彭云娟，傅芬蕊，鐘文，黃麗雯

福建省寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院檢驗(yàn)科， 福建 寧德 352100

沙門(mén)菌是導(dǎo)致人群食物中毒的重要食源性致病菌之一，全球每年約有300萬(wàn)人死于其所致急性腸胃炎[1]，我國(guó)每年約有3億人因其感染而患病[2]。沙門(mén)菌的血清型約有2 610 種，其中大多數(shù)具有廣泛致病性[3]。沙門(mén)菌通常通過(guò)位于毒力島或質(zhì)粒上的毒力基因編碼一系列毒力因子來(lái)達(dá)到感染宿主的目的，這些毒力因子可相互作用而致病。例如，avrA、ssaQ、sodC1、mgtC、gipA等毒力基因在沙門(mén)菌中普遍存在，且部分基因存在水平轉(zhuǎn)移的可能性。近年來(lái)，福建省寧德地區(qū)發(fā)生了多起食物中毒事件，其中絕大多數(shù)與沙門(mén)菌感染有關(guān)，因此對(duì)寧德地區(qū)沙門(mén)菌感染的流行病學(xué)特征、分子分型、耐藥性和毒力基因進(jìn)行分析具有重要意義，但迄今尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以從寧德地區(qū)分離得到的364株沙門(mén)菌作為分析對(duì)象，對(duì)其流行病學(xué)特征、分子分型、耐藥性和毒力基因進(jìn)行研究，以期為寧德地區(qū)食源性疾病的溯源和防治提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本研究中沙門(mén)菌菌株均由寧德市各大醫(yī)院于2015—2020年分離獲得，共364株，其中325株來(lái)自寧德市醫(yī)院，其余39株分別來(lái)自寧德市中醫(yī)院及寧德市人民醫(yī)院。2015年分離獲得65株，2016年分離獲得74株，2017年分離獲得49株，2018年分離獲得55株，2019年分離獲得44株，2020年分離獲得77株。

1.2 試劑和儀器

主要試劑和儀器有SBG增菌液(美國(guó)BD)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid)、HE瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋)、XbaI內(nèi)切酶(美國(guó)New England Biolabs)、蛋白酶K(美國(guó)Amresco)、診斷血清(丹麥SSI)、藥敏檢測(cè)板(上海星佰)、CHEF Mapper脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)儀(美國(guó)Bio-Rad)、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)、VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀(法國(guó)梅里埃)。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。LMQ.C-80EP型高壓蒸汽滅菌鍋由山東新華醫(yī)療器械股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 分離與鑒定將標(biāo)本保存液接種至SBG增菌液，37 ℃孵育24 h，然后分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和HE瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h。查看細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)可疑菌落進(jìn)行菌種鑒定，獲得沙門(mén)菌屬。

1.3.2 血清分型選取鑒定為沙門(mén)菌的菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行單個(gè)菌落傳代，采用沙門(mén)菌檢測(cè)血清進(jìn)行O相凝集，采用Swarm瓊脂對(duì)菌落進(jìn)行H相凝集及鞭毛誘導(dǎo)，以生理鹽水作為空白對(duì)照，根據(jù)Kauffmann-White表確定血清型。

1.3.3 耐藥性分析按世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。首先制備接種菌液，制作接種平板，貼紙片并孵育。培養(yǎng)后將平板取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌環(huán)直徑，根據(jù)抑菌圈直徑的大小判斷藥敏試驗(yàn)結(jié)果，以大腸埃希菌(ATCC 25922)為質(zhì)控菌株。

1.3.4 PFGE分型[4]參照中國(guó)細(xì)菌性傳染病分子分型實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)(PulseNet China)中的沙門(mén)菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作程序，以沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812作為PFGE分子量標(biāo)準(zhǔn)，將沙門(mén)菌密度調(diào)整為4.5麥?zhǔn)蠞岫?，制成?xì)菌膠塊，再裂解細(xì)菌，洗膠塊，選用XbaI內(nèi)切酶37 ℃酶切3 h，電泳19 h，電泳液溫度14 ℃。電泳結(jié)束后，用GelRed對(duì)膠塊進(jìn)行染色，去離子水洗脫，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用BioNumerics 7.6軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)圖構(gòu)建，最優(yōu)化值和條帶位置差異容許度均設(shè)定為1.5%。

1.3.5 毒力基因檢測(cè)參照文獻(xiàn)[3]，合成9對(duì)擴(kuò)增引物，用以檢測(cè)沙門(mén)菌的9個(gè)毒力基因。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列、擴(kuò)增片段大小如表1所示。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)體系(25 μL)：10×Taq Buffer [含(NH4)2SO4和Mg2+] 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl21.5 μL、2 mmol/L dNTP Mix 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，之后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。

表1 毒力基因檢測(cè)的擴(kuò)增引物[3]

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05代表有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 364株沙門(mén)菌的流行病學(xué)分析

本研究共分離獲得364株沙門(mén)菌。流行病學(xué)分析結(jié)果顯示，男性沙門(mén)菌感染率顯著高于女性(P<0.05)，0～10歲組人群感染率顯著高于其他年齡組(P<0.05)，農(nóng)村人群感染率顯著高于城市人群(P<0.05)。結(jié)果具體如表2所示。

2.2 364株沙門(mén)菌的血清分型

對(duì)364株沙門(mén)菌進(jìn)行血清分型，共分出22個(gè)血清型。其中：鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、斯坦利沙門(mén)菌占比居前3位，分別為57.42%、16.21%、6.87%，為主要血清型。結(jié)果具體如表3所示。

表2 364株沙門(mén)菌的流行病學(xué)分析

2.3 沙門(mén)菌主要血清型對(duì)部分抗生素的耐藥性分析

對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、斯坦利沙門(mén)菌進(jìn)行耐藥性分析。結(jié)果顯示，除環(huán)丙沙星外，鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)其他抗生素均有一定的耐藥性，且對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑、四環(huán)素、鏈霉素的耐藥率較高；腸炎沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑、四環(huán)素、鏈霉素、甲氧芐啶的耐藥率較高；斯坦利沙門(mén)菌對(duì)試驗(yàn)用抗生素的耐藥率均未超過(guò)50%，對(duì)頭孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢吡肟未表現(xiàn)出耐藥性。結(jié)果具體如表4所示。

表3 364株沙門(mén)菌的血清分型

表4 沙門(mén)菌主要血清型的耐藥性分析

2.4 364株沙門(mén)菌的PFGE分子分型特征

經(jīng)聚類(lèi)分析PFGE圖譜，結(jié)果顯示364株沙門(mén)菌共有212種帶型。按時(shí)間分布如下：1～3月 6.25%、4～6月19.53%、7～9月40.60%、10～12月33.60%。按地區(qū)分布如下：蕉城區(qū)18.25%、東僑區(qū)14.35%、漳灣區(qū)12.58%、金涵區(qū)39.64%、古田縣8.45%、霞浦縣4.26%、其他區(qū)域2.47%。按人群年齡結(jié)構(gòu)分布如下：≤1歲組28.30%，1～2歲組24.18%，2～8歲組20.88%，8～18歲組0.82%，18～50歲組9.89%，>50歲組15.93%。帶型相似度為44.52%～100.00%，優(yōu)勢(shì)帶型為B53，共23株，且全部為腸炎沙門(mén)菌。84株鼠傷寒沙門(mén)菌共分離出25種帶型，帶型相似度為92.45%；79株腸炎沙門(mén)菌共分離出38種帶型，帶型相似度高達(dá)98.64%，其中2018年的19株腸炎沙門(mén)菌帶型相似度為100.00%，高度同源。結(jié)果具體如圖1所示。

2.5 364株沙門(mén)菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)364株沙門(mén)菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，結(jié)果顯示avrA、ssaQ、sodC1、mgtC、gipA的攜帶率均為100.00%，ssiD、sopE、sopB、spvC的攜帶率分別為90.66%、 94.23%、 92.03%、 63.74%(詳見(jiàn)表5)。

圖1 364株沙門(mén)菌的PFGE分子分型特征

表5 364株沙門(mén)菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

沙門(mén)菌是導(dǎo)致人類(lèi)食物中毒和細(xì)菌性感染性腹瀉的主要病原菌之一，且已演化出一系列逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的策略[5-6]。本研究針對(duì)從福建省寧德地區(qū)近5年來(lái)分離獲得的364株沙門(mén)菌的流行病學(xué)資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)男性沙門(mén)菌感染率顯著高于女性(P<0.05)，這與李幗寧等[7]的研究結(jié)論一致。其原因可能與男性，特別是男性?xún)和^易嘗試和接觸不潔凈的食物有關(guān)。同時(shí)，0～10歲人群的感染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他年齡段人群(P<0.05)，構(gòu)成比超過(guò)2/3，提示兒童是沙門(mén)菌的主要易感人群，應(yīng)對(duì)此予以足夠重視并重點(diǎn)保護(hù)。其中，又以2歲以下幼兒的感染率最高，構(gòu)成比接近40%。這可能是因?yàn)橛變耗c道免疫功能未完全發(fā)育成熟，對(duì)細(xì)菌等致病微生物的抵抗力較弱，更容易發(fā)生腸道傳染病[1]。農(nóng)村人群的沙門(mén)菌感染率顯著高于城市人群(P<0.05)，這可能與農(nóng)村暴露于自然外環(huán)境的機(jī)會(huì)更多，食物和水源更易受動(dòng)物糞便等污物的污染，衛(wèi)生條件較于城市仍較差，且與牲畜等動(dòng)物接觸機(jī)會(huì)較多有關(guān)。對(duì)沙門(mén)菌的基因分型進(jìn)行分析，364株沙門(mén)菌共分離出212種帶型，顯示出寧德地區(qū)沙門(mén)菌的遺傳多樣性，鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌的帶型相似度均在90%以上，顯示出高度同源性。腸炎沙門(mén)菌的帶型相似度高達(dá)98.64%，表明近5年來(lái)寧德地區(qū)發(fā)生的食物中毒較大可能來(lái)源于同一分子分型的腸炎沙門(mén)菌感染，應(yīng)引起相關(guān)部門(mén)的高度重視，可以此為依據(jù)進(jìn)行溯源追蹤研究，避免腸炎沙門(mén)菌的暴發(fā)感染。

對(duì)364株沙門(mén)菌的血清分型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示22個(gè)血清型中鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、斯坦利沙門(mén)菌占比位居前3位，與世界衛(wèi)生組織全球沙門(mén)菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示的趨勢(shì)[8]基本相符。高紅梅等[9]曾對(duì)我國(guó)部分地區(qū)2014—2018年腹瀉患者的監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌在非傷寒沙門(mén)菌血清型中占比最高，與本研究結(jié)果一致。邱玉鋒等[10]對(duì)福建省部分地區(qū)2010—2016年腹瀉患者的菌株血清型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌也位居前兩位。此外，本研究中斯坦利沙門(mén)菌的分離率也較高，有資料顯示該血清分型的沙門(mén)菌曾在武漢等地的腹瀉患者中顯示出流行趨勢(shì)[11]。李幗寧等[7]對(duì)沈陽(yáng)市康平縣進(jìn)行沙門(mén)菌流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示斯坦利沙門(mén)菌的分離率較高，達(dá)23.46%，本研究中該血清分型的分離率為6.87%，顯著低于康平縣的數(shù)據(jù)，但依然在血清型分析中居第3位。

分析沙門(mén)菌的3種主要血清型對(duì)主要抗生素的耐藥性，結(jié)果顯示沙門(mén)菌對(duì)第3、4代頭孢菌素有較高的敏感率，可作為治療沙門(mén)菌感染的首選藥物。對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異噁唑、鏈霉素、甲氧芐啶顯示出較高的耐藥率，可能與沙門(mén)菌屬中許多菌株共同存在的耐藥基因島SGI1有關(guān)[12]。一直以來(lái)，氨芐西林、磺胺異噁唑被認(rèn)為是治療沙門(mén)菌感染的有效藥物，但不合理使用抗生素情況的廣泛存在，導(dǎo)致沙門(mén)菌對(duì)其耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，并表現(xiàn)出來(lái)回波動(dòng)的特點(diǎn)[13-14]。本研究還顯示，腸炎沙門(mén)菌對(duì)抗生素的耐藥性總體上略高于鼠傷寒沙門(mén)菌和斯坦利沙門(mén)菌。結(jié)合寧德地區(qū)沙門(mén)菌的基因分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門(mén)菌的帶型相似度極高，有可能在該地區(qū)作為最主要血清型遠(yuǎn)超5年，在長(zhǎng)期臨床治療中該血清型對(duì)氨芐西林等藥物表現(xiàn)了較強(qiáng)的耐藥性。這提示在未進(jìn)行沙門(mén)菌血清型分析之前，可優(yōu)先選用腸炎沙門(mén)菌耐藥性較低的藥物(如頭孢他啶)進(jìn)行治療，可降低初次抗菌藥物使用即耐藥的概率。

沙門(mén)菌的致病性是由其所攜帶的大量毒力因子(結(jié)構(gòu)性毒力因子、腸毒素、毒力島及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等)的相互作用所致，與其毒力相關(guān)的基因在沙門(mén)菌中普遍存在，且某些基因存在水平轉(zhuǎn)移的可能性[15-16]。本研究結(jié)果顯示，寧德地區(qū)沙門(mén)菌毒力基因avrA、ssaQ、sodC1、mgtC、gipA、ssiD、sopE、sopB的攜帶率均在90.00%以上，只有spvC的攜帶率較低，但也達(dá)到了63.74%。有研究曾對(duì)2008—2012年上海市腸炎沙門(mén)菌分離株的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)毒力基因sopE、avrA、spvC的攜帶率分別為 100.0%、98.9%、78.9%[17]，與本研究的結(jié)果接近。肖蕊等[18]對(duì)62株食源性沙門(mén)菌分離株的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出mogA、ssel、mgtC、siiE、sopB5種毒力基因，其中mgtC、sopB的攜帶率分別為75.81%和51.61%。寧德地區(qū)沙門(mén)菌的毒力基因攜帶率均較高，可作為宿主溯源的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為該地區(qū)細(xì)菌致病性機(jī)制研究提供參考。

綜上所述，福建省寧德地區(qū)沙門(mén)菌感染人群集中在10歲以下兒童，男性高發(fā)，具有一定的遺傳多樣性，且毒力基因的攜帶率較高，相關(guān)部門(mén)應(yīng)對(duì)此予以重點(diǎn)關(guān)注。