趙磊，趙艷，馬彧※，姜大成

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）又稱(chēng)為北蟲(chóng)草、北冬蟲(chóng)夏草，隸屬于真菌界麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲(chóng)草屬，是世界性廣布種，我國(guó)各省區(qū)均有分布。人工蛹蟲(chóng)草為從天然蛹蟲(chóng)草[Cordyceps militaris（L.et.Fr.）Link]中分離得到的菌種擬青霉（Paecilomyces militaris）經(jīng)人工培養(yǎng)所獲得的子實(shí)體[1]。蛹蟲(chóng)草性平，味甘，歸肺、腎經(jīng)，有補(bǔ)肺益腎的功效，用于癆嗽痰血、自汗、盜汗、陽(yáng)痿、遺精、腰膝酸痛及乏力等[2]。蛹蟲(chóng)草和冬蟲(chóng)夏草化學(xué)成分具有較大的相似性，含量較高的成分有尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷，還含有蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷等特有核苷類(lèi)成分[3,4]。N6-（2-羥乙基）腺苷具有抗腫瘤和改善睡眠等作用，蟲(chóng)草素具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等作用[5]。目前，蛹蟲(chóng)草無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，地方標(biāo)準(zhǔn)遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)（2019年版）及吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)（2019年版）有收載，測(cè)定成分均為蟲(chóng)草素[6,7]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷是蛹蟲(chóng)草中含量最高的成分。

“一測(cè)多評(píng)法”為測(cè)定某個(gè)代表性成分作為一種對(duì)多指標(biāo)質(zhì)量控制的有效方法[8-12]，本實(shí)驗(yàn)采用以腺苷作為內(nèi)標(biāo)物為對(duì)照品，建立其他4種核苷類(lèi)的的相對(duì)校正因子進(jìn)行含量計(jì)算，并進(jìn)行方法學(xué)考察，用以驗(yàn)證QAMS法在蛹蟲(chóng)草多指標(biāo)質(zhì)量控制中優(yōu)勢(shì)[13-17]。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司；高效液相色譜儀：LC-2010型，配二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司；高效液相色譜儀：2695型，配二極管陣列檢測(cè)器，沃特世公司；電子天平：QUINTIX313-1CN型，分度值為萬(wàn)分之一，Sartorius公司；電子天平：MSE125S型，分度值為十萬(wàn)分之一，Sartorius公司；超聲波清洗器：KQ-500DV型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；去離子水發(fā)生器：Milli-Q型，密理博公司。

蛹蟲(chóng)草藥材購(gòu)自廣東、江西、浙江、天津規(guī)定樣品編號(hào)為（YP1~YP8），經(jīng)趙磊副主任藥師鑒定為蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）；尿苷（批號(hào)110887-200202）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)111977-201501）和腺苷（批號(hào)110879-200202）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；蟲(chóng)草素（批號(hào)110858-201503）和N6-（2-羥乙基）腺苷（批號(hào)H29A7R13918）由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供，純度≥98.0%；甲醇和乙腈為色譜純，F(xiàn)isher公司；水為超純水。

1.2 溶液的制備

1.2.1 混合對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取5種核苷類(lèi)對(duì)照品適量，加20%甲醇制成每1 mL含尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素和N6（-2-羥乙基）腺苷分別為246.0g、237.5g、257.0g、251.5g和249.0g的標(biāo)準(zhǔn)母液。分別取對(duì)照品母液適量，加20%甲醇繼續(xù)稀釋成24.60g、23.75g、25.70g、25.15g和24.90g濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取0.2 g的蛹蟲(chóng)草樣品粉末，精密加入10mL的20%甲醇超聲處理30min，超聲后補(bǔ)重處理，取續(xù)濾液，即得。

1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性

圖1 混合對(duì)照品（A）及蛹蟲(chóng)草樣品（B）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of the mixed reference substance(A)and cordyceps militaris sample(B)

2 結(jié)果

2.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取各對(duì)照品母液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL及2.0mL置于10 mL量瓶中，稀釋至刻度，作為待測(cè)混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量各5L，注入液相色譜儀，測(cè)定，以各混合對(duì)照品的質(zhì)量濃度（g mL-1）作為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各被測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、線(xiàn)性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 1 The standard curve equation,linear range and correlation coefficient of each measured component

結(jié)果表明5種核苷類(lèi)成分在相應(yīng)線(xiàn)性范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品粉末（YP1）6份，每份0.2 g，精密稱(chēng)定，按照供試品溶液制備方法制備，采用上述色譜方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果5種核苷類(lèi)的測(cè)定結(jié)果RSD（n=6）均小于1.02%，表明重復(fù)性良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

?。╕P1）樣品粉末6份，取樣量約0.1 g，精密加入1mL的質(zhì)量濃度分別為62.5g mL-1、51.2g mL-1、82.5g mL-1、130.3g mL-1和71.5g mL-1的尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素和N6（-2-羥乙基）腺苷對(duì)照品溶液，每份分別精密加入20%甲醇5 mL，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果樣品中尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷平均回收率（n=6）均在97.35%~101.25%范圍內(nèi)，RSD分別小于1.86%。說(shuō)明回收率良好。

2.5 校正因子重現(xiàn)性考察

2.5.1 HPLC色譜儀及色譜柱考察試驗(yàn)考察采用安捷倫1260型、島津LC 2010AHT型和Waters 2695型3臺(tái)液相色譜儀。采用色譜柱為Waters ACQUITY HSS T3 C1（84.6 mm 250 mm,5m）、島津InertSustain AQC1（84.6 mm 150 mm,5m），安捷倫ZOBAX SB-AQ柱（4.6 mm 150 mm,5m）考察相對(duì)校正因子：相對(duì)校正因子的公式為：

式中As為待測(cè)成分s的峰面積，Cs為質(zhì)量濃度；Ai為內(nèi)參物i的峰面積，Ci為質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在不同的色譜柱及高效液相色譜儀中具有較好的重現(xiàn)性，能夠用于尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷的含量測(cè)定。

表2 不同HPLC色譜儀及色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子Table 2 relative correction factors measured by the different HPLC chromatographs and columns

2.5.2 5種核苷類(lèi)色譜峰的定位采用5種待測(cè)成分間的相對(duì)保留值（待測(cè)成分與內(nèi)參物調(diào)整保留時(shí)間之比）作為定位標(biāo)準(zhǔn)，并在不同HPLC色譜儀、不同廠(chǎng)家的色譜柱進(jìn)行考察。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，在采用節(jié)省標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下，利用相對(duì)保留值進(jìn)行色譜峰定位，可采用內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間，結(jié)合其他色譜峰在260 nm下的紫外吸收特征及相對(duì)保留值，可以確定需要測(cè)定峰的位置。因此選用相對(duì)保留值這一參數(shù)作為蛹蟲(chóng)草中尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷目標(biāo)色譜峰的定位指標(biāo)比較合理。結(jié)果表明，不同儀器和色譜柱下各成分間的相對(duì)保留值波動(dòng)較小，RSD在1.20%~3.20%，見(jiàn)表3。

表3 不同HPLC色譜儀器與色譜柱下目標(biāo)成分的相對(duì)保留值Table 3 Relative retention values of target components under different HPLC chromatographic instruments and chromatographic columns

2.6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法的結(jié)果比較

取蛹蟲(chóng)草約0.2 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液制備方法及上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算蛹蟲(chóng)草中尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷含量，見(jiàn)表4。采用SPSS19.0軟件分析兩種方法的尿苷、鳥(niǎo)苷、蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷含量之間的Pearson系數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明兩法所測(cè)的含量相似度極高，QAMS法在蛹蟲(chóng)草中核苷中的應(yīng)用是可行的。兩種方法所得的各批次藥材的含量間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差亦在3%以?xún)?nèi)，表明測(cè)定方法上不存在顯著性差異。

表4 QAMS及外標(biāo)法測(cè)定蛹蟲(chóng)草中5種核苷的含量（n=2,mg·g-1）Table 4 Determination of five nucleosides in Cordyceps militaris by QAMS and the external standard method(n=2,mg·g-1)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

考察了水、20%、50%和100%的甲醇作為提取溶劑，含量結(jié)果差別不大，但色譜峰形有差異，選擇20%甲醇作為提取溶劑效果最佳。提取時(shí)間采用超聲20min、30 min和40 min，結(jié)合文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果30 min提取效果最佳。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

對(duì)5種測(cè)定成分經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器分析，因5種化合物均為核苷類(lèi)成分，結(jié)構(gòu)相似，其紫外吸收峰相似，5種核苷類(lèi)的吸收波長(zhǎng)分別在254~268 nm之間，結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定及文獻(xiàn)考量，選用260 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 校正因子的考察

為了驗(yàn)證所建立的尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷成分的一測(cè)多評(píng)法的適用性及可行性，本研究進(jìn)行了方法學(xué)考察以及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。通過(guò)在3臺(tái)液相色譜儀和3個(gè)不同品牌及型號(hào)的色譜柱的考察，結(jié)果表明尿苷、鳥(niǎo)苷、蟲(chóng)草素和N6-（2-羥乙基）腺苷含量與腺苷之間的相對(duì)校正因子具有良好的重現(xiàn)性。本研究首次將一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用于蛹蟲(chóng)草的質(zhì)量評(píng)價(jià)中，該法所得5種主要核苷類(lèi)成分含量與外標(biāo)法所測(cè)得含量之間沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明一測(cè)多評(píng)法可作為蛹蟲(chóng)草質(zhì)量控制的有效方法之一，并具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、成本較低的優(yōu)點(diǎn)。QMAS法與外標(biāo)法對(duì)測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)法更具有測(cè)定優(yōu)勢(shì)。