李 帆，張琴星，童祥文，田高輝，顧力行，徐 瑤

武漢科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢430081

1975年，洛克菲勒大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教授Bloble等［1］在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)新合成的蛋白質(zhì)具有內(nèi)源性信號(hào)，即信號(hào)肽（signal peptide，SP），最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，他提出了“信號(hào)假說(shuō)”，用以解答蛋白質(zhì)合成后的去向問(wèn)題。SP是一段存在于前體蛋白N-端的短肽鏈，能夠調(diào)節(jié)前體蛋白的折疊和轉(zhuǎn)移。研究［2-5］表明，在原核系統(tǒng)中，SP附著后，外源基因能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并分泌，如芽孢桿菌、乳酸桿菌、L型細(xì)菌、大腸桿菌等。除此之外，SP還廣泛應(yīng)用于真核表達(dá)系統(tǒng)，如昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)［6-9］。由此可見(jiàn)，SP在蛋白質(zhì)的分泌過(guò)程中扮演著極其重要的角色，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，優(yōu)化SP序列對(duì)于提高外源蛋白的分泌量及活性具有重要的實(shí)際意義。

嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞（chimeric antigen receptor T lymphocyte，CAR-T）技術(shù)是通過(guò)分子生物學(xué)和基因工程改造技術(shù)，將靶向特異性抗原的單鏈抗體的輕重鏈可變區(qū)（single chain antibody variable fragment，scFv）序列在患者的T細(xì)胞膜表面表達(dá)，進(jìn)而特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療癌癥的目的。CAR的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)中包括一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)（通常來(lái)源于抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scFv段）、一個(gè)細(xì)胞外鉸鏈區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)［10-11］。細(xì)胞膜外部分是從單克隆抗體中純化的抗原靶向部分，該抗體由scFv（重鏈和輕鏈可變區(qū)的融合蛋白）組成。scFv中的SP對(duì)自身的表達(dá)尤為重要，scFv的N端SP具有三重結(jié)構(gòu)，并且與分泌蛋白的SP具有相同的特征［12-13］：疏水性α螺旋核心（h區(qū)），其N(xiāo)端側(cè)翼為極性氨基酸殘基（n區(qū)）。C端側(cè)翼在裂解位點(diǎn)（c區(qū)）的-1和-3處含有螺旋斷裂的脯氨酸和甘氨酸殘基，以及小的不帶電荷的殘基。scFv一旦與腫瘤抗原結(jié)合，它就會(huì)觸發(fā)T細(xì)胞活化并導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放和T細(xì)胞增殖［14］。SP能促進(jìn)CAR在T細(xì)胞膜表面的表達(dá)，因此，對(duì)SP結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化和選擇是提高CAR表達(dá)水平的重要方法。

本研究以CD19為CAR-T治療靶點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建4種不同SP的CD19-CAR表達(dá)載體，研究4種不同來(lái)源的SP對(duì)CAR-T轉(zhuǎn)染效率的影響，并驗(yàn)證其對(duì)CD19陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，為臨床治療急性淋巴細(xì)胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）提供新的CAR-T治療方案。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人胚腎細(xì)胞293T、K562細(xì)胞系和NALM-6細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），K562-CD19細(xì)胞系為武漢波睿達(dá)生物科技有限公司饋贈(zèng)，大腸桿菌DH5α感受態(tài)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

慢病毒表達(dá)載體BRD-PTK-Kan購(gòu)自武漢波睿達(dá)生物科技有限公司（自行構(gòu)建并保存），慢病毒包裝載體pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G均購(gòu)自美國(guó)Addgene公司，大量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司，胎牛血清、DMEM-Basic、RPMI-1640培養(yǎng)基及0.25%的Trypsin-EDTA均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，PE-Labeled Human CD19 Protein購(gòu)自北京百普賽斯生物科技有限公司，7-AAD購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司，鈣黃綠素購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Human IFN-γ precoated ELISA kit（Cat:1110002）和Human TNF-α precoated ELISA kit（Cat:1117202）ELISA試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為生物科技股份有限公司。寡核苷酸引物由武漢擎科生物科技有限公司合成。

1.2 4種不同SP的CD19-CAR分子的設(shè)計(jì)

CD19-CAR分子的單鏈抗體片段來(lái)源于GenBank：HM852952.1，將細(xì)胞外域CD19-scFv（包含SP1序列）、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)域共刺激因子CD28、4-1BB及CD3ζ依次串聯(lián)連接，獲得完整的CD19-CAR片段，CD19抗原的scFv可在細(xì)胞膜上穩(wěn)定表達(dá)。然后通過(guò)分子克隆技術(shù)將SP2、SP3、SP4替換CD19-CAR中原有的SP1，即可得到含不同SP的CD19-CAR分子。SP序列如表1所示。

表1 SP的核苷酸和氨基酸序列及來(lái)源Tab.1 Nucleotide and amino acid sequences and sources of SP

1.3 分子重組技術(shù)構(gòu)建不同SP的PTK-CD19-CAR 載體

通過(guò)基因合成得到序列大小為792 bp的CD19-scFv序列，包括SP1、VL輕鏈、Linker連接肽和VH重鏈。此外，基因合成得到大小為804 bp的基因序列，包括hinge、共刺激因子CD28、41BB及CD3ζ等結(jié)構(gòu)。

通過(guò)重疊PCR 技術(shù)，將上述兩段序列連接，得到CD19-CAR 片段，然后使用引物CAR-F、CAR-R（表2），擴(kuò)增獲得不含SP1的CAR片段。用表2的引物序列分別擴(kuò)增基因合成的SP2、SP3、SP4，使其帶有相同的同源臂，然后與不含SP1的CAR片段連接即可獲得含有不同SP的CD19-CAR片段。隨后，通過(guò)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，利用亞克隆技術(shù)將其連接至慢病毒表達(dá)載體BRD-PTK-Kan。最終獲得分別含4種SP的CD19-CAR目的載體，即SP1-CD19-CAR、SP2-CD19-CAR、SP3-CD19-CAR和SP4-CD19-CAR，用于慢病毒包裝。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)K562細(xì)胞系、K562-CD19細(xì)胞系和NALM-6細(xì)胞系。HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基，原代T細(xì)胞培養(yǎng)使用含1 000 U/mL IL2、1∶1 000的HEPES 1M、1∶1 000谷氨酰胺的TexMACS? GMP培養(yǎng)基；細(xì)胞通過(guò)添加或替換新鮮培養(yǎng)基維持生長(zhǎng)，換液需要300×g離心5 min 去細(xì)胞上清，然后按2×106～3×106個(gè)/mL 的細(xì)胞密度添加培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻后置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 慢病毒的包裝、濃縮及滴度測(cè)定

利用第3代慢病毒包裝系統(tǒng)，由慢病毒包裝載體pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G和慢病毒表達(dá)質(zhì)粒組成。用PEI轉(zhuǎn)染法將慢病毒系統(tǒng)4種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染比例為12∶10∶6∶5，然后37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后收集上清液，采用超速離心法進(jìn)行濃縮。滴度測(cè)定：采用6孔板，每孔鋪5×105個(gè)HEK-293T細(xì)胞，每孔分別加入0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μL的病毒，并加入聚凝胺（polybrene），使其濃度為5 μg/mL 。并設(shè)置陰性對(duì)照，72 h后通過(guò)PE-Labeled Human CD19 Protein用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率并計(jì)算慢病毒滴度。每種病毒量設(shè)置2 組平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞構(gòu)建CD19-CAR-T

顯微鏡下觀察待轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取需要數(shù)目的生長(zhǎng)狀況良好的待轉(zhuǎn)細(xì)胞；于6孔板中按感染復(fù)數(shù)等于5計(jì)算需要加入慢病毒濃縮液的量，補(bǔ)加Polybrene使其終濃度為5 μg/mL；37 ℃斜置溫育4 h，最后補(bǔ)加培養(yǎng)基至正常培養(yǎng)濃度。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒感染T細(xì)胞表面CD19-CAR的表達(dá)

收集＞5×105個(gè)轉(zhuǎn)染待測(cè)轉(zhuǎn)效或表面表達(dá)的細(xì)胞于流式管中，并選取未染色或未處理細(xì)胞作為陰性對(duì)照。向每管中加入1～2 mL流式細(xì)胞術(shù)用Buffer（PBS＋2%～5%FBS，F(xiàn)BS維持細(xì)胞活性），300×g，離心5 min，去掉上清液，重復(fù)洗2遍，用流式細(xì)胞術(shù)用Buffer配制好工作濃度的染色抗體，并除盡離心后的上清液，重懸細(xì)胞于配制好的抗體中，4 ℃避光染色30 min。加入1～2 mL流式細(xì)胞術(shù)用Buffer終止染色，300×g，5 min離心，去掉上清液，重復(fù)洗2遍，加 2 μL 7-AAD 抗體（稀釋比例 1∶100）于 0.2 mL流式細(xì)胞術(shù)用Buffer中重懸細(xì)胞，2～3 h之內(nèi)流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。

1.8 鈣黃綠素釋放法檢測(cè)各種SP CD19-CAR-T的細(xì)胞毒性

以T、SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19 和SP4-CD19細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，陽(yáng)性靶細(xì)胞為表達(dá)CD19的NALM-6細(xì)胞系和K562-CD19細(xì)胞系，陰性靶細(xì)胞為不表達(dá)CD19的K562細(xì)胞系。將靶細(xì)胞用calcein-AM 標(biāo)記后，將其接種于U底96孔培養(yǎng)板（100 μL/孔），接種密度為1 × 105個(gè)/mL。將體積為100 μL/孔，不同效靶比（25∶1、5∶1、1∶1）的效應(yīng)細(xì)胞加入對(duì)應(yīng)孔中，共培養(yǎng)體系用含5%胎牛血清的PBS。設(shè)置：陽(yáng)性對(duì)照組（加入裂解液）和陰性對(duì)照組（加入 PBS），各組均設(shè) 4個(gè)復(fù)孔，37 ℃生化培養(yǎng)箱中溫育3 h。將96 孔板在常溫下700×g離心10 min，將每個(gè)孔中所有的上清轉(zhuǎn)移至新的平底96孔板預(yù)標(biāo)記的對(duì)應(yīng)的孔中。分參數(shù)設(shè)置酶標(biāo)儀：激發(fā)光波長(zhǎng)485/20，發(fā)射光波長(zhǎng)530/25，掃描讀取熒光值。各組效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性根據(jù)以下公式計(jì)算：特異性殺傷百分率（%）=（實(shí)驗(yàn)組熒光值-陰性對(duì)照組熒光值）/（最大釋放組熒光值-陰性對(duì)照組熒光值）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.9 ELISA法檢測(cè)各種SP CD19-CAR-T內(nèi)IFN-γ和TNF-α的分泌水平

取適量的靶細(xì)胞，加入5×103個(gè)K562細(xì)胞于96孔板中，作為陰性靶細(xì)胞組，陽(yáng)性靶細(xì)胞組加入5×103個(gè)CD19＋的NALM-6 細(xì)胞，而空白組中不加入靶細(xì)胞，體積為100 μL。按照效應(yīng)細(xì)胞比靶細(xì)胞為10∶1，加入T 細(xì)胞和4種SP的CD19-CAR-T（5×104個(gè)/孔，體積100 μL）于對(duì)應(yīng)的孔中，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為共培養(yǎng)體系。37 ℃生化培養(yǎng)箱中溫育24 h后，將96 孔板常溫，700×g，10 min離心后收集100 μL上清液，按酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒的說(shuō)明書(shū)常溫操作檢測(cè)IFN-γ和TNF-α的分泌水平，在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度（D）值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各樣本細(xì)胞因子的含量（pg/mL）。

1.10 數(shù)據(jù)分析

本研究采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建分別含4種SP的CD19-CAR 重組質(zhì)粒

利用基因合成和分子克隆技術(shù)成功獲得了含不同SP的CD19-CAR片段（圖1A），將4種CD19-CAR分子亞克隆至慢病毒載體BRD-PTKKan上。通過(guò)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定，CD19-CAR分子的重鏈VH結(jié)構(gòu)含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)，則CD19-CAR分子被切成一段帶SP的序列和一段大小為1 052 bp大小的序列。結(jié)果顯示，含4種SP的重組質(zhì)粒酶切后可見(jiàn)4條帶SP的序列大小分別為 544、547、550和541 bp，兩段序列加起來(lái)的大小與攜帶不同SP的CD19-CAR片段一致（圖1B）。此外，載體測(cè)序結(jié)果證實(shí)，4種CD19-CAR片段基因序列和插入的閱讀框與設(shè)計(jì)完全相符，證明4種慢病毒表達(dá)質(zhì)粒SP1-CD19-CAR、SP2-CD19-CAR、SP3-CD19-CAR和SP4-CD19-CAR構(gòu)建成功。

圖1 含4種不同SP慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant lentiviral plasmid containing four different SP

2.2 成功制備4種慢病毒載體

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，用濃縮的4種病毒液分別以 0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 μL的體積轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，以病毒添加量為0.4 μL 時(shí)計(jì)算對(duì)應(yīng)的4 種慢病毒（S P 1、SP2、SP3和SP4）的滴度。結(jié)果顯示，SP4［（2.80±0.10)×108TU/mL］慢病毒的滴度顯著高于SP1［（1.40±0.09)×108TU/mL］、SP2［（1.70±0.11)×108TU/mL］、SP3［（2.10±0.19)×108TU/mL］（P＜0.01，圖2A），證明4種慢病毒包裝成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外，如圖2B所示，病毒添加量為0.4 μL時(shí)對(duì)應(yīng)的4種慢病毒（SP1、SP2、SP3和SP4）的轉(zhuǎn)染效率分別為11.3%、13.1%、16.6%和23.5%。

圖2 4種慢病毒的成功制備Fig.2 Successful preparation of four lentiviruses

2.3 4種不同SP的CD19-CAR在T細(xì)胞中的表達(dá)差異分析

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同SP對(duì)CAR-T轉(zhuǎn)染效率的影響，結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染效率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且SP4-CD19組顯著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19組（P＜0.05）（圖3A）。并且在轉(zhuǎn)染效率最高的第6天檢測(cè)4組慢病毒感染組的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，含4種SP的慢病毒（SP1、SP2、SP3和SP4）感染的T細(xì)胞成功表達(dá)CD19-CAR的比例分別為20.9%、22.6%、31.5%和38.6%（圖3B）。此外，本研究還檢測(cè)了相同時(shí)間點(diǎn)CD19陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示，SP4-CD19組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于其他3組（圖3C），細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含不同SP的CAR結(jié)構(gòu)對(duì)CAR-T細(xì)胞的增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖 3D）。

圖3 4種CD19-CAR分子在T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率及增殖情況Fig.3 Transfection and expression rate of four CD19-CAR in the T cells and its proliferation activity

2.4 4種不同SP的CD19-CAR-T對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效率

本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)4種SP的CAR-T的體外殺傷效力，實(shí)驗(yàn)選擇不表達(dá)CD19的K562細(xì)胞作為陰性靶細(xì)胞，K562-CD19細(xì)胞（CD19穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系）和NALM-6細(xì)胞（CD19表達(dá)陽(yáng)性率為99.6%和99.5%），作為陽(yáng)性靶細(xì)胞（圖4A）。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4B）顯示，用第6天的CAR-T殺傷靶細(xì)胞，在效靶比相同的條件下SP4-CD19細(xì)胞對(duì)K562-CD19腫瘤細(xì)胞的殺傷作用顯著高于SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19細(xì)胞和T細(xì)胞［效靶比為25∶1時(shí)，分別為（36.77±2.42）%、（15.15±1.35）%、（18.80±0.30）%、（31.58±1.47）%、（9.04±3.25）%，P＜0.01］。同樣SP4-CD19細(xì)胞對(duì)NALM-6腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯高于SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19和T細(xì)胞［效靶比為25∶1時(shí)，分別為（23.43±1.13）%vs（11.16±0.48）%、（10.54±2.27）%、（1 7.9 0±1.5 3）%和（8.2 7±2.7 5）%，P＜0.01］。而兩者對(duì)CD19-腫瘤細(xì)胞K562的殺傷作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［效靶比為25∶1 時(shí)，分別為（3.75±0.95）%vs（3.06±0.80）%、（2.4 2±0.7 9）%、（4.0 0±1.0 6）%和（1.92±0.76）%，P＞0.05］。

圖4 4種CD19-CAR-T對(duì)CD19+靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)Fig.4 Killing effect of four CD19-CAR-T on CD19+ target cells

2.5 4種不同SP的CD19-CAR-T中IFN-γ和TNF-α的分泌

前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α可發(fā)揮協(xié)同作用殺死腫瘤細(xì)胞，因此本研究采用ELISA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的釋放情況［15-16］。結(jié)果顯示，效靶比為10∶1 時(shí)，共培養(yǎng)24 h后，陽(yáng)性靶細(xì)胞組與空 白 細(xì) 胞 組 相 比，T 細(xì) 胞I F N-γ 和T N F-α 的分泌水平?jīng)]有顯著變化［IFN-γ：（894.90±8.83）pg/mLvs（649.60±64.70）pg/mL，P＞0.05；TNF-α：（419.80±8.81）pg/mLvs（401.60±25.80）pg/mL，P＞0.05］，而4種不同SP的CD19-CAR-T中IFN-γ和TNF-α的分泌水平在陽(yáng)性靶細(xì)胞組中顯著升高（圖5）。在陽(yáng)性靶細(xì)胞組中，SP4-CD19細(xì)胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平比SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19細(xì)胞和T細(xì)胞顯著升高［IFN-γ：（5 819.00±281.90）pg/mLvs（2 626.00±154.50）pg/mL、（3 089.00±173.50）pg/mL、（3 844±39.08）pg/mL、（894.90±8.83）pg/mL，P＜0.01；TNF-α：（5 004.00±169.50）pg/mLvs（3 014.00±85.20）pg/mL、（3 351.00±66.43）pg/mL、（3 922.00±63.38）pg/mL和（419.80±8.81）pg/mL，P＜0.01］。

圖5 4種CD19-CAR-T IFN-γ和TNF-α分泌水平Fig.5 The secretion levels of IFN-γ and TNF-α among four CD19-CAR T

3 討論

ALL是淋巴細(xì)胞在分化早期惡性增殖造成的，可侵犯骨髓、血液和髓外部位，發(fā)病率高，預(yù)后和生存率不理想［17-18］。CAR-T免疫治療能靶向性地殺傷具有特異性抗原的ALL細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)殺傷作用，這將大大降低脫靶效應(yīng)，為ALL的臨床治療提供新的策略。有研究［19-20］表明，增加CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)可以增加CAR-T的抗腫瘤能力，這為治療ALL提供了一個(gè)全新的方案。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)不同SP的CD19-CAR分子的T細(xì)胞，并在體外驗(yàn)證出其具有靶向特異性，CD19抗原CAR對(duì)CD19＋ALL細(xì)胞有較為明顯的殺傷作用，并且SP4-CD19細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和對(duì)CD19＋ALL細(xì)胞的殺傷作用明顯高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19細(xì)胞。該研究結(jié)果為CAR-T在臨床轉(zhuǎn)化中的優(yōu)化方案提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

近年來(lái)，靶向CD19的CAR-T在白血病的治療中取得了重大突破［21-22］，關(guān)于CAR結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)域改造方面的研究也越來(lái)越深入，而對(duì)scFv的N端SP研究較少。CAR的主要結(jié)構(gòu)包括抗原結(jié)合區(qū)（包含SP）、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)［23］。這些元件都有各自獨(dú)特的功能，可以通過(guò)使用來(lái)源于各種蛋白的結(jié)構(gòu)域組合，來(lái)優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)。因此，為了增強(qiáng)CAR結(jié)構(gòu)在T細(xì)胞表面的表達(dá)及殺傷作用，本研究主要采用由單鏈抗體scFv、CD28跨膜區(qū)、CD28細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞內(nèi)共刺激域4-1BB和CD3ζ鏈組成的第三代CAR的結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了抗原結(jié)合區(qū)SP結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。從細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，攜帶不同SP的SP-CD19 CAR-T對(duì)CD19＋ALL細(xì)胞表現(xiàn)出特異性的殺傷效果，由此可以證明，不同的SP能夠影響CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)以及對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。

從研究結(jié)果可以看出，SP4-CD19細(xì)胞較其他SP的SP-CD19細(xì)胞對(duì)CD19＋ALL細(xì)胞殺瘤效應(yīng)顯著增強(qiáng)。ELISA法檢測(cè)IFN-γ和TNF-α分泌水平結(jié)果顯示，在CD19＋腫瘤細(xì)胞刺激下SP4-CD19細(xì)胞較其他SP的SP-CD19細(xì)胞IFN-γ和TNF-α分泌水平顯著提高。研究表明，改造SP是一種有效增加重組蛋白表達(dá)量的方式［24］，并且SP具有極強(qiáng)的異質(zhì)性，許多SP即使在不同物種之間也具有功能上的互換性［25］。這可能與CAR結(jié)構(gòu)中的SP與SRP（信號(hào)識(shí)別顆粒）的識(shí)別有關(guān)，據(jù)推測(cè)，不同的SP對(duì)SRP表現(xiàn)出不同的親和力，SRP隨后決定了新生多肽鏈進(jìn)入分泌途徑的效率［26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)，SP4-CD19細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和對(duì)靶細(xì)胞的殺傷力較其他3個(gè)SP均顯著升高，這可能與SP4結(jié)合SRP的效率有關(guān)，其中的分子機(jī)制及作用效應(yīng)還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，隨著國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們對(duì)免疫療法的深入研究，越來(lái)越多的研究者關(guān)注CAR-T對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［28］。本研究制備了含不同SP的CAR-T，并通過(guò)系統(tǒng)的體外實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了SP對(duì)提升CAR在T細(xì)胞表面表達(dá)的影響。從本實(shí)驗(yàn)中CAR-T對(duì)靶細(xì)胞的體外功能鑒定結(jié)果來(lái)看，SP4-CD19細(xì)胞較其他SP的CAR-T對(duì)靶細(xì)胞的殺傷和細(xì)胞因子分泌水平顯著提高。這將為ALL的臨床精準(zhǔn)治療提供參考，但是還需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估其安全性。

利益沖突聲明：所有作者均不存在利益沖突。