耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

禹明均，鄭小鵬，李春江

（1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154000；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae，Kpn）是一種革蘭氏陰性機(jī)會(huì)致病菌，主要在免疫功能低下的個(gè)體中引發(fā)疾病。此外，高毒性Kpn菌株會(huì)在健康個(gè)體中引發(fā)嚴(yán)重疾病，如支氣管炎、敗血癥、腹膜炎等，而莢膜多糖（Capsule Polysacharides，CPS）作為高毒性Kpn的主要毒力決定因素，保護(hù)細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的殺菌活性。碳青霉烯類是治療耐多藥腸桿菌科重癥感染最有效、最可靠的β-內(nèi)酰胺類藥物。近年來(lái)，碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是治療耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌感染的最后一道防線。然而，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了許多對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的細(xì)菌，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-Resistant Klebsiella Pneumoniae，CRKP）就是其中之一。本研究主要綜述CRKP耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展。

1 Kpn的耐藥現(xiàn)狀

碳青霉烯酶的產(chǎn)生是全世界Kpn中碳青霉烯耐藥最常見(jiàn)的機(jī)制。分子診斷方法證實(shí)了絕大多數(shù)CRKP分離株攜帶碳青霉烯酶基因，如Kpn碳青霉烯酶或β-內(nèi)酰胺酶基因。雖然這些分離株的碳青霉烯耐藥性（Carbapenem Resistance，CR）差異很大，但碳青霉烯酶基因的存在的確預(yù)示了表型碳青霉烯的耐藥性。CR的這種變異可能由其他基因型因素驅(qū)動(dòng)，這也有助于碳青霉烯酶和非碳青霉烯酶產(chǎn)生耐碳青霉烯腸桿菌（Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae，CRE）的CR。CRKP中觀察到的一些基因型變異，如碳青霉烯酶基因拷貝數(shù)的變化或轉(zhuǎn)座子亞型和啟動(dòng)子區(qū)域的變化[1]，改變了碳青霉烯酶基因的表達(dá)水平，這可能解釋了碳青霉烯酶耐藥性中的某些變異。其他與碳青霉烯酶表達(dá)不相關(guān)的因素也可能增強(qiáng)碳青霉烯酶的耐藥性，包括擴(kuò)展譜β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)，這可能與孔蛋白缺失引起的碳青霉烯膜通透性降低有關(guān)。

2 CRKP的耐藥機(jī)制

目前，全球CRKP感染不斷增加，臨床上有限的治療方式已不能滿足患者的需求。此外，CRKP通常會(huì)引起醫(yī)院感染，與碳青霉烯敏感的Kpn引起的感染相比，CRKP感染的患者死亡率更高，探究CRKP的耐藥機(jī)制迫在眉睫，以期為臨床指導(dǎo)用藥提供有效的理論依據(jù)。目前，已發(fā)現(xiàn)的Kpn對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制有5種：（1）產(chǎn)碳青霉烯酶，水解碳青霉烯類藥物，是產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制；（2）高水平產(chǎn)頭孢菌素酶（Axiomatic Multi-Platform C，AmpC）/超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs）同時(shí)合并外膜孔蛋白（Outer Membrane Protein，OMP）缺失或表達(dá)量不足；（3）高親和位點(diǎn)青霉素結(jié)合蛋白（Penicillin Binding Proteins，PBPs）的數(shù)量不足或親和力下降；（4）主動(dòng)外排泵系統(tǒng)；（5）形成生物被膜[2]。

2.1 產(chǎn)碳青霉烯酶

β-內(nèi)酰胺酶的命名最初基于氨基酸序列被定義為Ambler分類，將β-內(nèi)酰胺酶分為4個(gè)主要類別：A、B、C、D[3]。其中，包含碳青霉烯酶的A、B、D是Kpn耐碳青霉烯類抗菌藥物的主要機(jī)制。

2.1.1 A類

A類即非金屬β-內(nèi)酰胺酶，可以水解碳青霉烯類、頭孢菌素、青霉素和氨曲南，標(biāo)志著β-內(nèi)酰胺酶活性從主要針對(duì)青霉素和頭孢菌素的酶進(jìn)化為水解碳青霉烯類的酶。A類絲氨酸碳青霉烯酶的代表包括酶NMC-A、IMI、SME和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase，KPC）。KPC已成為A類絲氨酸碳青霉烯酶中人們最熟悉的酶，多在腸桿菌科中被檢測(cè)到，對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類（不包括碳青霉烯類和單內(nèi)酰胺類）有耐藥性。攜帶KPC基因的革蘭氏陰性菌可以攜帶在移動(dòng)遺傳元件上，如轉(zhuǎn)座子（Tn4401b）和多種質(zhì)粒（IncFII、IncL/M和IncN）。表達(dá)KPC基因的生物體通常同時(shí)對(duì)其他類別的抗生素（如喹諾酮類和氨基糖苷類）具有耐藥性。KPC-2生產(chǎn)者引起的CRKP感染率更高，其中，ST11是最常見(jiàn)的譜系。

2.1.2 B類

B類即金屬β-內(nèi)酰胺酶（Metallo Beta Lactamases，MBL），已從不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬中分離出來(lái)，并逐漸與腸桿菌屬成員關(guān)聯(lián)，Kpn、催產(chǎn)桿菌、大腸埃希菌和腸桿菌屬M(fèi)BL通常與維羅納整合子編碼的金屬β-內(nèi)酰胺酶、假單胞菌型和新德里MBL相關(guān)[4]。MBL通常由整合子、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)遺傳元件表達(dá)，這些因素促進(jìn)了MBL的傳播。MBL可有效地水解β-內(nèi)酰胺酶，并且不受β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（克拉維酸、他唑巴坦）的抑制。它們也不同于KPC，因?yàn)樗鼈兒卸r(jià)鋅離子，可在活性位點(diǎn)通過(guò)協(xié)調(diào)組氨酸/胞嘧啶/天冬酰胺殘基并激活結(jié)合的水/氫氧化物分子對(duì)易裂解酰胺的羰基碳進(jìn)行親核攻擊來(lái)參與反應(yīng)。MBL已在不同國(guó)家被確定為Kpn醫(yī)院暴發(fā)的來(lái)源。

2.1.3 D類

D類即β-內(nèi)酰胺酶，由于其對(duì)β-內(nèi)酰胺的水解活性，最初被定性為苯唑西林酶，最近已成為臨床關(guān)注的問(wèn)題。D類β-內(nèi)酰胺酶和鄰氯青霉素（Cloxacillin，OXA）變體具有可變但顯著的碳青霉烯酶活性，通常不被克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦抑制（例外：OXA-2和OXA-32被他唑巴坦抑制但不被舒巴坦和克拉維酸抑制，OXA-53被克拉維酸抑制）[5]。近1/3的OXA變體水解碳青霉烯類。產(chǎn)OXA-48 Kpn的最初病例表現(xiàn)為高度耐藥菌株，因?yàn)樗磉_(dá)其他β-內(nèi)酰胺酶（A類ESBLs SHV-2a、窄譜內(nèi)酰胺酶TEM 1和OXA-47）[6]。雖然OXA-48是已知的對(duì)亞胺培南具有最高催化效率的β-內(nèi)酰胺酶，但含有質(zhì)粒介導(dǎo)的blaOXA-4基因的生物體可有效水解青霉素，而水解碳青霉烯類的水平較低，對(duì)超廣譜頭孢菌素的活性較弱，對(duì)頭孢他啶和頭孢吡肟的水解活性較差。OXA-163的序列與OXA-48的序列相比，缺少4個(gè)氨基酸，對(duì)應(yīng)OXA-48序列的位置DBL222至DBL225。目前，已有200多種OXA酶被報(bào)道，在Kpn中，OXA-48最常見(jiàn)。

2.2 高產(chǎn)AmpC/ESBLs酶合并OMP缺失或表達(dá)量不足

2.2.1 AmpC酶

AmpC β-內(nèi)酰胺酶是一種由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的酶，可以水解廣譜β-內(nèi)酰胺抗生素，包括氨基青霉素和第一、第二以及第三代頭孢菌素，常見(jiàn)基因型包括blaACC、blaCIT、blaEBC、blaFOX、blaMOX和blaDHAgenes 6個(gè)家族[7]。在某些物種中，AmpC β-內(nèi)酰胺酶位于染色體和質(zhì)粒上。AmpC染色體基因向質(zhì)粒轉(zhuǎn)移產(chǎn)生pAmpC，賦予其耐藥性[8]。pAmpC相關(guān)耐藥性的流行率低于ESBLs。

2.2.2 ESBLs

近30年，臨床腸桿菌科分離株中的ESBLs顯著增加。近20年，CTX-M取代SHV，成為全球傳播的主要ESBL類型。亞洲、拉丁美洲和歐洲的研究顯示，大腸埃希菌和克雷伯菌對(duì)頭孢菌素的耐藥性急劇增加，這在很大程度上取決于CTX-M型ESBL的傳播[9]。在我國(guó)，blaCTX-M-14被確定為最常見(jiàn)的ESBL基因。有人提出，blaCTX-M的質(zhì)粒是產(chǎn)生CTX-M的腸桿菌科細(xì)菌增加的主要原因。blaCTX-M基因被發(fā)現(xiàn)與某些復(fù)制子類型的質(zhì)粒相關(guān)，主要包括IncF、IncI1、IncN、IncHI2、IncL/M和IncK。其中，IncF被認(rèn)為在blaCTX-M-15基因的傳播中起重要作用，而IncF、IncK和IncI1在很大程度上有助于blaCTX-M-14基因的傳播。blaCTX-M-3基因主要包含在IncL/M和IncI1質(zhì)粒中，blaCTX-M-9基因主要包含在IncHI2質(zhì)粒中。醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)系統(tǒng)報(bào)告稱，第三代頭孢菌素的耐藥性在5年內(nèi)提高了47%，ESBL的產(chǎn)生在其中起到了至關(guān)重要的作用。

2.2.3 OMP缺失或表達(dá)下降

在革蘭氏陰性菌中，OMP充當(dāng)調(diào)節(jié)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)（如鐵、營(yíng)養(yǎng)素和抗生素）交換的通道。在臨床分離株中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)OMP丟失，尤其在產(chǎn)ESBLs的腸桿菌科中。Kpn包含不同的OMP（OmpK35、36和37）。有報(bào)道稱，在Kpn中，兩種主要孔蛋白OmpK35和OmpK36的缺失或表達(dá)減少與廣泛的抗菌素耐藥性有關(guān)。在產(chǎn)AmpC β-內(nèi)酰胺酶的Kpn中，OmpK35和OmpK36雙重缺失的后果是產(chǎn)生對(duì)亞胺培南的廣泛耐藥性[10]。也有學(xué)者認(rèn)為，Kpn的CR也歸因于孔蛋白丟失和AmpC產(chǎn)生的共同作用，僅這些蛋白質(zhì)中的缺陷不一定會(huì)導(dǎo)致臨床上的抗生素耐藥性[11]。

2.3 PBPs位點(diǎn)缺失或數(shù)量下降

PBPs是細(xì)菌中所有β-內(nèi)酰胺類抗生素的高親和力靶點(diǎn)。眾所周知，所有β-內(nèi)酰胺類都有相同的作用方式：它們通過(guò)充當(dāng)PBP轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域的底物來(lái)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，與PBP的活性位點(diǎn)絲氨酸殘基形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物。傳統(tǒng)上，PBPs被劃分為高分子質(zhì)量PBPs（HMW-PBPs，包括A和B）以及低分子質(zhì)量PBPs（LMW-PBPs），HMW-PBPs對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要，并且是β-內(nèi)酰胺的實(shí)際靶標(biāo)。A類PBP催化聚糖鏈的形成，A類和B類PBP催化細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)肽聚糖干肽的交聯(lián)，而LMW-PBPs的作用微乎其微。有報(bào)道稱，肺炎鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺的敏感性降低在很大程度上與PBP的序列變異相關(guān)，其中，PBP2在CRKP中最常見(jiàn)[12]。

2.4 主動(dòng)外排泵

主動(dòng)外排系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)對(duì)Kpn耐藥性的產(chǎn)生也有不可忽視的作用。外排泵，尤其是多藥外排，是藥物治療的主要關(guān)注點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兛梢耘懦龆喾N具有臨床意義的藥物。外排泵在介導(dǎo)對(duì)多種藥物和生物膜結(jié)構(gòu)的抗性方面占主導(dǎo)地位[13]，其不僅將給定的抗生素?cái)D出細(xì)菌細(xì)胞，還充當(dāng)毒力因子，在感染期間賦予抗菌素耐藥性。簡(jiǎn)言之，這些外排系統(tǒng)允許微生物通過(guò)排出有毒物質(zhì)（例如代謝物、抗菌劑和毒力決定簇的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)表達(dá)）來(lái)平衡內(nèi)部環(huán)境。到目前為止，acrAB、oqxAB和kexD外排系統(tǒng)與Kpn的抗生素耐藥性有關(guān)。除了acrAB、kexD、kdeA、kmrA、kpnEF和oqxAB，EefAB、ketM和CepA等少數(shù)其他外排基因也在Kpn中被報(bào)道。

2.5 生物膜

生物膜是生活在由多糖、蛋白質(zhì)和細(xì)胞外DNA組成的高度水合基質(zhì)中的細(xì)菌群落，這種生活方式賦予細(xì)菌許多優(yōu)勢(shì)（包括抵御外部威脅）。然而，它們也有助于提高細(xì)菌對(duì)抗菌素的耐藥性。據(jù)報(bào)道，19世紀(jì)80年代以來(lái)，Kpn能在體外作為生物膜生長(zhǎng)。Kpn的耐藥性與生物膜形成能力之間存在一定的相關(guān)性已被證實(shí)。有研究表明，氨芐西林不能穿透野生型Kpn生物膜，而環(huán)丙沙星和非反應(yīng)性示蹤劑（氯離子）可快速穿透生物膜。氨芐西林只有在由缺乏β-內(nèi)酰胺酶的突變體形成時(shí)才能穿透生物膜，證明野生型和突變型Kpn生物膜對(duì)氨芐西林和環(huán)丙沙星的耐藥性提高并非由擴(kuò)散緩慢所致。此外，也有研究證明，聚-b-連接的N-乙酰氨基葡萄糖可以介導(dǎo)生物膜的形成并發(fā)揮一定的作用。

3 結(jié)語(yǔ)

Kpn作為一種機(jī)會(huì)致病菌，是泌尿、呼吸道和血液感染的主要原因之一。近年來(lái)，由于抗生素的廣泛應(yīng)用，Kpn的多重耐藥性也隨之出現(xiàn)。CRKP感染患者的死亡率較高，如何處理CRKP是臨床上亟待解決的重要問(wèn)題，開(kāi)展CRKP對(duì)碳青霉烯類耐藥機(jī)制的研究、尋找有效的治療策略勢(shì)在必行。