聶石輝，王 仙，向 莉，張金汕,3，李志強，任 毅,3，方伏榮

(1.新疆農業(yè)科學院糧食作物研究所，新疆烏魯木齊 830091； 2.新疆農業(yè)科學院奇臺麥類試驗站，新疆奇臺 831800； 3.新疆農業(yè)大學農學院，新疆烏魯木齊 830052)

大麥(L.)屬于禾本科(Gramineae)大麥屬(Hordeum)植物，在世界主要谷類作物中，其播種面積僅次于玉米、小麥和水稻。大麥是重要的糧食、釀酒和飼料作物，與其他谷類作物相比，能更好地適應干旱、寒冷、鹽脅迫等惡劣環(huán)境。因其擁有比其他谷類作物更加廣泛的生態(tài)適應性，被認為是最適宜進行抗旱研究的遺傳試驗材料。前人研究發(fā)現，干旱脅迫會減少大麥的分蘗數、穗數和單株粒重，進而降低籽粒產量，干旱也會對大麥根系的生長發(fā)育產生不良影響。Ryu等報道，大麥泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在其抗旱過程中發(fā)揮重要作用。 Marzec等研究表明，大麥獨腳金內酯(SL)和脫落酸(ABA)共同參與干旱的防衛(wèi)反應。

全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)是進行功能基因定位的重要方法之一。Wehner等利用9K芯片對156份冬大麥材料進行基因分型，獲得3 213個有效的SNP位點，對干旱脅迫下葉片衰老等表型進行性狀GWAS分析，共定位到181個QTLs；Zhang等利用DArT標記對166份野生大麥抗氧化酶活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、鉀濃度等響應干旱脅迫的表型性狀QTL位點進行定位，共關聯(lián)到91個QTL位點。除了基于自然群體的GWAS之外，基于大麥遺傳群體的抗旱QTL定位挖掘也有研究。如Piasecka等用819個標記構建了大麥重組自交系(recombinant inbred line，RIL)群體的高密度遺傳圖譜，以干旱脅迫下代謝物含量作為表型性狀，共定位到138個響應干旱脅迫的QTLs。

目前，在干旱脅迫條件下，前人已經定位到多個控制株高、穗型等表型的QTL，但大麥抗旱機制復雜，仍然需要發(fā)掘更多的調控大麥株型和產量構成的QTL。同時，在建設“絲綢之路經濟帶”上升為國家戰(zhàn)略的新形勢下，充分發(fā)揮新疆絲綢之路經濟帶主體地位，亟需解決新疆大麥種質資源遺傳基礎相對狹窄、優(yōu)異種質資源短缺等問題。鑒于此，本研究以167份從中亞國家(哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦等)收集和引入的中亞大麥為材料，利用簡化基因組測序SLAF-seq技術進行全基因組SNP標記開發(fā)，并在大田環(huán)境下，設置三種水分管理環(huán)境，分別測定其株高、穗長、穗數等農藝性狀并進行GWAS，以期為大麥抗旱基因的克隆和遺傳改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

在1 024份引進種質資源中，篩選出167份中亞地區(qū)大麥品種(系)，其中154份來自吉爾吉斯斯坦，12份來自哈薩克斯坦，1份來自塔吉克斯坦。有1份大麥品種(系)來自中國，由新疆農業(yè)科學院糧作所自育。品種名稱詳見表1。

表1 供試大麥品種(系)Table 1 List of the tested barley varieties(lines)

1.2 方 法

1.2.1 試驗處理及性狀調查

參試材料分別于2018-2019年度種植在新疆農業(yè)科學院奇臺麥類試驗站，隨機區(qū)組排列，3次重復，小區(qū)面積10 m，各處理如下：

正常灌水：分別于出苗期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、灌漿期各灌水600 m·hm。

灌水2次：分別于出苗期、孕穗期各灌水一次，每次灌水600 m·hm。

灌水1次：僅在出苗期灌水一次，灌水量600 m·hm，其他生育階段不灌水。

用CATB法提取參試材料植株幼嫩葉片的DNA。于小麥成熟期，每個處理每個品種(系)選取10株，每株調查株高、主穗穗長、主穗小穗數和單株穗數。依據灌水2次的性狀值和灌水1次的性狀值計算抗旱指數，計算公式如下：

抗旱指數(DI)=旱地性狀值×(旱地性狀值/水地性狀值) /所有品種(系)旱地性狀的平均值。不同處理之間表型的差異分析采用SAS 9.1.3的Duncan法進行。

1.2.2 基因分型與系統(tǒng)進化分析

利用Illumina HiSeq Xten測序儀(Illumina,USA)對167份大麥品種(系)進行SLAF-Seq，共得到1 633.83 Mb reads，平均Q30為 95.46%，平均GC含量為47.35%。共獲得2 638 490個SLAF標簽，其中多態(tài)性的SLAF標簽有1 157 041個。利用bwa軟件，將測序數據比對到大麥基因組(http://plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index)上，并使用GATK和SAMtools兩種方法開發(fā)SNP，以兩種方法得到的SNP標記交集作為最終可靠的SNP標記數據集，共得到6 057 352個群體SNP。使用MEGA X軟件，基于鄰接法，采用Kimura 2-parameter模型，bootstrap重復1 000次，構建各樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹，通過admixture軟件分析研究材料的群體結構，通過EIGENSOFT軟件進行主成分(PCA)分析。

1.2.3 關聯(lián)分析

基于變異檢測的SNP數據，按照MAF≥ 0.05和INT≥0.8進行過濾，獲得479 252個高一致性SNP位點。結合表型數據，利用TASSEL、FaST-LMM和EMMAX軟件進行關聯(lián)分析。其中TASSEL軟件的混合線性模型公式如下：=+++。其中，通過admixture軟件計算樣品的群體結構，通過SPAGeDi軟件計算樣品間的親緣關系。為基因型，為表型，最終每個SNP位點都能得到一個關聯(lián)值。設置≤0.05 和≤ 0.01為閾值線，值經過Bonferroni校正后，將超過閾值線的SNP位點前后100 Kb做為候選區(qū)域，用于后續(xù)候選基因篩選。應用BLAST軟件對候選區(qū)間內的候選基因比對到Nr(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db)、Pfam(http://pfam.xfam.org/)和Swiss-Prot(http://www.gpmaw.com/html/swiss-prot.html)數據庫中進行功能注釋。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對大麥主要農藝性狀的影響

結果(表1)表明，隨著干旱脅迫的加劇，株高和主穗小穗數的抗旱指數有所降低；穗長和單株穗數的抗旱指數有所增加。與CK處理相比，株高在灌水2次和灌水1次的處理下均顯著降低，主穗小穗數在灌水1次的處理下顯著降低，而灌水2次處理與CK處理間無顯著差異；穗長在灌水2次和灌水1次的處理下均顯著增加；單株穗數隨灌水次數的減少呈降低的趨勢，但差異并不顯著。這些結果表明，不同表型對干旱脅迫表現出不同的響應程度。株高和穗長對干旱脅迫的響應較為敏感，且株高能反映不同干旱脅迫的程度；只有干旱比較嚴重時，主穗小穗數才顯著降低。

2.2 大麥群體系統(tǒng)發(fā)育和群體結構分析

為探討大麥的的系統(tǒng)發(fā)育和群體結構，利用測序得到的SNP標記對167份材料構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行群體結構和PCA分析。如圖1 所示，系統(tǒng)發(fā)育樹和PCA分析均未將材料分成明顯的群或者亞群，群體結構分析顯示，最優(yōu)分群數量等于或者超過10。這些結果表明，這些材料在大麥育種中可能經過了頻繁的基因交流，未形成地理亞群。

A：系統(tǒng)發(fā)育樹分析；B：主成分分析；C：群體結構分析；D：群體結構交叉驗證錯誤率。

2.3 與大麥株高和穗部性狀相關聯(lián)的QTL位點

利用性狀表型數據與SNP數據進行GWAS，結果共檢測到8個性狀關聯(lián)位點(表3)，其中正常灌水條件下檢測到1個QTL()，灌水2次條件下檢測到5個QTL(、、、和)，灌水1次條件下檢測到2個QTL(和)。這表明，干旱條件下和正常條件下可能有不同的大麥株高和穗型調控機制，且大麥產量性狀可能有多個微效位點控制，干旱條件下，導致某些位點效應增大，從而在干旱條件下被檢 測到。

表2 不同灌水處理對大麥主要農藝性狀的影響Table 2 Effect of different irrigation treatments on main agronomic traits of barley

表3 與株高和穗部性狀相關聯(lián)的QTL的檢測結果Table 3 Detection result of QTL associated with plant height and spike traits

2.4 與大麥株高和穗部性狀相關聯(lián)的候選基因

將位點前后100 Kb做為候選區(qū)域，對其進行候選基因分析。結果(表4)發(fā)現，調控株高的候選基因有HORVU7Hr1G118490、HORVU7Hr1G118500、HORVU7Hr1G118510、HORVU7Hr1G118520、HORVU7Hr1G118550、HORVU7Hr1G118560和HORVU7Hr1G118570，其中HORVU7Hr1G118560、HORVU7Hr1G118570編碼的蛋白為預測編碼蛋白，HORVU7Hr1G118490、HORVU7Hr1G118500和HORVU7Hr1G 118510編碼的蛋白為鋅脂蛋白，HORVU7Hr1G118520編碼bZIP轉錄因子TRAB1，Hobo等報道發(fā)現，TRAB1是一個反式作用因子，參與ABA誘導的轉錄反應。調控穗長的候選基因有HORVU7Hr1G044080、HORVU7Hr1G 044100、HORVU7Hr1G044150和HORVU7Hr1G 044160，除HORVU7Hr1G044150未能獲得功能注釋外，其他基因注釋均為膜蛋白。

表4 株高、穗長、單株穗數和主穗小穗數QTL位點候選基因的預測結果Table 4 Analysis of QTL candidate genes for plant height,ear length,spike number per plant and spikelet number per main spike

調控單株穗數的候選基因有HORVU6Hr1G-053210、HORVU6Hr1G053970、HORVU6Hr1G053980和HORVU6Hr1G054160，其中，HORVU6Hr1G053970編碼EMG1/NEP1甲基轉移酶，HORVU6Hr1G054160編碼LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶EFR。調控小穗數的候選基因有HORVU6Hr1G075300和HORVU7Hr1G037140， 其中，HORVU6Hr1G075300編碼E3泛素連接酶COP1。

2.5 與抗旱指數相關聯(lián)的位點及其候選基因

利用抗旱指數數據與SNP數據進行GWAS分析，結果共檢測到7個關聯(lián)位點(表5)，與株高、穗長、主穗小穗數和單株穗數相關的抗旱QTL分別有2、2、2和1個，且均與穗型、株高、單株穗數、主穗小穗數四個性狀QTL區(qū)間未重合，且不同性狀抗旱指數相關聯(lián)的QTL也不同。本研究共檢測到96個潛在的候選基因，其中，HORVU4Hr1G084250編碼陽離子質子轉運體(Cation/Hantiporter 2)，可調節(jié)Ca轉運，進而提高抗旱性；HORVU1Hr1G023280和HORVU7Hr1G085130響應干旱脅迫；HORVU1Hr1G081910編碼IAA相關蛋白，預測它們均是抗旱功能基因，但結果還需要進一步驗證。

表5 株高和穗部性狀抗旱指數相關聯(lián)QTL的檢測結果Table 5 Detection result of QTL associated with drought index of plant height and spike traits

3 討 論

本研究對不同水分脅迫下大麥的株高、穗長、單株穗數和主穗小穗數進行關聯(lián)位點鑒定，最終共檢測到8個關聯(lián)位點，分布在大麥4H、5H、6H和7H染色體上。其中正常灌水處理下檢測到1個QTL位點()，灌水2次處理下檢測到5個QTL位點(、、、和)，灌水1次處理下檢測2個QTL(和)。說明響應干旱脅迫的QTL位點主要位于7H染色體上。前人在干旱脅迫下，也鑒定到大麥不同表型的QTL位點，在大麥1H、2H、3H、4H、5H、6H和7H染色體上均有分布，說明大麥抗旱機制具有復雜性。

通過與前人定位到的大麥干旱相關QTL位點進行比較，沒有發(fā)現與本研究檢測到的與株高和穗部性狀相關聯(lián)的QTL(、、、、、和)區(qū)域重合的位點，說明這7個QTL可能為新的QTL位點。

本研究發(fā)現，株高和穗長表現出干旱敏感特性，定位到的關聯(lián)位點和均位于7H染色體上。對于，前人在7H染色體末端也發(fā)現含有調控株高的QTL，但相關基因未被精細定位和克隆。本研究在位點上下游100 kb檢測到HORVU7Hr1G118520基因，預測其編碼bZIP型轉錄因子TRAB1。且TRAB1已經被證明能與ABA應答元件(ABREs)互作，從而調節(jié)ABA誘導的轉錄反應，而ABA廣泛參與干旱脅迫的轉錄調控。推測大麥中TRAB1有可能通過調控大麥株高參與大麥的干旱響應，但還需要進一步分子生物學試驗驗證。對于，Li等報道，調控穗長的位點在7H染色體4 664 447、28 173 688、223 596 641、378 019 002、和605 456 401 bp處，而本研究檢測到的最強的關聯(lián)位點在136 320 595 bp處，推測這可能是一個新的控制大麥穗長的位點。本研究的不足之一在于表型性狀鑒定較少，后期還需繼續(xù)在不同干旱梯度脅迫下鑒定新的表型關聯(lián)位點，進一步發(fā)掘其他的抗旱相關QTL位點。

本研究進一步對定位到的抗旱指數關聯(lián)位點上下游100 kb內潛在的候選基因進行分析，共檢測到96個潛在的候選基因，其中HORVU4Hr1G084250編碼陽離子質子轉運體(Cation/Hantiporter 2)。BAO等研究表明，Cation/H的積累能維持植物胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)和滲透調節(jié)，賦予葉片更高的相對含水量，進而維持高水平的光合作用。因此，推測HORVU4Hr1G084250可能改變Ca的轉運，進而提高大麥的抗旱性。本研究還檢測到HORVU1Hr1G023280和HORVU7Hr1G085130候選基因，注釋到其響應干旱脅迫；HORVU1Hr1G081910編碼IAA相關蛋白，推測也可能跟激素介導的抗旱性相關。此外，本研究還檢測HORVU1Hr1G073940、HORVU1Hr1G077680和HORVU4Hr1G011590候選基因，其中HORVU1Hr1G073940為MYB類轉錄因子，HORVU1Hr1G077680為乙烯反應轉錄因子，HORVU4Hr1G011590為WRKY 類轉錄因子，這幾類轉錄因子都已被證明與抗旱性密切相關，因此，推測這3個候選基因也是潛在的抗旱相關候選基因，但是其具體生物學功能還需要進一步試驗驗證。