鄭柳怡， 甘海寧， 黃丹娥， 李茹月， 楊九妹， 陳玉興*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省第二中醫(yī)院，廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095)

動脈粥樣硬化是以脂質(zhì)代謝紊亂為疾病基礎(chǔ)的一種心血管疾病，發(fā)病率高，死亡率高，2015年起全球有1/3人口死于動脈粥樣硬化等心血管疾病[1]。肝臟是脂質(zhì)代謝的主要場所，當攝入膽固醇過多時，肝臟無法將其完全代謝，膽固醇沉積在肝臟并誘導(dǎo)肝臟炎癥發(fā)生，且多余膽固醇會隨著血液循環(huán)沉積在動脈壁中，形成斑塊[2]。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運已然成為治療動脈粥樣硬化的新思路。在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程中，肝X受體(liver X receptors, LXRs)是關(guān)鍵的核受體轉(zhuǎn)錄因子，它將脂質(zhì)代謝和炎癥的關(guān)鍵信號節(jié)點連接起來[3]，已有研究證明激活LXR的表達可促進巨噬細胞膽固醇流出，有效緩解炎癥以治療動脈粥樣硬化[4]。銀藍調(diào)脂膠囊由銀杏葉、絞股藍、化橘紅以及蜂膠組成，已有實驗證明銀藍調(diào)脂膠囊能夠降低血清TG、TC等血脂水平，具有調(diào)節(jié)高血脂癥的作用[5]，本實驗將基于LXR信號通路繼續(xù)探討銀藍調(diào)脂膠囊抗動脈粥樣硬化疾病的作用機制。

1 材料

1.1 動物 C57BL/6小鼠、ApoE-/-小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.2 試劑與藥物 辛伐他汀片(美國默沙東公司，批號L043451)。銀藍調(diào)脂膠囊，由化橘紅、銀杏葉、絞股藍和蜂膠組成，化橘紅、銀杏葉和絞股藍三藥經(jīng)水煎2次濃縮至0.75 g/mL，再經(jīng)50%乙醇沉淀并真空干燥得到約15%的干浸膏，取酒制蜂膠和干浸膏，粉碎，過篩，加入藥用淀粉適量，混勻，干壓制粒，裝入膠囊，即得，由廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研宄院制劑室生產(chǎn)，批號20170727，使用時按照給藥劑量用去離子水配置成所需的藥液。氧化型低密度脂蛋白試劑盒(ox-LDL)(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號462180831)；總膽固醇試劑盒(TC)、甘油三酯試劑盒(TG)、低密度脂蛋白試劑盒(LDL-C)(南京建成生物工程研究所，批號20180805、20190704、20190703)；Trizol RNA裂解液(美國英杰公司，批號20180107)；兔單克隆抗體(GAPDH)、肝X受體alpha抗體(LXRα)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子G5抗體(ABCG5)(美國Proteintech公司，批號A5441、14351-1-AP、27722-1-AP)；細胞色素P4507A1抗體(CYP7A1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抗體(iNOS)、山羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司，批號ab66153、ab191606、ab97051)；膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子1c抗體(SREBP-1c)(武漢云克隆科技股份有限公司，批號PAC868Mu01)。

1.3 儀器 Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀(美國Thermo公司)；5450型小型高速離心機(德國Eppendorf公司)；JJ3000型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；BSA2245型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；電泳儀、IQTM5型熒光定量PCR儀 (美國Bio-Rad公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)。

2 方法

2.1 劑量換算 銀藍調(diào)脂膠囊每粒含0.5 g粉，粉末含生藥量4.77 g/g，根據(jù)每天3次，每次4粒的服用量，得出人臨床生藥用量為28.6 g/d，參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中劑量換算方法“體表面積比”換算動物臨床等效劑量為含生藥量3.72 g/kg，作為銀藍調(diào)脂膠囊低劑量，臨床等效劑量2倍為銀藍調(diào)脂膠囊中劑量組(含生藥量7.44 g/kg)，4倍為銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組(含生藥量14.88 g/kg)。辛伐他汀片臨床劑量為80 mg/d，換算動物臨床等效劑量為10.40 mg/kg。

2.2 分組、造模與給藥 10只C57BL/6小鼠作為正常組，喂食普通飼料，50只ApoE-/-小鼠作為造模組，喂食高膽固醇鼠飼料(1%膽固醇，15%豬油，3%奶粉，5%雞蛋黃和76%普通飼料)，喂食12周后，將50只ApoE-/-小鼠隨機分成模型組，辛伐他汀片組(10.40 mg/kg)，銀藍調(diào)脂膠囊高(14.88 g/kg)、中(7.44 g/kg)、低(3.72 g/kg)劑量組，每組10只。各給藥組灌胃給予相對應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃給予等量去離子水，10 mL/kg，每天1次，連續(xù)灌胃給藥12周。給藥期間，正常組喂食普通飼料，其余各組持續(xù)喂食高膽固醇鼠飼料。末次給藥1 h后，各組小鼠均摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，取血清；取胸主動脈和肝臟左葉部分置于10%甲醛溶液中保存，其余部分肝臟于-80 ℃冰箱儲存。

2.3 ApoE-/-小鼠血清ox-LDL水平及胸主動脈脂質(zhì)斑塊面積的檢測 使用ELISA試劑盒，按照說明書步驟檢測血清ox-LDL水平。除去胸主動脈周圍脂肪，于10%甲醛固定48 h后脫水，隨后進行油紅O染色，利用Image-Pro Plus軟件定量分析胸主動脈血管壁上脂質(zhì)斑塊面積。

2.4 ApoE-/-小鼠肝臟TC、TG以及LDL-C水平的檢測 使用單試劑GPO-PAP法并通過酶標儀檢測肝臟TC、TG以及LDL-C水平。

2.5 ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)面積的檢測 將肝臟左葉部分組織固定48 h后，進行脫水、浸蠟、包埋，切片厚度為4 μm，隨后進行油紅O染色，從每個樣本中隨機選取3個200倍視野，利用Image-Pro Plus軟件定量分析肝臟脂質(zhì)面積。

2.6 RT-qPCR法檢測ApoE-/-小鼠肝臟ABCG5、SR-B1、iNOSmRNA表達 取肝臟組織，采用Trizol法提取肝臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)GenBank提供的基因序列設(shè)計特異性引物，引物設(shè)計利用Primer 5.0和Beacon Designer 7.91生物軟件，見表1，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，通過PCR儀檢測各基因的表達。

表1 RT-qPCR相關(guān)靶標基因引物序列

2.7 Western blot法檢測ApoE-/-小鼠肝臟中LXRα、ABCG5、SREBP-1c、CYP7A1、COX2和iNOS蛋白表達 取小鼠肝臟組織，充分剪碎，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，配平各蛋白樣品，加樣后進行SDS-PAGE電泳。將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h后，分別加入相應(yīng)的一抗，在4 ℃下過夜孵育，TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗，室溫搖床孵育1.5 h，TBST洗膜后于ECL暗室化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析，采用Image J軟件檢測出所得蛋白圖像的目標條帶以及相應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值，并計算蛋白表達，蛋白表達=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

3 結(jié)果

3.1 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠血清ox-LDL水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清ox-LDL水平升高(P<0.01)；與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組小鼠血清ox-LDL水平均有降低(P<0.01)；銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組兩兩比較，ox-LDL水平均無顯明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠血清ox-LDL水平的影響

3.2 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠胸主動脈脂質(zhì)斑塊面積的影響 與正常組比較，模型組小鼠主動脈脂質(zhì)斑塊面積增加(P<0.01)；與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組小鼠主動脈脂質(zhì)斑塊面積均減少(P<0.01)；銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組兩兩比較，主動脈脂質(zhì)斑塊面積均無明顯變化(P>0.05)，見表3。

表3 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠胸主動脈血管壁脂質(zhì)斑塊面積的影響

3.3 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠肝臟TC、TG、LDL-C水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01)；與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組小鼠肝臟TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.01)，中、低劑量組小鼠肝臟TC水平降低(P<0.05)，見表4。

3.4 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)面積的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟脂質(zhì)面積增加(P<0.01)；與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組肝臟脂質(zhì)面積均減少(P<0.01)，且高劑量組減少肝臟脂質(zhì)面積更顯著(P<0.01)，見表5。

表4 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠肝臟中TC、TG、LDL-C水平的影響

表5 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)面積的影響

3.5 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠肝臟中ABCG5、SR-B1、iNOSmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟ABCG5、SR-B1 mRNA表達降低(P<0.01)，iNOSmRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組SR-B1 mRNA表達升高(P<0.01)，iNOSmRNA表達降低 (P<0.01)，其中高劑量組SR-B1 mRNA表達升高更顯著，中劑量組ABCG5 mRNA表達升高(P<0.01)，見表6。

3.6 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠LXR信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3.6.1 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟LXRα、ABCG5、CYP7A1、SREBP-1c蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊低劑量組小鼠肝臟LXRα、ABCG5、CYP7A1、SREBP-1c蛋白表達均升高(P<0.05)；銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組兩兩比較，各蛋白表達均無明顯變化(P>0.05)，見表7、圖1。

表6 ApoE-/-小鼠肝臟ABCG5、SR-B1、iNOS mRNA表達

3.6.2 銀藍調(diào)脂膠囊對ApoE-/-小鼠肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟iNOS蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組小鼠肝臟iNOS蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，高、低劑量組小鼠肝臟COX2蛋白表達降低 (P<0.05，P<0.01)，且低劑量組肝臟COX2蛋白表達降低更顯著，見表8、圖2。

4 討論

動脈粥樣硬化即體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致血管壁上脂質(zhì)堆積引起動脈壁狹窄的疾病[6]。臨床研究表明，血清ox-LDL升高及主動脈斑塊增加是判斷動脈粥樣硬化的指標[7]。如今抑制膽固醇合成不再是治療動脈粥樣硬化的唯一方法，促進膽固醇逆向轉(zhuǎn)運已成為治療的新思路。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運是通過高密度脂蛋白將周圍組織中過量的膽固醇轉(zhuǎn)移到肝臟進行膽汁酸合成和排泄的過程，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[8]。外周組織膽固醇流出是其中一種途徑，即外周組織細胞內(nèi)膽固醇通過ABCA1釋放到細胞外，經(jīng)卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶酯化為膽固醇酯后，與肝臟B族Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class B type 1, SR-B1)受體結(jié)合，進入肝臟[9]。膽固醇酯通過ABCG5/ABCG8異二聚體向膽汁中轉(zhuǎn)移，再經(jīng)過CYP7A1代謝為膽汁酸排出體外[10]。肝臟是代謝脂質(zhì)的主要場所，當肝臟發(fā)生炎癥時，其脂質(zhì)代謝能力則會下降，會促進動脈粥樣硬化的進展。其中環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2, COX2)和iNOS是肝炎的重要指標，當兩種炎癥因子表達增多，提示肝臟出現(xiàn)炎癥[11]。

表7 ApoE-/-小鼠肝臟LXRα、ABCG5、CYP7A1、SREBP-1c蛋白表達

表8 ApoE-/-小鼠肝臟iNOS、COX2蛋白表達

圖1 各組小鼠肝臟LXRα、ABCG5、CYP7A1、SREBP-1c蛋白印跡條帶

圖2 各組小鼠肝臟iNOS、COX2蛋白印跡條帶

LXRs是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運途徑中關(guān)鍵的固醇敏感轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)膽固醇水平并維持其穩(wěn)態(tài)的重要作用[12]。LXRs具有2種亞型，分別為LXRα和LXRβ。LXRα主要在代謝活躍的組織和細胞中高表達，如肝、腸、脂肪組織和巨噬細胞。LXRβ則在全身組織細胞廣泛表達[13]。邵丹陽[14]發(fā)現(xiàn)，當LXRs被激活后，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白如ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運家族、載脂蛋白、CYP7A1、SR-B1以及SREBP-1c表達均增加，顯著改善血脂水平。除了具備維持膽固醇穩(wěn)態(tài)的功能，近年來，已有文獻報導(dǎo)LXRs也有抑制炎癥因子合成的作用，激活LXRα可有效避免肝臟纖維化等疾病[15]，He等[16]發(fā)現(xiàn)激活LXR可以抑制iNOS以及COX2的表達，對炎癥具有抑制作用。

本次實驗中發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-模型組小鼠血清中ox-LDL水平升高，胸主動脈斑塊面積增加，肝臟脂質(zhì)水平上升；銀藍調(diào)脂膠囊進行干預(yù)之后，小鼠血清ox-LDL水平降低，且胸主動脈斑塊面積減少，說明銀藍調(diào)脂膠囊具有較好的抗動脈粥樣硬化作用；另發(fā)現(xiàn)，銀藍調(diào)脂膠囊能夠較好地降低肝臟中TC、TG、LDL-C水平，提示銀藍調(diào)脂膠囊的抗動脈粥樣硬化作用可能與提高肝臟脂質(zhì)代謝能力相關(guān)。分子機制研究表明，銀藍調(diào)脂膠囊提高LXRα、ABCG5、CYP7A1、SR-B1、SREBP-1c的表達，提示LXR通路被激活，與促進膽固醇逆向轉(zhuǎn)運途徑相關(guān)基因或蛋白的表達上調(diào)，從而使膽固醇從胸主動脈的斑塊向肝臟轉(zhuǎn)移并被代謝出體外有關(guān)。與此同時，肝臟中iNOS以及COX2等促炎因子的基因和蛋白表達下降，說明銀藍調(diào)脂膠囊可能通過激活LXRs而抑制炎癥因子的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，銀藍調(diào)脂膠囊治療動脈粥樣硬化的機制可能與激活LXR信號通路，促進ABCG1、SR-B1、CYP7A1表達，加強膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，促進外周組織即血管壁斑塊處的膽固醇流向肝臟進行代謝，降低血管壁斑塊及肝臟脂質(zhì)水平有關(guān)。與此同時，銀藍調(diào)脂膠囊亦能夠抑制iNOS、COX2的表達從而緩解肝臟炎癥反應(yīng)，提高其脂質(zhì)代謝能力相關(guān)。