接智慧 周 巖 楊海燕 楊洪川 程俊蘭 許 文

山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院1.婦產(chǎn)科；2.病理科，山東 泰安 271000

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位，發(fā)病率逐年上升，且呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴重威脅女性健康［1］。目前，早期EC患者5年總存活率達96%［2］；對于晚期EC，即使采用手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌治療等聯(lián)合的綜合治療方式，預后也并不理想，患者的生存率較低［3］。因此，臨床上迫切需要尋找與EC形成相關(guān)，并且有助于EC早期診斷、預后預測的分子靶標。近年來研究認為，miR-17-92基因簇是一個與腫瘤形成有關(guān)的基因，在一系列人類腫瘤如淋巴瘤、白血病、宮頸癌和卵巢癌中均存在miR-17-92的異常表達［4］。目前，關(guān)于miR-17-92基因簇與EC關(guān)系的研究較少。在前期研究中，本團隊發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇在EC Ishikawa、HEC-1A細胞系中存在異常表達［5］，因此本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，分析子宮內(nèi)膜病變組織中miR-17-92基因簇的表達，探討其異常表達情況與EC臨床病理特征和預后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 資料與試劑

1.1.1 研究標本 選取2009年1月至2015年5月于山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦科就診并經(jīng)病理診斷為EC且行手術(shù)治療的患者105例。納入標準：（1）病理確診為EC；（2）術(shù)前未行放化療及內(nèi)分泌治療；（3）有完整的病歷資料。排除標準：（1）有其他腫瘤病史；（2）合并內(nèi)分泌代謝性疾病或免疫系統(tǒng)疾病；（3）合并全身感染。選取切除的EC組織，作為EC組，患者年齡26~70歲，中位年齡53.5歲，其中Ⅰ型EC 87例，Ⅱ型EC 18例，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會（international federation of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO）2009標準，其中Ⅰ、Ⅱ期患者72例，Ⅲ、Ⅳ期患者33例，F(xiàn)IGO I級29例，F(xiàn)IGO II級48例，F(xiàn)IGOⅢ級28例。另收集同期非典型增生子宮內(nèi)膜患者36例，作為非典型增生組，患者年齡32~66歲，中位年齡50.85歲；因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIA）Ⅲ行全子宮切除術(shù)的患者22例，作為正常子宮內(nèi)膜組，其中增生期內(nèi)膜組織13例，分泌期內(nèi)膜組織9例，患者年齡38~62歲，中位年齡48.4歲。所有患者術(shù)前均未進行內(nèi)分泌治療或放化療。標本收集后均立即進行液氮速凍處理并存于-80℃冰箱中備用。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組患者或家屬均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒購自美國Axygen公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海吉瑪技術(shù)有限公司，qRT-PCR檢驗試劑盒購自珠海莫納生物科技公司，miR-17-92基因簇及內(nèi)參基因U6引物由上海生工生物有限公司合成，Nanodrop分光光度計購自美國Thermo公司，qRT-PCR擴增儀ABI 7500購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 qRT-PCR檢測miR-17-92基因簇表達

采取Trizol法提取組織中總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度及純度（要求OD 260/OD 280比值在1.8~2.0），按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA產(chǎn)物置于-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。引物序列：miR-17-92基因簇上游引物：5'-AAGGGCCGCAGCTTACACAT-3'，下 游 引 物：5'-TCCCTCACTTTGCTTCTCTTTTGAC-3'；U6上 游引物：5'-AAGGCAGCACACTCGCTTC-3'，下游引物：5'-TGGTCCGAGTGTGGTTCTGT-3'。qRT-PCR擴增儀檢測miR-17-92基因簇相對表達水平，qRT-PCR擴增體系為20μL，反應(yīng)條件：預95℃變性5 min，95℃10 s；63℃20 s；72℃20 s；76℃20 s，共40個循環(huán)。每一樣本重復3次。采用2-??Ct法表示miR-17-92基因簇的相對表達量。

1.3 隨訪

隨訪采用電話或者門診隨訪。隨訪時間為患者術(shù)后5～79個月，中位隨訪時間37個月，隨訪終點事件為患者死亡或者到達隨訪截止時間（2020年5月）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩組比較采用成組t檢驗。計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，Kaplan-Meier法分析EC患者術(shù)后生存情況，組間比較采用Log-rank檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織中miR-17-92基因簇表達情況

miR-17-92在EC組織中的相對表達量為1.489±0.038，非典型增生組織中的相對表達量為1.046±0.029，正常內(nèi)膜組織中相對表達量為0.621±0.032，miR-17-92在EC組織表達顯著高于非典型增生組織和正常內(nèi)膜組織，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.6827，P=0.016；t=5.0166，P=0.001），結(jié)果詳見圖1。

圖1 miR-17-92基因簇在子宮內(nèi)膜組織中的表達情況

2.2 miR-17-92的表達與EC臨床病理特征的關(guān)系

分析顯示在未絕經(jīng)患者EC組織中miR-17-92的表達（1.501±0.038）高于已絕經(jīng)患者EC組織（1.486±0.029），差異有統(tǒng)計學意義（t=2.257，P=0.026）；miR-17-92基因簇的表達與EC的病理類型相關(guān)，分析顯示在Ⅰ型EC組織中的表達（1.505±0.017）高于Ⅱ型EC組織（1.476±0.023），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.178，P<0.001）；miR-17-92基因簇的表達與EC肌層浸潤深度明顯相關(guān)，分析顯示在>1/2肌層浸潤組織中的表達（1.523±0.040）高于≤1/2肌層浸潤組織（1.469±0.037），差異有統(tǒng)計學意義（t=-7.091，P<0.001）；而miR-17-92基因簇的表達與患者年齡、FIGO分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期無關(guān)，結(jié)果見表1。

表1 miR-17-92基因簇表達與EC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 miR-17-92的表達對EC預后的影響

以中位值為界限，將EC患者分為miR-17-92低表達組53例，中位生存時間為60個月，miR-17-92高表達組52例，中位生存時間為37個月，采用Kaplan-Meier法分析miR-17-92的表達與EC患者預后的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-17-92高表達組和低表達組的患者5年生存率分別為33.9%和49.5%，Logrank檢驗結(jié)果顯示，miR-17-92高表達組患者的生存時間低于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.074，P=0.043），見圖3。

圖3 miR-17-92的表達與EC患者預后的關(guān)系

3 討 論

大量研究已經(jīng)證實，多種miRNA在EC中的異常表達可以影響腫瘤進展，如miR-944在EC中表達上調(diào)，促進腫瘤的侵襲［6］；miR-125a-5p在EC RL95-2細胞中高表達后，能夠改變PI3K/AKT/mTOR通路活性及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進而抑制EC RL95-2細胞增殖［7］。由于一個miRNA可以靶向調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可以同時受到多個miRNA的調(diào)控，不同miRNA通過調(diào)控多個基因形成的信號網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的生物學行為調(diào)控中起更加重要的作用［8-10］，miRNA基因簇具有一個啟動子區(qū)，可轉(zhuǎn)錄形成多個成熟miRNA的基因簇，同一個miRNA基因簇轉(zhuǎn)錄形成的miRNA在生物學調(diào)控中發(fā)揮協(xié)調(diào)作用［11］，因此目前關(guān)于miRNA的基因簇在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用已成為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制研究的新熱點。miR-17-92是第一個被發(fā)現(xiàn)的miRNA癌基因簇［12］，其在乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等細胞中高表達，并且參與多種類型的腫瘤細胞增殖過程［4］。在前期研究中，本團隊發(fā)現(xiàn)miR-17-92在EC Ishikawa、HEC-1A細胞系中均表達上調(diào)［5］。本研究檢測了miR-17-92在子宮內(nèi)膜病變組織中的表達情況，顯示其在EC癌組織中的表達顯著高于非典型增生和正常內(nèi)膜組織，經(jīng)過分析癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，EC組織中miR-17的表達也顯著高于正常內(nèi)膜組織，這與本團隊前期研究結(jié)果一致。分析EC組織中miR-17-92表達與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，顯示miR-17-92基因簇在深肌層浸潤EC患者中表達高于淺肌層浸潤者，提示其可能促進了EC對周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。Chen等［13］發(fā)現(xiàn)miR-92a通過靶向磷酸酶與張力蛋白同源物蛋白（PTEN）促進結(jié)腸癌SW480細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。Su等［14］在宮頸癌中也發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇的相同作用。在前期研究中，本團隊通過生物信息學軟件預測Mfn2是miR-17-92的靶基因之一，研究發(fā)現(xiàn)Mfn2與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［15］，因此本研究推測miR-17-92可能通過靶向Mfn2調(diào)控EC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，在后續(xù)研究中本團隊將對miR-17-92基因簇促進EC腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的具體機制進行探究。

本研究還發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇在Ⅰ型EC組織中表達顯著高于Ⅱ型EC組織，前者為雌激素依賴EC，本團隊前期研究通過生物信息學方法富集了miR-17-92基因簇參與的信號通路和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示miR-17-92基因簇通過調(diào)控靶蛋白參與EC信號通路和Wnt信號通路［5］，Wang等［16］研究認為在月經(jīng)周期、內(nèi)膜增生及內(nèi)膜癌變過程中，Wnt信號通路具有維持雌激素誘導細胞增殖和孕激素誘導細胞分化之間平衡的作用，這提示miR-17-92可能通過與女性雌激素的相互作用，調(diào)控Wnt信號通路在內(nèi)的多條信號通路，導致EC的發(fā)生，這為EC的激素治療提供了一個新的可能靶點。

此外，本研究對miR-17-92基因簇表達與EC患者預后關(guān)系進行了分析，結(jié)果顯示miR-17-92基因簇高表達的EC患者，術(shù)后5年總生存率和平均生存時間均低于miR-17-92低表達患者，提示miR-17-92基因簇高表達是EC患者預后差的危險因素。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的大量隨訪信息進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇成員之一的miR-17的表達水平與EC患者的生存時間也呈現(xiàn)負相關(guān)，這與本研究的預后分析結(jié)果一致。以上結(jié)果提示miR-17-92基因簇具有作為EC患者不良預后預測的生物靶標的潛能。

綜上所述，miR-17-92基因簇在EC組織中異常高表達，并與EC臨床病理因素和預后相關(guān)，可能參與了EC的發(fā)生及發(fā)展過程，有望成為EC診斷和治療的分子靶點。因此，深入研究miR-17-92基因簇在EC發(fā)生、發(fā)展中的詳細機制有重要的理論和實際意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突