可溶性環(huán)氧化物水解酶在病理性心臟重構中的意義及研究進展*

周洋，楊沁

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院&天津大學泰達國際心血管病醫(yī)院基礎醫(yī)學研究中心，天津 300457）

心血管疾病是嚴重危害人類健康的重要疾病，其發(fā)病率一直居高不下，是導致城鄉(xiāng)居民死亡的首要原因。心力衰竭（簡稱心衰）是多種心血管疾病的最終臨床轉歸，而心臟重構是心衰的重要病理基礎，其特征為伴有胚胎基因再表達的病理性心肌細胞肥大和心肌細胞外基質過度纖維化或降解增加［1］。目前臨床上缺乏對病理性心臟重構的特異性干預方法，因而對心衰的治療仍面臨未能從根本上阻斷其發(fā)展進程的現(xiàn)狀?？扇苄原h(huán)氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）是多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）代謝通路中的關鍵酶，可通過調節(jié)體內環(huán)氧化物的含量參與多種生理功能和病理改變。本文圍繞sEH在病理性心臟重構中的作用及機制進行綜述。

1 sEH的功能

sEH是在人類由8號染色體上的EPHX2基因編碼，主要存在于細胞質中，但在某些情況下可定位于過氧化物酶體［2］。起初，sEH被報道參與腎臟和肝臟中的生化代謝過程，隨后的研究表明，sEH在多種組織中均有表達，包括血管內皮細胞和心肌細胞［3］。分子結構上，sEH由2個60 kD的單體組成同型二聚體，每個單體都有2個不同的酶活性域：C端α/β水解酶和N端磷酸酶活性結構域。相較于研究明確的C端水解酶功能，N端磷酸酶活性的生理作用目前尚不十分明確。C端結構域中的催化親核基團Asp-333作用于環(huán)氧底物，形成烷基酶中間體，進而水解生成二醇產物［4］。ω-6 PUFAs中的花生四烯酸（arachidonic acid，AA）經(jīng)CYP450催化生成的環(huán)氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）是sEH最主要的底物。EETs在sEH的作用下水解為活性極低的二羥基二十碳三烯酸（dihydroxyeicosatrienoic acid，DHETs），大大削弱了EETs抗炎、抗氧化和舒張血管等一系列的心血管保護作用［5］。在哺乳動物細胞中，EETs對sEH的親和度排序為：14，15-EET＞11，12-EET＞8，9-EET＞5，6-EET［6］。此外，亞麻酸經(jīng)CYP450途徑催化生成的環(huán)氧十八烷酸也可被sEH水解，生成二羥基十八烷酸（dihydroxyoctadecaenoic acid，DiHOME），并且高水平的DiHOME具有促炎、損傷線粒體等有害作用［7-8］。除ω-6 PUFAs外，sEH也催化ω-3 PUFAs經(jīng)CYP450途徑的代謝產物的水解，如二十碳五烯酸的CYP450酶促產物環(huán)氧二十碳四烯酸（epoxyeicosatetraenoic acid，EEQs）和二十二碳六烯酸的CYP450酶促產物環(huán)氧二十二碳五烯酸（epoxydocosapentaenoic acid，EDPs）。有研究表明EEQs和EDPs在心血管系統(tǒng)中同樣具有抗炎保護作用［9］。因此，sEH表達及活性改變可通過調控生物體內環(huán)氧化物的含量從而對心血管系統(tǒng)產生影響。

2 sEH在病理性心臟重構發(fā)生發(fā)展中的作用

sEH活化在病理性心臟重構的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。它參與病理性心臟重構的原發(fā)疾病如高血壓、心肌病和缺血性心臟病的疾病進程，通過多種細胞和分子機制促進心臟重構的發(fā)生發(fā)展。

2.1 sEH參與病理性心臟重構常見病因的疾病進程

2.1.1 sEH參與高血壓的發(fā)生發(fā)展高血壓是心臟重構的關鍵初始誘導因素之一［10］。對EPHX2基因多態(tài)性的研究揭示了rs751141等位基因多態(tài)性與漢族人群原發(fā)性高血壓的相關性［11］。Sinal等［12］在sEH基因敲除小鼠的腎臟中檢測到EETs與DHETs的比例上調，且該基因敲除能顯著降低高鹽負荷高血壓小鼠的收縮壓，首次提供了sEH表達水平與血壓相關性的體內實驗證據(jù)。此后，越來越多的證據(jù)表明在動物模型中抑制sEH具有降壓作用。例如在植有血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）滲透泵的大鼠的腎皮質中檢測到sEH蛋白表達顯著升高，使用sEH抑制劑DCU治療可使收縮壓大幅降低，提示腎臟是sEH抑制劑治療高血壓的靶器官［13］。Jung等［14］報道，水溶性sEH抑制劑AUDA同樣可以在很大程度上減輕Ang II誘發(fā)的高血壓效應，停止AUDA治療使血壓升高，達到未接受治療的高水平，當再次進行AUDA治療時，血壓基本重新降至基礎水平。因此，血壓調節(jié)組織中sEH表達的增加和全身血壓的升高有關，sEH抑制劑可作為治療Ang II型或鹽依賴性高血壓的藥物。同時眾多研究也揭示了sEH在高血壓引發(fā)的壓力過載性心臟重構中的作用。自發(fā)性高血壓大鼠和高血壓心肌病大鼠的心臟中sEH基因轉錄水平均顯著高于野生大鼠，而EETs水平則顯著低于野生大鼠［15］。Ai等［16］證明Ang II可通過轉錄因子AP-1激活sEH基因啟動子活性從而促進sEH表達，應用sEH抑制劑TUPS可顯著抑制Ang II誘導的大鼠心肌細胞肥大。同樣，以藥理學手段或基因敲除手段抑制sEH可抵抗Ang II促小鼠心肌肥厚的作用，且與sEH基因敲除相比，應用sEH抑制劑可在不影響AA代謝的情況下更好地緩解Ang II引起的心功能障礙和心臟重塑的發(fā)生［17］。此外，在壓力過載引發(fā)的小鼠心肌肥厚模型中觀察到心臟組織中成纖維細胞生長因子2表達水平的顯著升高，而sEH基因敲除小鼠未出現(xiàn)該因子表達水平變化及心肌肥厚的表型。在心肌成纖維細胞的體外實驗中觀察到，敲除sEH基因可通過減弱ERK1/2磷酸化抑制Ang II誘導的成纖維細胞生長因子2的表達，證明除心肌細胞外，sEH促心臟重構的作用中也有心肌成纖維細胞的參與［18］。

2.1.2 sEH參與心肌病的病理進程原發(fā)性心肌病和多種原因導致的繼發(fā)性心肌病的發(fā)展過程中均出現(xiàn)心臟不良重構，表現(xiàn)為心室不適當?shù)臄U張或肥厚，心臟的收縮或舒張功能減弱。在異丙腎上腺素誘發(fā)的大鼠心肌肥厚模型中，Althurwi等［19］報道了sEH抑制劑TUPS對肥厚表型的改善作用，而對sEH基因表達的直接抑制還參與了外源性添加的11，12-EET對心肌細胞肥大的逆轉作用。Amara等［20］證明在汞中毒小鼠的心臟組織中，sEH表達和活性顯著增強，11，12-EET和14，15-EET含量降低，抑制sEH可以防止汞中毒所誘導的心肌肥厚。在糖尿病心肌病小鼠心臟和高糖孵育的心肌細胞模型中也檢測到sEH的表達和活性增加，EETs水平降低，DHETs/EETs比值增加，sEH抑制劑t-AUCB可降低肥厚標志物的表達，提高心肌細胞活力，恢復糖尿病小鼠受損的心臟舒張功能，提示sEH激活參與了糖尿病心肌病的進程。進一步的研究顯示抑制sEH后產生的保護作用與ERK1/2和p38的磷酸化減弱有關［21］。在高脂飲食飼養(yǎng)導致肥胖和脂毒性心肌病的小鼠模型中，Wang等［22］觀察到心肌細胞sEH表達增加，而sEH基因敲除可減輕脂毒性心肌病所引起的心功能降低和心肌細胞增大，并且在原代新生小鼠心肌細胞中，sEH敲除或EETs聯(lián)合AUDA治療可顯著減弱棕櫚酸誘導的脂質積累。此外，sEH抑制劑對酒精喂養(yǎng)小鼠的心臟擴張表型和心功能參數(shù)的改善作用為sEH與酒精性心肌病的關系提供了實驗研究的證據(jù)［23］。

2.1.3 sEH在缺血性心臟病中的作用心肌梗死后左心室重構是缺血性心臟病研究領域一直被關注的問題。EPHX2基因多態(tài)性研究顯示了sEH與缺血性心臟病之間的關聯(lián)。如EPHX2Lys55Arg（K55R）突變與白種人缺血性心臟病的風險呈正相關［24］，而Arg287Gln（R287Q）突變則是美國黑人冠狀動脈鈣化程度的獨立預測因子［25］。同時大量動物實驗也揭示了sEH與缺血性心肌損傷及心臟重構的相關性。小鼠Langendorff離體心臟灌流實驗顯示，sEH基因敲除或sEH特異性抑制劑t-AUCB均可恢復左室功能和縮小心肌梗死面積，表現(xiàn)出對心肌缺血再灌注損傷的保護作用［26］。Motoki等［27］報道，在小鼠心肌缺血前30 min或再灌注前10 min腹腔注射sEH抑制劑AUDA可明顯縮小心肌梗死面積，并且AUDA的心肌保護作用可被EET拮抗劑14，15-EEZE消除。在犬類心肌缺血再灌注模型中也觀察到AUDA類似的有益作用，低劑量AUDA與14，15-EET聯(lián)合使用可協(xié)同降低心肌纖維化程度，減少梗死面積［28］。對雌性小鼠給予sEH抑制劑t-AUCB或sEH基因敲除均能顯著抑制心肌梗死后的心臟功能降低和左心室內徑的擴大，并維持正常的線粒體功能，提高心梗后的存活率，提示sEH可能成為女性心梗患者治療的一個相關的藥物靶點［29］。Kompa等［30］證實，sEH抑制劑GSK2188931B在冠狀動脈結扎的大鼠心肌梗死模型中可通過減少梗死灶周圍間質巨噬細胞浸潤，恢復心臟收縮功能和左心室內徑，降低左室纖維化面積。而最近研究者以大鼠的sEH多肽序列成功制備了sEH疫苗，接受該疫苗注射的小鼠在心梗后左室擴張顯著改善，且心臟收縮功能顯著增強，進一步證實了sEH在缺血后左心室重構中的重要作用［31］。在基因多態(tài)性方面，Merkel等［32］報道EPHX2Arg287Gln突變與體外抗缺血耐受性的提高有關，在氧糖剝奪細胞模型中抑制sEH可通過14，15-EET依賴的方式保持心肌細胞活力。此外也有研究顯示sEH的翻譯后修飾也參與缺血再灌注的心肌損傷機制。Ding等［33］在小鼠心肌缺血再灌注模型中檢測到心肌細胞sEH蛋白Cys141殘基的S-亞硝化修飾，這種翻譯后修飾激活了sEH酶活性，而采用NO合酶抑制劑LNAME抑制sEH的S-亞硝化修飾，對缺血再灌注引起的心肌重塑具有顯著的抑制作用。

2.2 sEH活化促進病理性心臟重構的機制

2.2.1 介導氧化應激和內質網(wǎng)應激細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，在多種因素引發(fā)的心臟重構中均有發(fā)生。大量研究證明氧化應激和內質網(wǎng)應激是心臟重構的重要機制并揭示了其在啟動心肌細胞凋亡通路中的作用。內質網(wǎng)應激抑制劑牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）可顯著抑制主動脈縮窄和高血壓誘導的壓力負荷型小鼠的心肌肥厚和心肌纖維化，減輕心肌細胞凋亡［34-35］。對主動脈瓣關閉不全所致容量負荷型心臟重構小鼠模型的研究也證明內質網(wǎng)應激相關凋亡途徑，TUDCA可通過抑制C/EBP同源蛋白介導的內質網(wǎng)應激相關凋亡，最終減輕心肌肥厚，改善心功能［36］。在兔心梗模型中，以NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）的選擇性抑制劑apocynin可減小心肌細胞直徑并減輕心肌纖維化，改善左室功能，而apocynin對內質網(wǎng)應激的抑制作用為氧化應激和內質網(wǎng)應激在心臟重構中的關聯(lián)作用提供了佐證［37］。Fang等［38］在糖尿病心肌病小鼠和高糖高脂處理的心肌細胞中，觀察到sEH抑制劑AUDA通過上調核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的表達并促進其核轉位，進而抑制細胞內氧化應激水平以及調控凋亡相關分子Bcl-2、Bax和caspase-3的表達和激活，減少心肌細胞凋亡，抑制左室擴張。此外，在乙醇誘導的小鼠心衰模型中，給予外源性11，12-EET可抑制氧化應激介導的心肌細胞凋亡，降低心肌細胞橫截面積，改善左室功能［39］。目前，有關sEH活化是否誘發(fā)心肌細胞的內質網(wǎng)應激反應從而介導心臟重構尚未有研究報道，但鑒于在其他組織和器官中有證據(jù)顯示sEH上調可誘導內質網(wǎng)應激以及EETs可抑制內質網(wǎng)應激［40］，該機制很可能參與其中。此外，本研究團隊之前對冠狀動脈內皮損傷的研究表明內質網(wǎng)應激介導了Ang II誘導的sEH表達上調［41］，證明了內質網(wǎng)應激對sEH的激活作用。上述研究表明，sEH活化與內質網(wǎng)應激之間可能存在交互作用。sEH與內質網(wǎng)應激是否通過相互調節(jié)參與心臟重構過程是未來研究需要明確的問題。

2.2.2 促進炎癥反應炎癥在急性和慢性心力衰竭中都普遍存在，且促炎因子水平越高，預后越差。由于sEH是AA信號通路中代謝生物活性環(huán)氧脂肪酸的重要酶，可將其轉化為具有促炎作用的鄰二醇，因而抑制sEH可通過增加體內環(huán)氧化物水平發(fā)揮抗炎作用。Samokhvalov等［42］觀察到sEH基因敲除小鼠對脂多糖誘導的急性炎癥反應具有高度抵抗性。接受脂多糖腹腔注射的sEH基因敲除小鼠血漿中TNFα和MCP-1水平及心肌中NF-κB的DNA結合活性均低于野生型小鼠，心肌氧化應激損傷較小，心臟收縮功能較好。進一步結合心房肌HL-1細胞模型的研究證明，亞麻酸sEH衍生代謝物DiHOMEs的減少是sEH基因敲除后TNF-α和MCP-1釋放減少的重要原因。Zhang等［43］在小鼠動脈粥樣硬化模型中證明sEH抑制劑AUDA可通過抑制NF-κB途徑來降低炎癥細胞因子、黏附分子和趨化因子的表達水平，抑制炎癥反應，從而減少主動脈斑塊面積。Stevenson等［44］報道，在缺血性心肌病患者心臟組織中CCL4、CCL5、TNF-α和IL-16等炎癥細胞因子的表達增加，并結合冠脈結扎的小鼠心肌缺血模型證明其增加與NOX4介導的sEH表達上調有關，而sEH抑制劑TPPU在過表達NOX4基因的心肌細胞中對炎癥因子的抑制作用進一步提示了氧化應激-sEH激活-炎癥信號軸在心肌損傷中的作用。近期的一項研究報道，心梗后的小鼠口服sEH抑制劑TPPU可以顯著降低促炎因子IL-6的水平，減輕心肌肥厚和纖維化程度；更重要的是，抑制sEH可以通過減少氧自由基并抑制細胞凋亡提高人誘導多能干細胞分化的心肌細胞在心梗后小鼠心肌中的移植存活率，促進細胞治療逆轉心臟重構和改善心功能的作用［45］。

2.2.3 雙向調節(jié)自噬在正常的生理條件下，自噬是維持包括心臟在內的器官內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的管家。自噬與心臟重構的密切關系引發(fā)了有關心衰新型標志物的討論［46］。有研究顯示sEH對心肌細胞自噬具有調節(jié)作用。在高脂飲食引發(fā)的脂毒性心肌病小鼠中敲除sEH基因或使用sEH抑制劑可通過上調AMPKmTORC通路介導的自噬，激活自噬通量，減少小鼠心肌細胞中的脂質積累，改善脂毒性心肌?。?2］。對心肌細胞自噬的促進效應也被證實參與了sEH抑制劑AUDA對糖尿病心肌病小鼠的心臟擴張和心臟收縮功能的改善作用，而AUDA增強自噬的作用有賴于Nrf2活性的增強，同時Nrf2也介導了AUDA對心肌細胞凋亡的抑制作用［38］。除增強自噬外，亦有關于抑制sEH后心肌細胞自噬減弱的研究報道。例如，在乙醇喂養(yǎng)的心肌纖維化小鼠模型中，sEH抑制劑TPPU可抑制mTOR磷酸化，降低心肌組織中LC3-II/LC3-I比值，通過恢復體內自噬水平最終改善慢性乙醇攝入導致的心臟擴張和膠原沉積［23］。在異丙腎上腺素誘發(fā)的大鼠心肌肥厚和Ang II誘導的H9c2細胞肥大模型中均觀測到自噬激活，而sEH抑制劑TUPS對抗心肌肥厚的作用與抑制mTORC介導的自噬有關［47］?？梢?，自噬在心臟重構中的作用是復雜的。在不同原因引起的心臟重構中以及重構進程的不同階段可以表現(xiàn)為自噬增強或減弱，而sEH對自噬的正負雙向調節(jié)作用是幫助心肌細胞恢復自噬穩(wěn)態(tài)平衡從而抑制心臟重構的重要機制。

2.2.4 誘發(fā)線粒體損傷線粒體是心臟能量代謝的主要組成部分，其功能障礙可導致多種心血管疾?。?8］。Akhnokh等［49］的研究表明，以t-AUCB治療或sEH基因敲除手段抑制sEH可通過改善線粒體呼吸、增加ATP含量和線粒體酶活性，恢復胰島素敏感性和PI3K活性，顯著提高冠脈結扎小鼠的心臟收縮和舒張功能，降低心肌梗死面積并減輕不良心臟重構，對左心室組織的電鏡觀測結果顯示抑制sEH對梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)線粒體超微結構損傷具有保護作用。在心房肌細胞HL-1饑餓損傷模型中，EETs還可以通過激活自噬系統(tǒng)來維持線粒體池的健康，通過清除受損的線粒體和增強電子傳遞鏈功能促進細胞存活［50］。Langendorff離體心臟灌流實驗結果顯示，sEH基因敲除和11，12-EET處理可防止缺血再灌注后心肌細胞胞膜和線粒體中的小窩蛋白1（caveolin-1，Cav-1）丟失，維持線粒體的正常形態(tài)，保護心臟的收縮功能，且保護作用與Cav-1抑制TGF-β和IL-6的釋放有關［51］。此外，Samokhvalov等［42］還報道了亞麻酸sEH衍生代謝物DiHOMEs增加可降低心肌細胞線粒體的呼吸率，抑制線粒體生物合成和檸檬酸合成酶活性，引起心肌細胞線粒體功能障礙，抑制sEH可通過減少DiHOMEs含量減輕線粒體損傷從而對抗脂多糖引起的心功能障礙。

由此可見，sEH通過多重機制參與心臟病理性重構，各機制并非獨立作用，而是存在交互關聯(lián)。大量動物模型的研究已證明抑制sEH可從細胞、亞細胞器和分子層面影響不良心臟重構的進程，為以sEH為靶點的心血管病治療藥物的應用發(fā)展奠定了基礎。

3 sEH靶點藥物的發(fā)展

3.1 sEH單靶點抑制劑1999年，第一代以尿素為骨架的競爭性sEH抑制劑DCU被研發(fā)，這種抑制劑能抑制sEH中C端環(huán)氧化物水解酶結構域活性，而不影響N端磷酸酶結構域，但其剛性結構和非極性基團使得藥物水溶性差、熔點高，影響了其口服生物利用度［52］。通過向DCU的分子結構中引入柔性烷基鏈，研發(fā)者合成了以AUDA為代表的第二代sEH抑制劑。與DCU相比，AUDA的水溶性大大提高，在保持抑制作用的同時熔點降低，是第一個具有口服活性的sEH抑制劑。然而，由于該類藥物代謝穩(wěn)定性差，對β-氧化極為敏感，臨床應用受到限制［53］。近年來，通過引入環(huán)己基或芳香基，新一代抑制劑（如t-AUCB和TPPU等）被合成。這類抑制劑不僅具有良好的水溶性，而且解決了柔性烷基鏈易于快速氧化和代謝的問題，因而顯著增強了抑制劑的代謝穩(wěn)定性，提高了體內生物利用度。實驗研究表明在大鼠的飲用水中添加TPPU可取得良好的藥理抑制作用，藥代動力學顯著優(yōu)于第二代抑制劑，如AUDA［54-55］。除尿素基sEH抑制劑外，以酰胺為骨架的sEH抑制劑也被研發(fā)，代表藥物有GSK2256294A等。實驗表明pmol級的GSK2256294A即對人和鼠重組sEH蛋白產生抑制效果。在吸煙小鼠模型中，GSK2256294A口服給藥顯示出良好的抑制肺部炎癥的作用［56］。

3.2 雙靶點抑制劑在sEH單靶點抑制劑向著更特異更高效方向持續(xù)發(fā)展的同時，聯(lián)合針對sEH與AA代謝通路中的環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）或脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的雙靶點抑制劑近年來在干預AA級聯(lián)反應方面表現(xiàn)出良好的效能。如sEH/COX-2抑制劑PTUPB［57］、sEH/5-LOX抑制劑compound 7a［58］、sEH/5-脂氧合酶激活蛋白（FLAP）抑制劑diflapolin［59］等。鑒于COX-2［60］和5-LOX［61］對心臟重構的促進作用，聯(lián)合sEH和COX-2或5-LOX的雙靶點抑制劑有望在逆轉心臟不良重構方面展現(xiàn)更好的效果，但還需完善的臨床前研究和藥物臨床試驗予以證實。

4 結語與展望

綜上所述，心臟重構是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段時的共同病理變化。充分理解其發(fā)生機制對發(fā)展有效的干預手段用于心衰防治具有重要的意義。sEH表達增加及活性增強參與高血壓、心肌病和缺血性心臟病等疾病的進程，其可以通過多重相互關聯(lián)的機制促進心臟不良重構的發(fā)生和發(fā)展。sEH抑制劑對氧化應激、內質網(wǎng)應激和炎癥反應的調控，以及對線粒體損傷和自噬失穩(wěn)態(tài)的恢復作用使其有望成為能夠抑制心臟重構進程的靶點藥物。雖然近年來對sEH抑制劑的研究取得了長足進步，亦有已邁入臨床試驗階段的藥物（如GSK2256294）在動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血的II期臨床試驗中顯示出良好的安全性和降低腦脊液中炎癥因子水平的效果［62］，但尚無任何一種sEH抑制劑被正式批準用于臨床。而且，sEH抑制劑能否抑制病理性心臟重構，目前尚缺乏臨床試驗的證據(jù)。未來在該領域仍有大量的工作需要開展，包括對EETs抗氧化應激和抗炎等效應調控心肌細胞、心肌成纖維細胞及細胞外基質重構的分子信號機制的更深度剖析。此外，最新研究揭示多種小分子的sEH抑制劑具有靶點介導的藥物處置特點［63］，進一步理解這種非線性藥代動力學特征對于劑量優(yōu)化、臨床試驗設計及結果闡述具有不可忽視的重要意義。因而，開展更完善的臨床前研究和進行設計嚴謹?shù)乃幬锱R床試驗是推動該類藥物最終走向臨床應用的關鍵所在。