杜杭濤，徐睿，徐慧，施文卿,2，鄧皓元，何俊龍，朱琳*

1.南京信息工程大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省大氣環(huán)境監(jiān)測與污染控制高技術(shù)研究重點實驗室

2.中國科學(xué)院水生生物研究所

3.中國環(huán)境科學(xué)研究院

4.國家長江生態(tài)環(huán)境保護(hù)修復(fù)聯(lián)合研究中心

5.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點實驗室

近年來，隨著城市人口的急劇增長和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，造成污染源和外排污染物數(shù)量劇增，不少受納水體生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重失衡[1]。氮作為水體中重要營養(yǎng)元素之一，當(dāng)其含量超出一定水平后，則會引起水體富營養(yǎng)化，導(dǎo)致藍(lán)藻水華和赤潮現(xiàn)象頻發(fā)，對水生生物生存與人類健康構(gòu)成巨大威脅。因此，如何高效脫氮成為了環(huán)境學(xué)科領(lǐng)域的研究重點[2-3]。在當(dāng)前眾多脫氮技術(shù)中，微生物脫氮因效率高、費(fèi)用低、安全性好等特點被廣泛運(yùn)用于污水脫氮處理[4-5]。

微生物脫氮是利用硝化作用將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮，最后由反硝化作用將硝態(tài)氮還原成氮?dú)鈴乃w逸出的過程，從而達(dá)到從污水中脫去超標(biāo)氮素的目的[6]。氮在污水中主要以氨氮、有機(jī)氮以及少量的亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮等形態(tài)存在。由于有機(jī)氮可被枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、腐敗梭菌、變形桿菌等多種異養(yǎng)型細(xì)菌轉(zhuǎn)化為氨氮（氨化作用），且轉(zhuǎn)化效率很高，硝化過程則成為了微生物脫氮的關(guān)鍵，制約著后續(xù)反硝化過程的進(jìn)行。因此，如何篩選高效硝化細(xì)菌是污水脫氮的關(guān)鍵。

硝化細(xì)菌是生物脫氨氮過程的主要功能菌群，可分為2 類：一類是將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮的氨氧化細(xì)菌（ammonia-oxidizing bacteria,AOB）；另一類為將亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮的硝化細(xì)菌（nitriteoxidizing bacteria,NOB）[7-8]。目前，國內(nèi)外眾多學(xué)者已對硝化細(xì)菌開展了大量的相關(guān)研究，但這些研究主要集中在硝化細(xì)菌脫氨氮效率及其影響因素等方面[9-14]，而有關(guān)從何種生境篩選硝化細(xì)菌尚不清楚。筆者比較了沉積物、土壤自然環(huán)境和市售人為環(huán)境3 種生境硝化細(xì)菌，并利用分子生物學(xué)方法對各種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，以期為微生物脫氮工藝中硝化細(xì)菌菌種篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 硝化細(xì)菌富集

沉積物和土壤生境硝化細(xì)菌分別采集于云南省昆明市船房河沉積物和某菜地土壤，市售生境硝化細(xì)菌為天津日野南洋水族廠生產(chǎn)的硝化細(xì)菌菌液。富集培養(yǎng)液為人工配制，具體成分見文獻(xiàn)[15]。富集裝置為4 L 塑料桶，加入適量培養(yǎng)液后，用電磁式空氣壓縮機(jī)曝氣使水體DO 濃度大于2 mg/L。富集過程中，每2 d 換水1 次，每次換水前，先沉淀2 h，用虹吸法吸去上層水體，再加入等量的培養(yǎng)液。富集過程中溫度維持在（22±1）℃，pH 維持在8.0±0.2。

1.2 不同生境硝化細(xì)菌硝化速率

硝化速率測定在1 000 mL 錐形瓶中進(jìn)行。為了利于硝化細(xì)菌附著，在每個錐形瓶中放置200 g 沸石?？紤]到沸石對氨氮具有吸附性，本試驗硝化速率是通過測定反應(yīng)器中硝酸氮濃度升高速率來實現(xiàn)的。硝酸氮濃度采用紫外分光光度法測定[16]。試驗前，為使得各反應(yīng)系統(tǒng)穩(wěn)定，加入沸石和等體積硝化細(xì)菌富集菌液后，在溫度為（22±1）℃，pH 為8.0±0.2條件下，用25 mg/L 氨氮濃度的人工配制污水曝氣培養(yǎng)，監(jiān)測各反應(yīng)器中的硝化速率，直至反應(yīng)器的硝化速率穩(wěn)定（約2～4 周）。每個生境類型硝化細(xì)菌設(shè)置3 個平行反應(yīng)器。

1.2.1人工配制污水硝化速率

分別向各反應(yīng)器中加入1 000 mL 25 mg/L 氨氮濃度的人工配制污水，在溫度為（22±1）℃、pH 為8.0±0.2、連續(xù)曝氣條件下培養(yǎng)，測定各反應(yīng)器的硝化速率。

1.2.2生活污水硝化速率

實際生活污水取自昆明市蘭花溝河。將污水加入反應(yīng)器前，過濾掉懸浮物雜質(zhì)。取1 000 mL 預(yù)處理后的污水，分別加入各反應(yīng)器中，用NaOH 溶液調(diào)pH 至8.0±0.2，在溫度（22±1）℃下曝氣運(yùn)行，測定各反應(yīng)器的硝化速率。

1.3 硝化細(xì)菌對不同環(huán)境因子的適應(yīng)性

為了分析硝化細(xì)菌適應(yīng)性，設(shè)置了各環(huán)境因子極端值。雖然在實際污水脫氮處理時這些極端條件不常見，但對于確定硝化細(xì)菌的各環(huán)境因子適應(yīng)范圍，分析硝化細(xì)菌種群與功能差異性具有重要意義。

為研究硝化細(xì)菌對氨氮初始濃度的適應(yīng)性，配制了氨氮初始濃度分別為5、50、100、150、200、250、300 mg/L 一系列人工污水。在溫度為20 ℃，pH為8.0，連續(xù)曝氣條件下，測定各反應(yīng)器硝化速率。

為研究硝化細(xì)菌對溫度的適應(yīng)性，將各反應(yīng)器置于大容器全溫振蕩器（不使用振蕩功能）中，加入氨氮初始濃度為25 mg/L 人工配制污水，用導(dǎo)氣管連接氣泵對各反應(yīng)器連續(xù)曝氣，調(diào)節(jié)pH 為8.0，測定5、10、20、30、40 ℃下各反應(yīng)器的硝化速率。

為研究硝化細(xì)菌對pH 的適應(yīng)性，在溫度為20 ℃，連續(xù)曝氣的條件下，用NaOH 調(diào)節(jié)反應(yīng)器pH，測定各反應(yīng)器在pH 為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0 的硝化速率。

為研究硝化細(xì)菌對鹽度的適應(yīng)性，在25 mg/L氨氮濃度的人工配制污水中加入NaCl，配制成鹽度梯度為0、5、10、15、20、25 g/L 的污水，在溫度為20 ℃，pH 為8.0 條件下，對各反應(yīng)器連續(xù)曝氣，測定各反應(yīng)器在各鹽度梯度下的硝化速率。

1.4 硝化細(xì)菌分子生物學(xué)分析

硝化細(xì)菌豐度采用MPN-PCR 計數(shù)法。從各反應(yīng)器中取適量菌液，用Power Soil DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories,Inc.，Carlsbad，CA，美國）提取DNA，取定量DNA 進(jìn)行梯度稀釋（1:10），然后對各梯度DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（3 個重復(fù)），記錄各梯度下擴(kuò)增條帶數(shù)目，由三管最大或然數(shù)表計算AOB、硝化桿菌(Nitrobacter)和硝化螺旋菌(Nitrospira)生物量。

利用引物amoA-1F 和amoA-2R 對amoA目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，利用Gel Extraction Kit（Omega，美國）回收，連接到PEGMT-easy T 載體上后，轉(zhuǎn)化到Trans 5α 感受態(tài)細(xì)胞里，在Amp+LB 瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選適量圓形白色菌落在500 μL Amp+LB 培養(yǎng)基里培養(yǎng)，委托中國科學(xué)院水生生物研究所分析測試中心測序，對測序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

由于Nitrobacter和Nitrospira是各生境主要的NOB 菌群[17-18]，因此只對這2 個屬進(jìn)行16S rRNA基因序列分析。Nitrobacter和Nitrospira的16S rRNA基因序列測定過程，除引物與AOB 的amoA基因測序不同外，其余步驟均相同。Nitrobacter和Nitrospira所使用的引物分別為FGPS 1 269/FGPS 872 和 NSR 113f/NSR 1264r。將測得的16S rRNA 基因序列分別進(jìn)行基因型分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同生境來源硝化細(xì)菌硝化速率差異

不同生境來源硝化細(xì)菌處理人工配制污水和實際生活污水時的硝化速率如圖1 所示。從圖1 可以看出，沉積物生境硝化細(xì)菌在處理人工配制污水和實際生活污水過程中，均表現(xiàn)出較高的效率，其硝化速率明顯高于土壤和市售生境。在處理人工配制污水時，沉積物生境硝化細(xì)菌的硝化速率達(dá)1.02 mg/(L·h)，而土壤和市售生境硝化細(xì)菌的硝化速率僅為0.36 和0.56 mg/(L·h)；在處理實際生活污水時，沉積物生境硝化細(xì)菌硝化速率為0.55 mg/(L·h)，同樣顯著高于土壤和市售生境的0.18 和0.14 mg/(L·h)。不僅如此，與處理人工配制污水相比，3 種生境硝化細(xì)菌處理實際生活污水的硝化速率均有不同程度的下降。市售生境硝化細(xì)菌的硝化速率從0.56 mg/(L·h)降至0.16 mg/(L·h)，降幅最大，達(dá)到71.4%；土壤生境硝化細(xì)菌次之，硝化速率從0.36 mg/(L·h)降至0.18 mg/(L·h)，降幅為50%；沉積物生境硝化細(xì)菌降幅最小，硝化速率從1.02 mg/(L·h)降至0.55 mg/(L·h)，降幅為46.1%。這表明，硝化細(xì)菌的活性易受外界環(huán)境條件的影響，污水水質(zhì)的變化則會導(dǎo)致硝化速率的改變；并且，不同生境中的硝化細(xì)菌對環(huán)境條件的適應(yīng)性不同，沉積物生境硝化細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性最高，硝化速率隨環(huán)境條件的改變波動較小，土壤生境次之，市售生境適應(yīng)性最低，硝化速率變化較大。這可能與它們的生存環(huán)境有關(guān)，沉積物生境受上覆水水質(zhì)頻繁波動的影響變化較大，土壤生境較為穩(wěn)定，而市售生境在人為調(diào)控作用下最為穩(wěn)定。在這些不同生境條件的長期影響下，沉積物生境硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及其對環(huán)境的適應(yīng)性要高于土壤和市售生境。

圖1 不同生境來源硝化細(xì)菌硝化速率差異性Fig.1 Differences in nitrification rates of nitrifying bacteria from different habitats

2.2 不同生境來源硝化細(xì)菌對環(huán)境因子適應(yīng)性差異

2.2.1氨氮初始濃度

不同生境來源硝化細(xì)菌硝化速率對氨氮初始濃度的響應(yīng)見圖2。從圖2 可以看出，沉積物和土壤生境硝化細(xì)菌的硝化速率隨氨氮初始濃度的升高變化趨勢相似，均呈先上升后下降的趨勢。主要原因是：氨氮作為硝化反應(yīng)的底物，當(dāng)其濃度升高時，促進(jìn)硝化反應(yīng)的進(jìn)行，硝化速率隨之增大；當(dāng)氨氮濃度超過一定水平后，游離氨濃度上升，對硝化細(xì)菌有一定的毒害作用，硝化細(xì)菌活性受到抑制，硝化速率隨之降低[19-21]。相比之下，市售生境硝化細(xì)菌的硝化速率隨氨氮初始濃度升高逐漸下降，表明稍高的氨氮初始濃度就會對市售硝化細(xì)菌活性產(chǎn)生抑制作用，該類硝化細(xì)菌對氨氮耐受力較差。沉積物生境硝化細(xì)菌耐受氨氮初始濃度的閾值為200 mg/L，低于此閾值時，硝化速率隨氨氮初始濃度增加快速上升，氨氮初始濃度每升高50 mg/L，硝化速率增加約0.15 mg/(L·h)；當(dāng)超過此閾值，硝化速率快速下降。土壤生境硝化細(xì)菌耐受氨氮初始濃度的閾值為150 mg/L，并且低于此閾值時，硝化速率隨氨氮初始濃度增加的變化趨勢不如沉積物生境明顯。這表明，沉積物生境硝化細(xì)菌耐受氨氮的能力高于土壤生境。

圖2 不同生境來源硝化細(xì)菌硝化速率對氨氮初始濃度的響應(yīng)Fig.2 Nitrification rate response of denitrifying bacteria from different habitats to initial ammonium concentrations

2.2.2環(huán)境溫度

溫度對硝化細(xì)菌活性及其生長繁殖均有較大影響。大量研究表明，硝化細(xì)菌的適宜生長溫度為15～35 ℃，當(dāng)溫度低于10 ℃時，硝化作用會受到抑制；高于20 ℃時，硝化細(xì)菌的活性較高，但超過38 ℃后硝化作用將會消失[22-23]。3 種生境來源硝化細(xì)菌的活性隨溫度升高的變化趨勢大體相同（圖3）。溫度低于10 ℃時，硝化速率較低；隨著溫度的上升，硝化速率逐漸增加；當(dāng)溫度升高至30 ℃左右時，硝化速率最高；當(dāng)溫度超過30 ℃后，硝化速率急劇下降。原因是硝化細(xì)菌的生物膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和核酸等活性容易受溫度的影響，主要體現(xiàn)在2 個方面：1）隨著環(huán)境溫度升高，硝化細(xì)菌體內(nèi)酶活性增強(qiáng)，促使體內(nèi)生化反應(yīng)加快，硝化活性提高；2）當(dāng)環(huán)境溫度超過一定范圍時，細(xì)胞中蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)將受到不可逆轉(zhuǎn)的破壞，硝化細(xì)菌活性急劇下降，甚至出現(xiàn)菌體死亡現(xiàn)象[24]。然而，3 種生境硝化細(xì)菌的硝化速率隨溫度的變化幅度存在明顯差異，沉積物生境硝化細(xì)菌的變化幅度明顯高于土壤和市售生境。如當(dāng)溫度從10 ℃升至20 ℃時，沉積物、土壤和市售生境硝化細(xì)菌的硝化速率增加幅度分別為0.70、0.24、0.34 mg/（L·h）；當(dāng)溫度從20 ℃升至30 ℃時，硝化速率增加幅度分別為1.33、0.47、0.02 mg/（L·h）。這主要是由硝化細(xì)菌生物量與種群組成的差異造成的。

圖3 不同生境來源硝化細(xì)菌硝化速率對環(huán)境溫度的響應(yīng)Fig.3 Nitrification rate response of denitrifying bacteria from different habitats to temperature

2.2.3環(huán)境pH

適宜硝化作用的pH 為7.0～8.0，而適宜AOB和NOB 生長的pH 分別為6.0～7.5 和7.0～8.5[25-26]。當(dāng)pH＞8.0 時，AOB 的生長受到抑制，硝化活性降低，硝化作用進(jìn)行緩慢；當(dāng)pH＜7.0 時，NOB 生長緩慢，硝化作用受到影響；pH 過高（＞ 9.0）或過低（＜6.0），硝化作用則會變得十分微弱[27]。不同生境硝化細(xì)菌活性隨pH 變化趨勢相似，即pH 為7.0～8.0 時，3 種生境硝化細(xì)菌均表現(xiàn)出較高活性；當(dāng)pH＜7.0 和pH＞8.0 時，硝化細(xì)菌活性受到抑制而降低（圖4）。pH 對硝化作用的影響主要通過以下3 種途徑實現(xiàn)：1）硝化細(xì)菌的活化與鈍化[28]。H+和OH-離子與硝化反應(yīng)所涉及酶的可逆性結(jié)合，導(dǎo)致酶的失活與活化，從而引起硝化細(xì)菌活性的改變。2）對無機(jī)碳源的影響[29]?？扇苄蕴妓猁}作為硝化細(xì)菌的無機(jī)碳源，其含量高低容易受到pH 的影響。當(dāng)pH 較低時，可溶性碳酸鹽轉(zhuǎn)化為CO2而逸出；當(dāng)pH 較高時，可溶性碳酸鹽則轉(zhuǎn)化為難溶性碳酸鹽，很難被硝化細(xì)菌吸收利用。3）游離氨、亞硝酸[30]以及重金屬[31-32]的抑制作用。能為硝化細(xì)菌提供能量的氨氮和亞硝態(tài)氮，當(dāng)以離子態(tài)NH3和HNO2存在時，對硝化細(xì)菌活性產(chǎn)生抑制作用。離子態(tài)NH3和HNO2濃度受pH 的影響較大。當(dāng)pH 較低時，HNO2濃度較高；當(dāng)pH 較高時，NH3濃度較高。因此，pH 過高或過低均會對硝化細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用。

圖4 不同生境來源硝化細(xì)菌硝化速率對環(huán)境pH 的響應(yīng)Fig.4 Nitrification rate response of denitrifying bacteria from different habitats to pH

雖然不同生境硝化細(xì)菌活性隨pH 變化趨勢相似，但在適宜的pH 范圍內(nèi)，各生境硝化細(xì)菌的硝化速率存在明顯差異（圖4）。pH 為7.0～8.0 時，沉積物生境硝化細(xì)菌硝化速率明顯高于土壤和市售生境，且與2.1 節(jié)的研究結(jié)果一致。另外，沉積物生境硝化細(xì)菌的硝化速率在pH 大于8.5 時開始快速下降；而土壤和市售生境硝化細(xì)菌在pH 為8.0 時，硝化活性就已經(jīng)開始表現(xiàn)出受抑制現(xiàn)象。這說明了沉積物生境硝化細(xì)菌耐受pH 的能力要稍高于土壤和市售生境。

2.2.4環(huán)境鹽度

當(dāng)生活在淡水中的微生物受到含鹽廢水的沖擊時，一般能通過調(diào)節(jié)自身的滲透壓來保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)。但鹽度過高時，微生物體內(nèi)的水分子則會大量滲透到體外，導(dǎo)致微生物自身細(xì)胞因發(fā)生質(zhì)壁分離而死亡。因此，污水鹽度的高低對微生物脫氮中硝化細(xì)菌的活性具有重要影響[33]。盡管各生境來源硝化細(xì)菌的活性均受鹽度的抑制，但沉積物生境硝化細(xì)菌表現(xiàn)出較高的耐鹽性（圖5）。當(dāng)鹽度大于10 g/L 時，沉積物生境硝化細(xì)菌活性受到明顯抑制，硝化速率大幅度下降，鹽度為15 g/L 時硝化速率較鹽度為10 g/L 下降約54%。而土壤和市售生境硝化細(xì)菌的活性在鹽度大于5 g/L 時就已經(jīng)開始受到明顯抑制，當(dāng)鹽度升至10 g/L 時，硝化速率分別下降42.8%和65.2%。這可能是因為沉積物生境硝化細(xì)菌種群組成中存在某些耐鹽性菌類。

圖5 不同生境來源硝化細(xì)菌硝化速率對環(huán)境鹽度的響應(yīng)Fig.5 Nitrification rate response of denitrifying bacteria from different habitats to salinity

2.3 各生境硝化細(xì)菌的MPN-PCR 計數(shù)

基于硝化細(xì)菌MPN-PCR 產(chǎn)物的電泳圖譜（圖6），經(jīng)由三管最大或然數(shù)表[34]計算得出，沉積物、土壤和市售生境AOB 的生物量分別為1.1×107、3.5×108、6.3×107個，Nitrobacter生物量分別為5×104、1.9×105、5×104個，Nitrospira生物量分別為5×104、2.3×104、7.5×103個。進(jìn)一步分析得知，土壤生境硝化細(xì)菌生物量（AOB 和NOB 的總生物量）最高，分別是沉積物和市售生境的31.8 和5.6 倍。但在種群結(jié)構(gòu)組成上，沉積物生境硝化細(xì)菌種群較為平衡，AOB 生物量約為NOB 的110 倍，而土壤和市售生境AOB 分別約為NOB 的1 600 和1 100 倍。另外，3 種生境NOB 的組成也存在差異（圖7），沉積物生境NOB 的Nitrobacter和Nitrospira較為均衡，各占約50%；而土壤和市售生境NOB 主要為Nitrospira，分別占各自NOB 的89.2%和87.0%。

圖6 不同生境來源硝化細(xì)菌MPN-PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.6 Agarose gel electrophoresis for MPN-PCR products of denitrifying bacteria from different habitats

圖7 Nitrobacter 和Nitrospira 在硝化細(xì)菌中所占比例Fig.7 Percentages of Nitrobacter and Nitrospira in nitrifying bacteria

2.4 AOB 的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測得的amoA基因序列構(gòu)建NJ（Neighbor-Joining）系統(tǒng)樹，如圖8 所示。從圖8 可以看出，沉積物、土壤和市售生境AOB 均屬于Nitrosospira和Nitrosomonas，符合二者具有廣布性的特點[35]。土壤Nitrosospira和Nitrosomonas主要集中在系統(tǒng)樹中的Cluster 1 和Cluster 7，而沉積物和市售生境AOB 在系統(tǒng)樹中的位置較為分散。這表明土壤生境AOB 的特異性較高，即AOB 多樣性低于沉積物和市售生境，這可能是由生存環(huán)境穩(wěn)定性差異引起的。由于上覆水水質(zhì)頻繁波動的影響，沉積物生境硝化細(xì)菌的生存環(huán)境變異性要高于土壤生境，導(dǎo)致沉積物生境AOB 多樣性較高；市售生境硝化細(xì)菌的多樣性較高，有可能是其最初來源的自然生存環(huán)境條件的不穩(wěn)定所致。雖然Nitrosospira和Nitrosomonas均存在于沉積物、土壤和市售等生境中，但其在各生境AOB 的相對組成上存在差異（圖9）。在沉積物生境中，Nitrosomonas是AOB 的主要組成部分，約占81.6%，為優(yōu)勢屬，Nitrosospira僅占18.4%；在土壤和市售生境AOB 組成中，Nitrosospira與Nitrosomonas所占比例相當(dāng)，分別占AOB 生物量的47.1%和52.9%、49.0%和51.0%。有報道稱[36]，Nitrosomonas能耐受較低濃度的氧氣，即使在厭氧條件下，Nitrosomonas仍可達(dá)到總細(xì)菌生物量的1/4，這可能是在缺氧的沉積物環(huán)境中，Nitrosomonas在AOB 中占比高于土壤和市售生境AOB 的主要原因。

圖8 基于amoA 基因序列所構(gòu)建的NJ 樹Fig.8 NJ tree of amoA genes

圖9 amoA 基因克隆子中Nitrosospira 和Nitrosomona 占比Fig.9 The abundances of Nitrosospira and Nitrosomona in amoA gene clones

2.5 NOB 的16S rRNA 基因序列

將Nitrobacter和Nitrospira所測得的16S rRNA基因克隆子序列進(jìn)行基因型分析，結(jié)果如表1 和表2所示。Nitrobacter基因型多樣性較高，114 個克隆子基因型可分為51 種，其中沉積物生境39 個克隆子有18 種基因型，土壤生境38 個克隆子有18 種基因型，市售生境37 個克隆子有21 種基因型。這表明在沉積物、土壤和市售這3 種生境中Nitrobacter多樣性相似，種類較多?；蛐?、2、3 的Nitrobacter在這3 種生境中均存在，為廣布菌，其中基因型1 的Nitrobacter為優(yōu)勢菌，克隆子數(shù)約占總克隆子數(shù)的28.1%，基因型2 的Nitrobacter為次優(yōu)勢菌，占比為13.2%。沉積物、土壤和市售生境Nitrobacter結(jié)構(gòu)組成上存在一定的差異。沉積物生境中，基因型1 和基因型2 的Nitrobacter占主要優(yōu)勢；土壤和市售生境中，多種基因型的Nitrobacter并存。沉積物、土壤和市售生境中Nitrospira多樣性較低，94 個克隆子僅有8 種基因型?；蛐? 占比最高，達(dá)91.5%，并且在3 種生境中均廣泛存在。這表明，基因型1 細(xì)菌是沉積物、土壤和市售生境中Nitrospira的廣布菌和絕對優(yōu)勢菌，相比于其他基因型的Nitrospira，它在硝化反應(yīng)中可能起著最為重要的作用。綜上，3 種生境的Nitrospira種群結(jié)構(gòu)相似，都是由1 種主要的細(xì)菌（基因型1）和少量其他種類的細(xì)菌組成。

表1 各生境中Nitrobacter 的基因型分析Table 1 Genotype analysis of Nitrobacter from different habitats

硝化細(xì)菌的種群組成和豐度影響著硝化速率的大小[37]。在眾多生境中，NOB 的生物量是AOB 的3～30 倍，這是因為NOB 的底物是AOB 的產(chǎn)物，NOB 在生物量上的優(yōu)勢能夠保證硝化反應(yīng)的順利進(jìn)行，避免由于積累對硝化細(xì)菌帶來的毒害作用[38-39]。本研究中，3 種生境AOB 生物量均高于NOB，這可能與實驗室內(nèi)硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)條件與其自然生存環(huán)境條件的不同有關(guān)。在實驗室內(nèi)富集時，硝化反應(yīng)產(chǎn)物不能即時消除而不斷積累，對NOB 的生長產(chǎn)生抑制作用，造成NOB 生物量低于AOB；而在硝化細(xì)菌自然生存環(huán)境中，能通過反硝化過程和水生生物直接吸收等途徑來消除。因此，在本試驗中，由于生物量的不均衡，NOB 對各反應(yīng)器的硝化效率起著決定性影響。大量研究表明[40-41]，Nitrospira是污水處理系統(tǒng)、生物反應(yīng)器以及淡水養(yǎng)殖塘中起主要作用的NOB。對Nitrospira克隆子基因型分析已知（表2），沉積物、土壤和市售生境Nitrospira組成結(jié)構(gòu)相似，即由1 種優(yōu)勢菌和少量其他種類硝化細(xì)菌組成，但生物量存在差異，即沉積物生境Nitrospira的生物量高于土壤和市售生境。有可能是該原因?qū)е鲁练e物生境硝化細(xì)菌的硝化速率要高于土壤和市售生境，因此，在處理人工配制污水和實際生活污水時，沉積物生境硝化細(xì)菌的硝化速率明顯高于土壤和市售生境（圖1）。

表2 各生境中Nitrospira 基因型分析Table 2 Genotype analysis of Nitrospira from different habitats

Nitrospira對游離氨的敏感性高于Nitrobacter[42]。當(dāng)氨氮初始濃度較高時，游離氨濃度隨之升高，Nitrospira活性受到抑制。此時，Nitrobacter取代Nitrospira成為硝化過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)菌，這就意味著Nitrobacter的種群組成和豐度影響著整個硝化反應(yīng)的速率。由于土壤生境Nitrobacter生物量明顯高于沉積物和市售生境，理論上，土壤生境硝化細(xì)菌的硝化速率受氨氮初始濃度影響較小，即耐受氨氮的性能較好。但實際上，沉積物生境硝化細(xì)菌耐受氨氮的能力高于土壤和市售生境（圖3）。這可能是由各生境中Nitrobacter種群組成不同引起的。在沉積物生境中，基因型1 和基因型2 的Nitrobacter占比高于土壤和市售生境（表1）。據(jù)此推測，基因型1 和基因型2 的Nitrobacter在整個Nitrobacter屬中起著主要的作用。利用Blast 程序進(jìn)行序列比對得出，基因型1 和基因型2 的Nitrobacter均為不可培養(yǎng)微生物，需采取其他方法做進(jìn)一步研究。pH 主要通過引起硝化細(xì)菌的活化與鈍化，對無機(jī)碳源的影響，借助游離氨的抑制作用等多種途徑來影響硝化作用，但通過游離氨的抑制作用被認(rèn)為是最主要的途徑[29]。沉積物生境硝化細(xì)菌對游離氨耐受能力高于土壤和市售生境，相應(yīng)地，沉積物生境硝化細(xì)菌對pH 的耐受能力也高于土壤和市售生境，這與pH 對各生境硝化細(xì)菌影響的試驗結(jié)果（圖4）相一致。

在特殊環(huán)境條件的長期影響下，淡水水體中的部分硝化細(xì)菌種類具有耐受高鹽度的能力。以AOB 為例，人們已從污水處理廠和富營養(yǎng)化淡水中分離出耐鹽或適度嗜鹽的Nitrosomonas europaea和N.eutropha[43]。對amoA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)（圖8），土壤生境硝化細(xì)菌種群中存在耐鹽或適度嗜鹽的Nitrosomonas europaea和不耐鹽的Nitrosomonasoligotropha，沉積物和市售生境硝化細(xì)菌種群中只鑒定出不耐鹽的Nitrosomonas oligotropha，而沉積物生境硝化細(xì)菌的耐鹽性高于土壤和市售生境（圖5）?？赡苁浅练e物生境硝化細(xì)菌種群中存在更為豐富的不可培養(yǎng)耐鹽度種類，需利用其他生物學(xué)方法做進(jìn)一步分析。

3 結(jié)論

（1）沉積物生境硝化細(xì)菌的硝化速率高于土壤和市售生境，這主要是因為沉積物生境中Nitrospira生物量較高。

（2）沉積物生境硝化細(xì)菌耐受氨氮、pH 和鹽度等環(huán)境因子的能力高于土壤和市售生境，這是因為沉積物生境硝化細(xì)菌群落中存在Nitrobacter和可能存在耐鹽或適度嗜鹽種類（有待利用其他生物學(xué)方法進(jìn)一步分析、確定）。

（3）微生物脫氮工藝所需的硝化細(xì)菌可考慮從沉積物中富集、篩選，以獲取硝化效率高且環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)的菌種。