陳 建， 曾智銳， 雷 珊， 薛 燕， 陳騰祥， 王 璐*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市婦幼保健院，貴州 貴陽 550004)

乳腺癌(breast carcinoma)是全世界女性面臨的最普遍的惡性腫瘤[1]。目前，診斷和治療乳腺癌的技術(shù)手段有了很大的改善，使得早期乳腺癌患者的生存率大大提高，但是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的生存率仍然很低，導(dǎo)致其死亡率高的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2]。因此，研發(fā)出抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物對乳腺癌患者具有重要意義。近年來，中藥及其活性提取物在抗乳腺癌中發(fā)揮著重要作用，其具有多途徑、多靶點和毒副作用低等優(yōu)點，有研究表明，多種中藥成分對乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥性具有很好的抑制作用[3]。

木犀草苷(cynaroside)又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside)，是一種廣泛存在于忍冬科藥用植物中的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤以及心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等多種生物活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草苷能顯著抑制人白血病細(xì)胞系K526的增殖，且具有濃度依賴性[5]。王婷婷等[6]發(fā)現(xiàn)木犀草苷通過影響凋亡相關(guān)基因cyclin D1、survivin、c-myc和p53基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，改變?nèi)耸彻馨┘?xì)胞Ecol109的細(xì)胞周期，從而抑制Ecal109細(xì)胞的生長。木犀草苷通過調(diào)控MAPK和mTOR信號通路抑制人宮頸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡[7]。此外，木犀草苷還會影響腫瘤新生血管的形成，最終使腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。因此，木犀草苷是一種具有抗腫瘤潛能的天然化合物。有研究表明，從決明子葉[9]，鼠尾草[10]和栝樓[11]等多種植物中提取的木犀草苷成分對乳腺癌細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，然而，木犀草苷對乳腺癌細(xì)胞的具體作用及其機(jī)制尚不明確，故本研究探索該成分對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力及其機(jī)制的影響，以期為乳腺癌新藥研發(fā)提供新思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院生物細(xì)胞庫。

1.2 藥物 木犀草苷對照品(純度98.67%，批號HY-N0540)，購自美國MCE公司，使用DMSO配制成10 mmol/L母液，在-20 ℃下保存。使用時，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將其稀釋至不同濃度的工作液。

1.3 試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號C11995500BT)，購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，貨號BI500)，購自以色列Bioind公司；0.25%胰酶(貨號325-043-EL)，購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO，貨號D2650)，購自美國Sigma公司；細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑(cell counting kit-8, CCK8，貨號MA0218)，購自大連美倫生物技術(shù)有限公司；一次性細(xì)胞嵌入皿24孔8 μm(貨號TCS003024)，購自廣州潔特生物過濾股份有限公司；無EDTA胰蛋白酶消化液(貨號T1350)、高效蛋白裂解液(貨號P0013B)、蛋白酶抑制劑PMSF(貨號ST505)、BCA定量試劑盒(貨號PC0020)、制膠試劑丙烯酰胺(29∶1，30%溶液)(貨號BL513B)、10% SDS溶液(貨號S1010)、APS、1 mol/L Tris-HCl(pH 6.8，貨號T1020)，均購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜(批號ISEQ00010)，購自美國Millipore公司；單克隆抗體N-cadherin(貨號66219-1-Ig)、E-cadherin(貨號60335-1-Ig)、Vimentin(貨號60330-1-Ig)和Bcl-2(貨號60178-1-Ig)，均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；單克隆抗體PCNA(貨號GB11010)，購自武漢塞維爾生物科技有限公司；多克隆抗體Bax(貨號YT0459)、單克隆抗體β-actin(貨號AP0060)，購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；山羊抗兔(貨號AS014)、山羊抗鼠二抗(貨號AS003)，購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；ECL超敏曝光液(貨號36222ES60)，購自武漢聚能慧達(dá)生物有限公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號40302ES50)，購自上海翊圣生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中(37 ℃、5% CO2)，待細(xì)胞匯合至90%以上時胰酶消化傳代，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力 胰酶消化MCF-7細(xì)胞后離心，用含10% FBS的培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，按照每孔3×103個細(xì)胞的密度進(jìn)行計數(shù)，鋪于96孔板上，每個濃度重復(fù)6次，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別用12.5、25、50 μmol/L木犀草苷溶液處理，以加入等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)液(即0 μmol/L)為對照組，加藥后培養(yǎng)48 h，每孔加入100 μL 含10% CCK-8的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測在450 nm波長處各孔光密度(OD)值。以0 μmol/L為對照孔，只含CCK-8的DMEM培養(yǎng)基孔為調(diào)零孔，計算存活率，存活率=[(給藥組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照組OD值-調(diào)零孔OD值)]×100%。

2.3 克隆形成實驗檢測細(xì)胞存活情況 胰酶消化MCF-7細(xì)胞后離心，加入含血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)后按照每皿500個細(xì)胞的密度接種于6 cm的小皿中。繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，分別用12.5、25、50 μmol/L濃度的木犀草苷溶液處理細(xì)胞，以加入等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)液(即0 μmol/L)為對照組，加藥處理后繼續(xù)培養(yǎng)。在第10天時吸出培養(yǎng)基，4%多聚甲醛溶液固定30 min，吸出固定液后，0.1%結(jié)晶紫溶液染色1 h(均在室溫下進(jìn)行)，雙蒸水將多余結(jié)晶紫洗凈，將小皿放入烘箱內(nèi)烘干，拍照后計算克隆形成數(shù)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7細(xì)胞凋亡率 取生長狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞，以每孔4×104個的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入12.5、25、50 μmol/L木犀草苷溶液處理細(xì)胞，以加入等體積的DMSO(即0 μmol/L)為對照組，設(shè)置3組復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集所有液體于離心管中，1 000 r/min(離心半徑8 cm)離心5 min，棄上清，PBS洗滌，再離心5 min，將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)入流式管中，每管加入100 μL binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL FITC染液、10 μL PI染液，輕輕混勻，室溫下染色15 min，將流式管放在冰上保存，上流式細(xì)胞儀前再加入400 μL binding buffer液混勻，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，計算總凋亡率，總凋亡率=晚期凋亡率(右上象限)+早期凋亡率(右下象限)。

2.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 MCF-7細(xì)胞按照每孔2×105個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)95%以上時，在單層細(xì)胞上用200 μL移液器槍頭平行劃3道痕，PBS振蕩漂洗3次，加入含不同濃度(12.5、25、50 μmol/L)木犀草苷的無血清DMEM培養(yǎng)液，對照組加入含等體積DMSO的無血清DMEM培養(yǎng)液(即0 μmol/L)。分別在劃痕0、48 h后，給藥組在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行拍照，劃痕寬度在Image Pro Plus軟件中測量，計算相對遷移率，相對遷移率=[(給藥組0 h劃痕寬度-給藥組48 h劃痕寬度)/(對照組0 h劃痕寬度-對照組48 h劃痕寬度)]×100%。

2.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力 按照Matrigel膠和無血清DMEM培養(yǎng)基為1∶8比例混勻后，每個小室加200 μL稀釋液，在37 ℃培養(yǎng)箱中烘干1 h，吸掉多余培養(yǎng)基，將MCF-7細(xì)胞重懸，計數(shù)后按每室4×104個細(xì)胞的密度取200 μL懸液滴于上室中，對應(yīng)的24孔板下室每孔分別加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，配制不同濃度(12.5、25和50 μmol/L)木犀草苷溶液各800 μL，對照組在有血清培養(yǎng)基中加入等體積DMSO，36 h后用4%多聚甲醛固定Transwell小室30 min，將固定液吸出，加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色1 h，清洗干凈后放入烘箱烘干，在顯微鏡下拍照，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞染色較淺，故又用結(jié)晶紫復(fù)染30 min，重復(fù)以上操作。每個濃度隨機(jī)選取5個視野拍照計數(shù)。

2.7 計算機(jī)分子對接 從Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫中下載Calpain-2蛋白晶體結(jié)構(gòu)(ID3BOW)，從PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)下載木犀草苷三級結(jié)構(gòu)，將兩者導(dǎo)進(jìn)SYBYL軟件，對蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行清除原結(jié)合分子、修復(fù)粘性末端、加氫處理后，以自動識別模式識別蛋白活性口袋，運用DOCKING功能對接木犀草苷與Calpain-2的活性口袋，根據(jù)結(jié)合打分判斷分子與蛋白穩(wěn)定結(jié)合的可能性，若在4～5分范圍則可認(rèn)為分子與蛋白能穩(wěn)定結(jié)合[12]。

2.8 Western blot檢測Calpain-2、N-cadherin、Vimentin、Mcl-1、PCNA、E-cadherin、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 用不同濃度(12.5、25、50 μmol/L)木犀草苷溶液處理MCF-7細(xì)胞48 h后，吸出培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入預(yù)冷的含2% PMSF蛋白酶抑制劑的強(qiáng)效裂解液，在冰上裂解細(xì)胞15 min，13 000 r/min離心30 min，吸取蛋白上清液，采用BCA法，以上樣量30 μg/10 μL進(jìn)行定量，30 μg蛋白用12%分離膠在80 V恒定電壓下電泳30 min后，轉(zhuǎn)為120 V繼續(xù)電泳1.5 h，300 mA恒流2 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST溶液新鮮配制5%牛奶室溫封閉2 h，將PVDF膜按照實驗?zāi)康臈l帶進(jìn)行切膜并標(biāo)記，加入稀釋倍數(shù)為1∶1 000的一抗Calpain-2、N-cadherin、Vimentin、Mcl-1、PCNA、E-cadherin、Bcl-2、Bax、β-actin，在4 ℃冰箱中孵育過夜，第2天用TBST溶液洗滌3次，每次20 min，加入稀釋倍數(shù)為1∶5 000的二抗，在室溫?fù)u床中孵育2 h，TBST洗滌3次，每次15 min，使用超敏ECL曝光液于多功能成像儀中進(jìn)行曝光，通過成像儀自帶的軟件測量條帶的灰度值后，以β-actin灰度值為內(nèi)參，計算對應(yīng)蛋白的相對表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度木犀草苷對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 如圖1所示，與對照組(0 μmol/L)比較，給藥組MCF-7細(xì)胞增殖率均降低(P<0.05)，提示木犀草苷能抑制細(xì)胞增殖。

3.2 木犀草苷對MCF-7細(xì)胞克隆形成的影響 如圖2所示，與對照組(0 μmol/L)比較，給藥組MCF-7細(xì)胞克隆形成數(shù)目均降低(P<0.05)，提示木犀草苷能抑制細(xì)胞克隆形成能力。

3.3 木犀草苷對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 如圖3所示，12.5、25、50 μmol/L木犀草苷溶液處理48 h后，MCF-7細(xì)胞凋亡率分別為(3.36±0.58)%、(8.35±0.29)%、(11.91±0.21)%、(19.18±1.49)%；與對照組0 μmol/L比較，木犀草苷能使細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)；木犀草苷可上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Mcl-1、Bcl-2蛋白表達(dá)，提示木犀草苷可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

注：與對照組(0 μmol/L)比較，**P<0.01。圖1 不同濃度木犀草苷對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響

注：與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05, **P<0.01。圖3 木犀草苷對MCF-7凋亡的影響

3.4 木犀草苷對MCF-7細(xì)胞遷移的影響 如圖4所示，與對照組(0 μmol/L)比較，給藥組MCF-7細(xì)胞相對遷移率均降低(P<0.05)，提示木犀草苷能抑制細(xì)胞遷移。

注：與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05, **P<0.01。圖4 木犀草苷對MCF-7細(xì)胞遷移的影響

3.5 木犀草苷對MCF-7細(xì)胞侵襲的影響 如圖5所示，與對照組(0 μmol/L)比較，給藥組MCF-7細(xì)胞相對侵襲能力均減弱(P<0.05)，提示木犀草苷能抑制細(xì)胞侵襲。

注：與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05, **P<0.01。圖5 木犀草苷對MCF-7細(xì)胞侵襲的影響

3.6 木犀草苷與Calpain-2蛋白的分子對接 如圖6所示，木犀草苷能與Calpain-2活性口袋結(jié)合，并被后者緊密包裹在內(nèi)，對接打分(C-score)為5分，顯示木犀草苷能穩(wěn)定結(jié)合Calpain-2蛋白。

圖6 木犀草苷與Calpain-2蛋白的分子對接

3.7 木犀草苷對Calpain-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、PCNA蛋白表達(dá)的影響 如圖7所示，與對照組(0 μmol/L)比較，給藥組Calpain-2、N-cadherin、Vimentin、PCNA蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，提示，木犀草苷可能是通過靶向抑制Calpain-2表達(dá)來抑制MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。

4 討論

乳腺癌是一類發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確的惡性腫瘤，由于其轉(zhuǎn)移性高，病死率呈逐年上升趨勢，并且越來越年輕化[13]。目前，乳腺癌的治療主要采取手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌藥物及分子靶向藥物等系統(tǒng)治療方法，這些方法雖然能夠延長患者的生存期，但因其毒副作用大以及預(yù)后較差，患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍有30%～40%[14]。因此，深入探索乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步尋找高效低毒抗乳腺癌的藥物仍然是目前研究的熱點。

近年來，中藥以其多途徑、多靶點和毒副作用小等獨特的優(yōu)勢受到了國內(nèi)外眾多研究者的重視，目前已有大量關(guān)于中藥及其有效成分抗乳腺癌的相關(guān)研究[3]。黃愷飛等[15]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物漢黃芩素通過降低ICAM-1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖、遷移和侵襲。多酚類化合物姜黃素通過下調(diào)MMP-9的表達(dá)[16]以及白藜蘆醇通過逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移[17]。高歡等[18]研究發(fā)現(xiàn)萜類化合物雷公藤甲素通過激活ERK1/2而誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬，最終抑制其生長和增殖。生物堿類辣椒素以及其它類總丹參酮等中藥有效成分均能影響MCF-7細(xì)胞的活力，抑制其遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-20]。

木犀草苷是一種存在于多種藥用植物中的黃酮類化合物，已有研究證明其具有顯著的抗腫瘤作用。有研究表明，從枯茗乙酸乙酯中提取出的木犀草苷成分，具有很好的抗腫瘤活性，能有效抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖[21]。Witkowska-Banaszczak等[22]從菊科植物當(dāng)中分離出的木犀草苷單體化合物，可通過抑制炎癥因子NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平和α-淀粉酶活性，從而降低肝癌HepG-2細(xì)胞的存活率，發(fā)揮抗癌作用。Velmurugan等[23]研究證明木犀草苷通過調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)，并抑制與細(xì)胞外信號傳導(dǎo)相關(guān)的激酶的表達(dá)和活性，從而抑制口腔癌細(xì)胞FaDu和HSC-3的遷移和侵襲。還有研究表明木犀草苷能引起非小細(xì)胞肺癌發(fā)生G0/G1期周期阻滯以及自噬的發(fā)生，從而發(fā)揮抗癌作用[24]。

Calpain-2是Calpains家族的重要成員，能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括腫瘤細(xì)胞的存活、惡化和轉(zhuǎn)移，以及新生血管的形成[25]。同時，Calpain-2的水解底物，如paxillin、FAK、催乳素和spectrin等，能促進(jìn)細(xì)胞骨架重塑，降低細(xì)胞粘附力，增加Calpain-2的表達(dá)和活性，最終增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力[26-27]。本研究通過計算機(jī)分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)木犀草苷可以穩(wěn)定結(jié)合Calpain-2蛋白的活性口袋；蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果進(jìn)一步說明不同濃度的木犀草苷能夠抑制Calpain-2的表達(dá)。

Bcl-2蛋白家族包括促凋亡因子和抗凋亡因子，Parton等[28]研究發(fā)現(xiàn)抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2和細(xì)胞增殖蛋白PCNA的表達(dá)，能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。邱曉曉等[29]運用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑抑制Calpain-2的激活和蛋白表達(dá)，從而降低Bax蛋白表達(dá)量，增加Bcl-2的蛋白表達(dá)，最終抑制糖尿病老鼠心肌細(xì)胞的凋亡。此外，Mcl-1也是Bcl-2蛋白家族中重要的抗凋亡蛋白，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞的存活[30-31]。Young等[32]研究發(fā)現(xiàn)，使用Mcl-1抑制劑能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468-2A凋亡，并抑制MDA-MB-231-2A的侵襲和肺轉(zhuǎn)移，從而抑制乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)對抗腫瘤藥物達(dá)沙替尼的敏感性。Sapili等[33]研究發(fā)現(xiàn)，Calpain-2的激活和蛋白表達(dá)上調(diào)能顯著增加線粒體膜通透性，誘導(dǎo)Mcl-1的表達(dá)上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的耐藥性增加。本研究發(fā)現(xiàn)木犀草苷可能通過靶向抑制Calpain-2，使Bcl-2和Mcl-1的蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生凋亡。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要過程，其中E-cadherin屬于上皮生物標(biāo)記物，N-cadherin和Vimentin屬于間充質(zhì)生物標(biāo)記物。Chen等[34]研究發(fā)現(xiàn)，使用Calpain-2的抑制劑或沉默了CAPN2基因后，能使E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，同時降低N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而抑制乳腺細(xì)胞MCF-10A的侵襲和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)木犀草苷能降低Calpain-2的蛋白表達(dá)，同時促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，并下調(diào)Vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的遷移和侵襲。該結(jié)果預(yù)示，木犀草苷可能成為一種有效的抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的中藥成分。

綜上所述，木犀草苷可能通過靶向調(diào)控Calpain-2從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，有望成為一種治療乳腺癌的有效活性成分。