文/劉艷麗 呂惠蓉 李海東 高陽

溫度是影響機(jī)體生長(zhǎng)的重要因子。有研究表明溫度通過影響消化和代謝等，進(jìn)而影響機(jī)體存活與生長(zhǎng)。腸道是魚類重要消化器官，定植著豐富的微生物群落，溫度會(huì)對(duì)腸道微生物產(chǎn)生直接影響。如全紫嬌等在研究不同溫度條件下養(yǎng)殖刺參的腸道菌群結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)菌群在不同溫度下占刺參腸道菌群的比例互不相同。石萍等在研究溫度驟變對(duì)日本醫(yī)蛭腸道菌群的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度變化時(shí)主導(dǎo)菌多樣性組成及豐度會(huì)產(chǎn)生變化，進(jìn)而影響其生存狀態(tài)。溫度密切影響機(jī)體及其腸道微生物群落，然而在有關(guān)溫度對(duì)水生物腸道菌群產(chǎn)生影響的研究中，較少見到溫度與大鱗副泥鰍腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的關(guān)系研究。本研究旨在分析不同溫度下大鱗副泥鰍腸道菌群多樣性的變化及其原因，以期為其合理養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用魚來源于舟山某公司。在正式實(shí)驗(yàn)前，將泥鰍暫養(yǎng)7d，保持養(yǎng)殖水溫為20℃，每日采用商業(yè)飼料對(duì)其進(jìn)行兩次（8:00和18:00）飽食投喂。暫養(yǎng)結(jié)束后，選取體格健壯、活力較強(qiáng)、大小均勻（15.4±0.7）g的個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)。將180尾泥鰍隨機(jī)分成三組，分別標(biāo)記為高溫組（G1）、對(duì)照組（F）和低溫組（G2），對(duì)應(yīng)水溫分別為28℃、20℃和12℃，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾，分別置于9個(gè)20L塑料水箱中養(yǎng)殖。通過加熱棒和冷水機(jī)來控制溫度，實(shí)驗(yàn)時(shí)間持續(xù)14d，每天換水1/4。實(shí)驗(yàn)期間水體pH為6.5～7.5，溶氧含量為6.1mg/L～7.3mg/L，每日對(duì)其飽食投喂兩次。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食24h，從每個(gè)平行組中隨機(jī)取5條泥鰍作為樣本，利用MS-222浸泡法進(jìn)行麻醉，使用70%乙醇擦拭泥鰍體表消毒。取樣時(shí)采用無菌操作，沿泥鰍體側(cè)剪開并將腸道完整分離，再將其腸道表面的黏液和脂肪分離完畢，后擠出腸道內(nèi)容物，放入干凈的離心管中，保存于-80℃冰箱內(nèi)。

2.提取DNA及PCR擴(kuò)增

在各處理組的3個(gè)重復(fù)組里分別取3條泥鰍腸道樣品，混合研磨提取DNA，最終將DNA提取物混合并保存于1.5mL離心管中。對(duì)DNA樣品進(jìn)行濃度和質(zhì)量的驗(yàn)證，確保滿足后續(xù)操作要求。擴(kuò)增DNA片段時(shí)，程序如下：預(yù)變性94℃，3min，變性94℃，20s；退火55℃，20s；復(fù)性72℃，30s，變性、退火、復(fù)性共25次循環(huán)，72℃終延伸5min。二輪擴(kuò)增中引入兼容的Illumina PCR引物后，進(jìn)行（95℃，30s；95℃，15s；55℃，15s；72℃，30s；72℃，5min）共5次循環(huán)。PCR反應(yīng)體系10.0μL：10×PCR Buffer 5.0μL，dNTPs（10mmol/L）0.5μL，上、下游引物各（50μmol/L）0.5μL，Plantium Taq（5U/μL）0.5μL，DNA模板10.0ng，加滅菌水補(bǔ)足至10.0μL。

3.Illumina MiSeq測(cè)序

將擴(kuò)增得到的樣品送到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序前通過瓊脂糖凝膠提取PCR產(chǎn)物，使用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)深度測(cè)序時(shí)，根據(jù)說明書進(jìn)行操作，通過Qubit 2.0檢測(cè)試劑定量檢測(cè)被提取出來的DNA。

4.數(shù)據(jù)處理

利用prinseq進(jìn)行質(zhì)量控制，以過濾掉樣品中可能會(huì)混雜的其它物質(zhì)，過濾后使用Flash進(jìn)行序列拼接。利用uclust在97%相似度下進(jìn)行聚類，并與OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)。采用Mothur軟件進(jìn)行α多樣性分析，包括Chao1豐富度指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)、稀釋性曲線。使用qiime、R語言和SPSS 23.0軟件計(jì)算并分析以上數(shù)據(jù)，方便對(duì)樣品間菌群結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行比較分析。

二、結(jié)果與分析

（一）物種相似度分析

對(duì)不同溫度控制下的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行分析，研究溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍腸道菌群的影響，利用Venn圖分析高溫組、對(duì)照組和低溫組菌群間的物種相似度。結(jié)果顯示（見圖1），三組實(shí)驗(yàn)對(duì)象腸道菌群總OTUs數(shù)為9321，共有的OTUs數(shù)為824，占所有OTUs數(shù)的8.80%，此外，F(xiàn)組特有OTUs數(shù)為2773，占所有OTUs數(shù)的29.75%；G1組特有OTUs數(shù)為2035，占所有OTUs數(shù)的21.83%；G2組特有OTUs數(shù)為2262，占所有OTUs數(shù)的24.27%。F組的大鱗副泥鰍腸道菌群OTUs數(shù)為4645，高于另外兩組的OTUs數(shù)，且大多數(shù)OTUs是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的序列。這說明溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍腸道的菌群組成有一定影響。

圖1 Venn圖顯示出高溫組、低溫組和對(duì)照組各有和共有的OTUs數(shù)

（二）溫度脅迫對(duì)泥鰍腸道菌群多樣性的影響

Alpha多樣性分析表明G1、G2組微生物豐富度相比F組低（見圖2）。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)可以估計(jì)大鱗副泥鰍腸道的菌群豐度，圖2A、B顯示F組中ACE和Chao1估計(jì)值最高，表明生活在20℃環(huán)境下大鱗副泥鰍的腸道菌群豐富度比12℃、28℃組高；Shannon指數(shù)的稀釋性曲線可以估計(jì)樣本的群落多樣性，指數(shù)越大代表群落多樣性越高，圖2C中顯示從小于5000個(gè)序列的位置開始趨向于水平，并且，明顯可以看出F組Shannon指數(shù)高于其他兩組；Simpson指數(shù)越小代表群落多樣性越高，圖2D顯示F組的Simpson指數(shù)低于另外兩組，這一結(jié)果同Shannon指數(shù)估計(jì)結(jié)果一致，同樣說明F組大鱗副泥鰍擁有最高的腸道菌群群落多樣性。

圖2 指數(shù)稀釋性曲線

（三）菌群結(jié)構(gòu)分析

1.基于門水平上的菌群結(jié)構(gòu)

根據(jù)菌群結(jié)構(gòu)分析（見圖3），可得到門水平上不同溫度下大鱗副泥鰍的菌群分布（見表1），結(jié)果顯示，三組實(shí)驗(yàn)對(duì)象腸道中厚壁菌門的OTUs數(shù)非常穩(wěn)定，其豐富度幾乎不隨外界溫度變化而變化。不同溫度下大鱗副泥鰍的腸道菌群中有相同的次優(yōu)勢(shì)菌群：厚壁菌門、擬桿菌門，但優(yōu)勢(shì)菌群卻不盡相同，軟壁菌門大量出現(xiàn)在G2組，而在其余兩組中占比極小，F(xiàn)組和G1組中優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門，相對(duì)占比分別為62.23%和52.16%，即20℃環(huán)境下大鱗副泥鰍腸道菌群中變形菌門豐富度最高。

表1 基于門水平上不同溫度下大鱗副泥鰍的腸道菌群分布

圖3 門水平上各組不同菌群的分布圖

2.基于屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)及聚類分析

根據(jù)菌群結(jié)構(gòu)屬水平上的聚類分析（見圖4）得到屬水平上不同溫度下各組優(yōu)勢(shì)菌屬分布情況（見表2）。結(jié)果顯示，菌群結(jié)構(gòu)受溫度影響，不同溫度下大鱗副泥鰍的腸道菌群在屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異，F(xiàn)組、G1組和G2組優(yōu)勢(shì)菌屬各不相同，分別為沙雷氏菌屬（）、不動(dòng)桿菌屬（）、脲原體屬（），而乳桿菌屬（）、乳球菌屬（）和芽孢桿菌屬（）在三組中都有分布。

表2 基于屬水平上不同溫度下大鱗副泥鰍的腸道菌群分布

圖4 屬水平上各組不同菌群的分布圖

圖5A為基于屬水平上F組泥鰍腸道菌群豐度最高的前十類菌群結(jié)構(gòu)與G1組的對(duì)比情況（＜0.05），在變形菌門中，F(xiàn)組的沙雷氏菌屬數(shù)量多于G1組，而G1組中不動(dòng)桿菌屬和氣單胞菌屬數(shù)量明顯多于F組，兩組中同屬厚壁菌門的乳酸球菌屬和明串珠菌屬占比十分相近。圖5B為基于屬水平上F組泥鰍腸道菌群豐度最高的前十類菌群結(jié)構(gòu)與G2組的對(duì)比情況（＜0.05），沙雷氏菌屬在F組相較G2組占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，F(xiàn)組中不動(dòng)桿菌屬和氣單胞菌屬的數(shù)量也明顯少于G2組，而貪嗜菌屬、乳酸球菌屬及明串珠菌屬在兩組中數(shù)量差異不大，這一結(jié)果與F組和G1組對(duì)比趨勢(shì)相同。圖5C為基于屬水平上G1組泥鰍腸道菌群豐度最高的前十類菌群結(jié)構(gòu)與G2組的對(duì)比情況（＜0.05），G1組中念珠菌屬和嗜纖維細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于G2組，而G2組中酸土單胞菌屬占比遠(yuǎn)大于G1組。三組中菌群結(jié)構(gòu)的分布差異也說明溫度對(duì)大鱗副泥鰍的腸道菌群分布具有一定影響。

圖5 屬水平上F組、G1組和G2組菌群結(jié)構(gòu)兩兩對(duì)比情況

三、討論

本文研究了三組不同溫度（28℃、20℃和12℃）下大鱗副泥鰍的腸道菌群結(jié)構(gòu)，檢測(cè)到F組泥鰍的腸道菌群OTUs高于另外兩組，且大多數(shù)OTUs是變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的序列。泥鰍腸道菌群Alpha多樣性結(jié)果顯示，F(xiàn)組的ACE和Chao1指數(shù)和Shannon、Simpson指數(shù)相較G1、G2組更高，表明不同溫度會(huì)影響泥鰍腸道內(nèi)微生物群落的定植，改變腸道菌群的豐度和多樣性。Huyben等研究發(fā)現(xiàn)水溫的升高改變了虹鱒魚腸道菌群的菌群多樣性和豐度。Fontaine等在研究中發(fā)現(xiàn)蠑螈腸道菌群的Shannon指數(shù)在20℃環(huán)境下要比10℃、15℃環(huán)境下低8.3%，認(rèn)為溫度升高會(huì)使其腸道菌群多樣性降低。在本研究中，20℃環(huán)境下泥鰍腸道菌群多樣性相比其他兩組更高，這可能和物種適宜生存溫度相關(guān)。

本研究分析得出，F(xiàn)組和G1組大鱗副泥鰍腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門，且三組研究對(duì)象的次優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門。這與管婷婷等相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)泥鰍幼魚腸道中變形菌門均占優(yōu)勢(shì)地位的結(jié)果一致。G2組中軟壁菌門的數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢(shì)，說明溫度變低可能會(huì)使變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門在定植位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)上失去優(yōu)勢(shì)。變形菌門中的沙雷氏菌屬存在于各組泥鰍腸道內(nèi)，在自然界中也廣泛存在，是水中常居菌群，但此研究中顯示沙雷氏菌屬只在F組中屬于優(yōu)勢(shì)菌群，在G2組中極少存在，表明在相對(duì)低溫下泥鰍腸道菌群結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，溫度會(huì)影響沙雷氏菌屬的定植。同時(shí)，變形菌門的氣單胞菌屬在各組中的占比存在差異，即氣單胞菌屬在F組和G1組中占比較少，而在G2組中占比最多。氣單胞菌屬是一種革蘭氏陰性的兼性厭氧菌，且多數(shù)已經(jīng)被鑒定為魚類、兩棲類等一些動(dòng)物的致病菌。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，G1組擬桿菌門數(shù)量明顯高于其余兩組，擬桿菌門的優(yōu)勢(shì)菌群為黃桿菌屬，黃桿菌屬中的多數(shù)成員為條件致病菌。因此，根據(jù)研究結(jié)果，我們認(rèn)為高溫和低溫可能會(huì)使致病菌豐度增加，影響機(jī)體的存活，這對(duì)研究通過控制養(yǎng)殖水溫防控大鱗副泥鰍的細(xì)菌性疾病提供了一定的理論支持。

本研究中厚壁菌門在各組分布差異并不明顯，在各組的主要屬為乳酸菌屬、芽孢桿菌屬。乳酸菌包括乳桿菌屬、乳球菌屬等菌屬，存在于很多魚類腸道內(nèi)，可以將碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸，降低腸道pH，而偏酸性的腸道環(huán)境是抑制大多數(shù)致病菌的重要因素?？梢娙樗峋軐?duì)魚類腸道起到保護(hù)作用，能夠增強(qiáng)水生動(dòng)物的抗菌能力，是一種有益菌。芽孢桿菌屬可以對(duì)多種細(xì)菌和真菌等病原體發(fā)揮體外拮抗或抑制作用，產(chǎn)生消化酶，激活生長(zhǎng)因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)水生動(dòng)物的免疫力。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)各組中乳酸菌屬和芽孢桿菌屬的占比相差不大，表示溫度可能對(duì)這兩個(gè)菌屬的定植影響較小，但研究結(jié)果對(duì)配制和開發(fā)促進(jìn)泥鰍生長(zhǎng)及免疫的有益菌劑人工飼料等有一定啟示作用，需要進(jìn)一步探究。

四、結(jié)論

溫度脅迫對(duì)大鱗副泥鰍腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，高溫或者低溫可能會(huì)使腸道內(nèi)有害致病菌豐度增加，破壞腸道菌群的平衡狀態(tài)，致使機(jī)體健康受到影響。在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，相比較12℃和28℃，當(dāng)養(yǎng)殖水溫為20℃時(shí)，大鱗副泥鰍腸道菌群的構(gòu)成最有利于維持泥鰍腸道整體健康。