張丹丹

(安徽三聯(lián)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，安徽 合肥 230031)

皮下注射胰島素是治療糖尿病的傳統(tǒng)方法，但其使用不便、副作用嚴(yán)重[1]，因而許多研究人員致力于從草藥中尋找成本低、副作用小的治療方法[2]。小花柳葉菜含有多種活性成分，如槲皮素等多酚和黃酮醇苷[3]等，這些成分能削弱環(huán)氧合酶1和環(huán)氧合酶2的作用，抑制大腸桿菌的生長，并發(fā)揮抗氧化活性，比傳統(tǒng)的抗氧化劑如Trolox和抗壞血酸清除自由基的活性高，在前列腺增生、疼痛性和炎癥性等疾病中發(fā)揮了很好的治療作用[4-6]。本研究以患有2型糖尿病大鼠為對象，分析小花柳葉菜水提物抗高血糖和高血脂的藥物機(jī)理，并評估其治療2型糖尿病的價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性白化Wistar大鼠，3月齡，體質(zhì)量180 ～ 250 g，在環(huán)境溫度(25±2) ℃和相對濕度(50±0.1)%條件下飼養(yǎng)，晝夜自由取水和進(jìn)食。

1.1.2 高脂飼料

通過對Bigoniya等[7]提出的飲食組成進(jìn)行改良，制備成高脂飼料。飼料中普通粉飼糧、山羊脂肪、椰子油、果糖、酪蛋白、雞蛋蛋白、復(fù)合維生素和氯化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40.0%、25.0%、6.0%、10.0%、6.0%、12.0%、0.5%和0.5%。

1.2 方法

1.2.1 高脂膳食果糖鏈脲佐菌素(HFD-FRU-STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病

30只白化Wistar大鼠被平均分成5組。除正 常對照組的6只大鼠外，其余均用高脂飼料喂養(yǎng)2 w后禁食過夜；將小劑量新鮮制備的鏈脲佐菌素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35 mg/kg)溶于0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.5)中[8]，再注射到大鼠的腹腔；1 w后觀察大鼠空腹血糖(fasting blood sugar,FBS)，將FBS顯示為250～350 mg/dL的大鼠選為實(shí)驗(yàn)用鼠。

1.2.2 藥物治療方案

正常對照組：不患有2型糖尿病的大鼠，飼喂正常飲食；糖尿病對照組：患有2型糖尿病的大鼠，飼喂HFD-FRU-STZ(蒸餾水為載體)；標(biāo)準(zhǔn)治療組：患有2型糖尿病的大鼠，按10 mg/kg給予吡格列酮進(jìn)行灌胃治療，持續(xù)3 w；小劑量小花柳葉菜水提物(購自扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司)治療組：患有2型糖尿病的大鼠，按200 mg/kg給予小花柳葉菜水提物進(jìn)行灌胃治療，持續(xù)3 w；大劑量小花柳葉菜水提物治療組：患有2型糖尿病的大鼠，按400 mg/kg給予小花柳葉菜水提物進(jìn)行灌胃治療，持續(xù)3 w。

1.2.3 數(shù)據(jù)采集

在第0、3、6 w測定大鼠的體質(zhì)量，在第1、3、6 w測定攝食量和飲水量。給大鼠一定量的食物和水，24 h后從初始量中減去剩余量來確定消耗量。

3 w后，5組大鼠于夜間禁食后采用光醚誘導(dǎo)麻醉，將細(xì)毛細(xì)管輕輕插入眼球內(nèi)角，從眶后神經(jīng)叢采血約1.5 mL。采得的血液以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取血清。采用半自動分析儀中的Coral工具通過比色法測定空腹血糖(FBS)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)、堿性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)、尿酸、肌酸酐值；采用全自動分析儀(CAREX)中的Excel工具通過比濁法檢測高敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)；利用Elisa酶標(biāo)儀檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)和胰島素；通過“空腹胰島素×FBS÷22.5”公式計(jì)算胰島素抗性穩(wěn)態(tài)模型評估(HOMA-IR)指數(shù)，以評估胰島素抵抗程度[9]；6 w前進(jìn)行2 d的口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Mean SEM表示，用Graph pad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(ANOVA)，并進(jìn)行Bonferroni后測。采用Dunnett-t檢驗(yàn)對胰島素、HOMA-IR、肌酸酐、尿酸、脂質(zhì)譜、肝臟譜等參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P(顯著特性)<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)HFD-FRU-STZ喂養(yǎng)至第3 w時，各組大鼠的體質(zhì)量、攝食量和飲水量較正常對照組均有所增加。相比第3 w，第6 w時糖尿病對照組的體質(zhì)量顯著下降，但攝食量和飲水量均有所增加；而與糖尿病對照組相比，治療組的攝食量和飲水量減少，體質(zhì)量增加。結(jié)果見表1和圖1。

表1 不同時段大鼠食物和水的攝入量

由表2可知，與正常對照組相比，HFD-FRU-STZ飲食顯著提高了糖尿病對照組大鼠的FBS、HbA1c和HOMA-IR指數(shù)，但顯著降低了它們的血清胰島素水平。相比糖尿病對照組，治療組的FBS、HbA1c和HOMA-IR指數(shù)降低，血清胰島素水平明顯提高，證明小花柳葉菜水提物具有抗高血糖活性。而且，相比小劑量小花柳葉菜水提物治療組，大劑量小花柳葉菜水提物治療組的FBS、HbA1c和HOMA-IR指數(shù)均明顯降低，血清胰島素水平明顯增高。

表2 大鼠空腹血糖的相關(guān)指標(biāo)

在口服葡萄糖后的5個時間點(diǎn)，分別測定各組的血糖水平，結(jié)果見圖2。由圖2可知，正常對照組大鼠的血糖水平在60 min時達(dá)到較高水平，120 min時降至正常水平。在糖尿病對照組中，盡管在120 min時血糖大約下降到初始水平。對于接受吡格列酮和小花柳葉菜水提物治療的大鼠，血糖水平在60 min時逐漸下降，在120 min時逐漸達(dá)到接近0 min時的值。在各時間點(diǎn)，小劑量小花柳葉菜水提物治療組大鼠的血糖水平都低于大劑量小花柳葉菜水提物治療組，說明小花柳葉菜水提物的治療效果與劑量有相關(guān)性。

TNF-α和hs-CRP是糖尿病和肥胖的發(fā)病過程中的重要因子，可產(chǎn)生胰島素抗性。由表3可知，與正常對照組相比，糖尿病對照組的TNF-α和hs-CRP均明顯升高。用吡格列酮和小花柳葉菜水提物治療可使其水平下降到接近正常值。與吡格列酮治療組相比，小花柳葉菜水提物在降低TNF-α和hs-CRP方面的效果較差。糖尿病對照組中的肝酶指標(biāo)(SGOT、SGPT、ALP)明顯高于正常對照組。與糖尿病對照組相比，吡格列酮和小花柳葉菜水提物治療組大鼠的肝酶指標(biāo)明顯降低，小花柳葉菜水提物治療組的肝酶高于吡格列酮標(biāo)準(zhǔn)治療組。糖尿病對照組大鼠的腎功能指標(biāo)(血清肌酸酐和尿酸)水平較正常對照組均明顯升高，而與糖尿病對照組相比，吡格列酮和小花柳葉菜水提物治療組大鼠的腎功能指標(biāo)均顯著降低。糖尿病對照組的TG、TC、VLDL、LDL等脂質(zhì)生物標(biāo)志物顯著升高，而HDL明顯降低。與糖尿病對照組相比，吡格列酮和小花柳葉菜水提物的治療使大鼠的血清TG、TC、VLDL、LDL水平顯著降低，而HDL水平顯著升高。

表3 第6 w指標(biāo)數(shù)測量的結(jié)果

3 討論

果糖誘導(dǎo)的動物2型糖尿病實(shí)驗(yàn)已取得了較多的研究成果[8-9]。富含果糖的飲食會損害葡萄糖的吸收，加快甘油三脂(TG)和膽固醇含量的升高，以此可模擬2型糖尿病的各種癥狀，如胰島素抵抗增加、高脂血癥、腎病、血壓升高等。高果糖飲食可通過非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)誘導(dǎo)骨骼肌胰島素抵抗，其機(jī)制是激活腸道中toll樣受體4(tlr4)和核因子κB(NF κB)[10]。低劑量STZ和煙酰胺[11]、低劑量STZ加高脂肪飲食[12]和高果糖飲食[13]被許多研究者用來誘導(dǎo)與糖尿病相似的病理改變。本研究使用高脂膳食果糖鏈脲佐菌素(HFD-FRU-STZ)誘導(dǎo)表型代謝紊亂，引起碳水化合物和脂質(zhì)代謝異常，誘發(fā)白化Wistar大鼠2型糖尿病的發(fā)生，并通過改變飲食習(xí)慣增加甘油三酯(TG)和膽固醇水平并導(dǎo)致外周組織胰島素抵抗。

小花柳葉菜水提物對2型糖尿病的治療作用首先體現(xiàn)在體質(zhì)量改善上。2型糖尿病大鼠體質(zhì)量的下降意味著利用肝臟葡萄糖異生肌肉蛋白來代償胰島素抵抗所導(dǎo)致的葡萄糖危機(jī)。用小花柳葉菜水提物治療后，糖尿病大鼠的體質(zhì)量有了實(shí)質(zhì)性的改善，從而增加了胰島素敏感性。另外，與糖尿病對照組相比，吡格列酮和小花柳葉菜水提物對糖尿病的治療效果，可能源于其促胰島素作用。果糖和血脂異常的慢性升高會增加活性氧和脂質(zhì)過氧化，從而損傷組織的抗氧化系統(tǒng)，而氧化應(yīng)激可以破壞胰腺細(xì)胞的線粒體，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。這些變化主要體現(xiàn)在糖尿病對照組胰島素分泌水平下降上。用吡格列酮和小花柳葉菜水提物治療可以有效保護(hù)胰腺免受破壞。這種作用可能來自于酚、多酚基團(tuán)的促進(jìn)抗氧化防御機(jī)制。由于果糖喂食導(dǎo)致肝臟DNL過程發(fā)生，肝臟脂肪酸沉積增加，SGOT、SGPT和ALP產(chǎn)生增多，導(dǎo)致糖尿病對照組產(chǎn)生胰島素抵抗。吡格列酮和小花柳葉菜水提物治療組均通過顯著降低上述酶活性而表現(xiàn)出肝保護(hù)作用。

同時，TG、TC、HDL、VLDL、LDL水平的測定結(jié)果顯示，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)及試驗(yàn)藥物治療6 w后，大鼠的TG、TC、VLDL、LDL水平均有所改善，表明吡格列酮和小花柳葉菜水提物對2型糖尿病大鼠的降血脂作用顯著。另外，與正常對照組相比，糖尿病對照組的血清TNF-α和高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等炎癥生物標(biāo)志物升高。TNF-α是一種炎癥細(xì)胞因子，由脂肪組織單核巨噬細(xì)胞釋放。TNF-α長期暴露可誘導(dǎo)體外和體內(nèi)胰島素抵抗。胰島素抵抗是由于胰島素受體的酪氨酸激酶受到抑制而產(chǎn)生的。TNF-α調(diào)節(jié)血漿游離脂肪酸水平，促進(jìn)脂質(zhì)合成。與糖尿病對照組相比，吡格列酮和小花柳葉菜水提物的治療可降低TNF-α水平。400 mg/kg小花柳葉菜水提物治療組的TNF-α水平的顯著降低，表明其抗高血糖特性改善了胰島素敏感性。C-反應(yīng)蛋白(CRP)主要由肝細(xì)胞在細(xì)胞因子如白介素-6、白介素-1和TNF-α的控制下合成和釋放。CRP是全身炎癥的敏感標(biāo)記物，與高血糖、胰島素抵抗和明顯的2型糖尿病(T2DM)有關(guān)。在本研究中，糖尿病對照組的hs-CRP因HFD-FRU-STZ而升高，因此，吡格列酮和小花柳葉菜水提物具有顯著降低血清hs-CRP的抗炎作用。

最后，飲食中過量攝入嘌呤、高果糖玉米糖漿和蔗糖會產(chǎn)生更多的尿酸。高尿酸血癥發(fā)生于肥胖、糖尿病和其他如高血壓、腎病和高甘油三酯血癥等情況[14]。肌酐水平升高可導(dǎo)致腎單位結(jié)構(gòu)和功能的明顯異常[15]。因此，測量血清尿酸水平和肌酸酐水平可以驗(yàn)證吡格列酮和小花柳葉菜水提物對腎功能是否有改善作用。

總之，HFD-FRU-STZ飲食可誘導(dǎo)動物糖尿病，通過多種細(xì)胞機(jī)制引起與2型糖尿病患者相似的共發(fā)病情況，該模型可以滿足試驗(yàn)要求，比其他的基因型模型價格更低廉，為研究誘導(dǎo)2型糖尿病并發(fā)高脂血癥提供了一種有效的低成本試驗(yàn)方法。而多項(xiàng)指標(biāo)的評估結(jié)果表明，小花柳葉菜水提物可在一定程度上調(diào)節(jié)糖尿病人機(jī)體的抗氧化能力、胰島素活性、糖和脂肪代謝以及肝腎功能，從而發(fā)揮一定的治療作用。