用引物進(jìn)行PCR鑒定，所得結(jié)果見(jiàn)圖4。只有一個(gè)轉(zhuǎn)化子在800 bp處有條帶與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果顯示，序列同源性99%以上為陽(yáng)性克隆。

2.3 HYS同源交換 將HYS菌株與轉(zhuǎn)化子混合均勻，孵育后洗脫，梯度稀釋后選擇合適的稀釋梯度涂布慶大霉素和氯霉素雙抗平板。將所選擇菌落接種于同樣雙抗的LB液體培養(yǎng)基中12 h，轉(zhuǎn)接到?jīng)]有抗性的LB液體培養(yǎng)基12 h，梯度稀釋后選擇合適稀釋度涂布5%蔗糖平板，以HYS基因組為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)長(zhǎng)出的4個(gè)菌落PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明有一個(gè)條帶相符，公司測(cè)序結(jié)果符合為同源交換陽(yáng)性株（圖5）。

因質(zhì)粒pEX18Gm不能在假單胞菌中獨(dú)立復(fù)制，只可以通過(guò)整合后復(fù)制。故通過(guò)慶大霉素和氯霉素雙抗選擇和無(wú)抗選擇，可以得到敲除株與野生株，利用5%蔗糖平板篩選出敲除株。

2.4 目的基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

以HYS為模板，設(shè)計(jì)引物將目的基因擴(kuò)增（750 bp）后雙酶切，用相同內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒載體pBBR1MCS-2（5 144 bp）膠回收（圖6），酶連并轉(zhuǎn)化，鑒定正確后得到帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的菌株。測(cè)序結(jié)果正確，回補(bǔ)載體構(gòu)建完成。

3 討論該研究所用的假單胞菌，因產(chǎn)鐵載體與其他假單胞菌不同[11，13]，以該細(xì)菌喂食線蟲(chóng)，有明顯的線蟲(chóng)致死效應(yīng)。利用轉(zhuǎn)座子插入突變的方式，多次篩選得到多個(gè)毒性相關(guān)基因。但目前對(duì)這些基因的毒性作用機(jī)理卻知之甚少。

在對(duì)病原微生物毒性基因的研究過(guò)程中[14-15]，目的基因的缺失是確定其功能、闡明毒性機(jī)理的重要方法。利用同源重組交換的方式敲除待研究基因是研究其功能的重要手段[16-20]。

利用分子生物學(xué)的手段，以同源重組為基礎(chǔ)構(gòu)建了假單胞菌潛在毒性基因oprD的缺失載體和回補(bǔ)載體。利用氨芐抗性篩選缺失基因轉(zhuǎn)化子。在同源交換過(guò)程中，通過(guò)慶大霉素和氯霉素雙抗篩選雙交換敲除株和野生株，最終通過(guò)激活蔗糖致死性基因排除野生株，得到敲除株，并以測(cè)序的方式驗(yàn)證其正確性。另外，用類(lèi)似的方法對(duì)目的基因進(jìn)行回補(bǔ)，為下一步研究oprD基因的毒性功能以及為其他潛在的毒性基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]

高蕓.生防芽孢桿菌及假單胞菌拮抗植物微生物病害研究進(jìn)展[J].北方園藝，2021（2）：131-136.

[2] GAO J W，XIE G F，PENG F，et al.Pseudomonas donghuensis sp.nov，exhibiting high-yields of siderophore[J].Antonie van leeuwenhoek，2015，107（1）：83-94.

[3] 蔣海霞，周蓮，何亞文.銅綠假單胞菌生防菌株抑菌代謝產(chǎn)物及其生防應(yīng)用研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（7）：1338-1349.

[4] PARKINS M D，SOMAYAJI R，WATERS V J.Epidemiology，biology，and impact of clonal Pseudomonas aeruginosa infections in cystic fibrosis[J].Clin Microbiol Rev，2018，31（4）：1-38.

[5] KESWANI C，SINGH H B，GARCA-ESTRADA C，et al.Antimicrobial secondary metabolites from agriculturally important bacteria as next-generation pesticides[J].Appl Microbiol Biotechnol，2020，104（3）：1013-1034.

[6] 陳磊.假單胞菌在煙草病蟲(chóng)害防治中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（2）：5-7.

[7] 徐志偉，魏云林，季秀玲.假單胞菌噬菌體基因組學(xué)研究進(jìn)展[J].遺傳，2020，42（8）：752-759.

[8] 崔瑩，宋凱，何亞文.假單胞菌代謝產(chǎn)物藤黃綠菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物合成途徑、調(diào)控機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2021，37（1）：52-59.

[9] FERN NDEZ M，PORCEL M，DE LA TORRE J，et al.Analysis of the pathogenic potential of nosocomial Pseudomonas putida strains[J].Front microbiol，2015，6：1-11.

[10] AL-WRAFY F，BRZOZOWSKA E，GRSKA S，et al.Pathogenic factors of Pseudomonas aeruginosa-the role of biofilm in pathogenicity and as a target for phage therapy[J].Postepy Hig Med Dosw （Online），2017，71：78-91.

[11] SHI H M，HUANG X Q，WANG Z，et al.Improvement of pyoluteorin production in Pseudomonas protegens H78 through engineering its biosynthetic and regulatory pathways[J].Appl Microbiol Biotechnol，2019，103（8）：3465-3476.

[12] SULOCHANA M B，JAYACHANDRA S Y，KUMAR S K A，et al.Antifungal attributes of siderophore produced by the Pseudomonas aeruginosa JAS-25[J].J Basic Microbiol，2014，54（5）：418-424.

[13] BANO N，MUSARRAT J.Characterization of a new Pseudomonas aeruginosa strain NJ-15 as a potential biocontrol agent[J].Curr Microbiol，2003，46（5）：324-328.

[14] SAWADA H，F(xiàn)UJIKAWA T，NISHIWAKI Y，et al.Pseudomonas kitaguniensis sp.nov，a pathogen causing bacterial rot of Welsh onion in Japan[J].Int J Syst Evol Microbiol，2020，70（5）：3018-3026.

[15] XIE G F，ZENG M，YOU J，et al.Pseudomonas donghuensis HYS virulence towards Caenorhabditis elegans is regulated by the Cbr/Crc system[J].Sci Rep，2019，9（1）：1-12.

[16] 蔣成輝，曾巧英，王萌，等.CRISPR/Cas9 構(gòu)建 srtA 基因敲除的金黃色葡萄球菌[J].生物技術(shù)通報(bào)，2020，36（9）：253-265.

[17] YU X Y，CHEN M，JIANG Z，et al.The two-component regulators GacS and GacA positively regulate a nonfluorescent siderophore through the Gac/Rsm signaling cascade in high-siderophore-yielding Pseudomonas sp.strain HYS[J].J Bacteriol，2014，196（18）：3259-3270.

[18] 石雨鷺，鄭瑞，靳亞軍，等.水稻 OsDTH13 基因編輯突變體的創(chuàng)制與分析[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，40（3）：22-27.

[19] 徐涵，潘超，黃競(jìng)，等.銅綠假單胞菌waaL突變體構(gòu)建及糖基化系統(tǒng)的建立[J].生物技術(shù)通訊，2020，31（6）：634-640.

[20] 李明奇，王小鳳，郭嘉，等.布魯菌DK63_426基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，38（1）：31-36.