菌劑制備及其修復農(nóng)藥污染土壤的研究進展

王 新，柳文睿，侯佳文，葛 玲，張亞楠

（沈陽工業(yè)大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 沈陽 110870）

農(nóng)藥是農(nóng)作物增產(chǎn)技術的首選，但它對人的健康和環(huán)境都有不利影響。農(nóng)藥分布廣泛，可在空氣、水和土壤中檢測到其殘留［1-2］。由于其在土壤中殘留時間較長，因而在兩年內(nèi)仍會對一些耐性差的后茬輪種作物的產(chǎn)量產(chǎn)生影響［3］。目前，生物修復法對于低濃度農(nóng)藥殘留污染土壤的修復具有一定的優(yōu)勢。該方法具有經(jīng)濟性、環(huán)保性以及不易破壞生態(tài)系統(tǒng)等優(yōu)點。還有一些除草劑在非堿性條件下不易水解，只能通過微生物進行降解［4-6］。

近年來，已有研究者從環(huán)境中富集分離出以農(nóng)藥作為碳源的菌種。由于這些降解菌易受自然環(huán)境因素的影響［7］，在實際應用中的修復效果并不理想，而將其制備成微生物菌劑則會擁有更高的活性和耐受性［8］。

本文介紹了微生物菌劑的概念、類型、制備方法及降解污染物的效果，綜述了相關的高效降解菌和生物強化菌劑的研究進展，介紹了國內(nèi)外有關微生物菌劑治理土壤農(nóng)藥污染的應用實例。

1 微生物菌劑的概念、類型及有效微生物

微生物菌劑可由一種細菌、真菌及放線菌的單菌株或多種菌株復合而成［9-10］，是將上述菌株進行擴大繁殖后加工成的活菌制劑。它在恢復土壤肥力、維系根際微生物平衡、降解有機物等方面具有顯著的效果［11］。

微生物菌劑按劑型可分為固體菌劑和液體菌劑，其中固體菌劑又分為顆粒劑和粉劑；按菌種種類可分為單一菌劑和復合菌劑；按有效菌類別可分為細菌菌劑、真菌菌劑和放線菌菌劑［12］。

表1列舉了一些微生物對農(nóng)藥的降解效果。由表1可知，大部分的降解菌為細菌，其中，假單胞菌（Pseudomonassp.）和芽孢桿菌（Bacillussp.）的降解譜較為廣泛，具有良好的應用前景。對比農(nóng)藥在液體培養(yǎng)基中的降解率與在土壤中的降解率可知，微生物菌劑在應用過程中受到環(huán)境的影響，修復效果衰減。

表1 有效微生物對農(nóng)藥的降解效果

2 微生物菌劑的制備

2.1 液體菌劑的制備

液體菌劑的制備通常分為兩步：高效降解菌的獲取和菌體的發(fā)酵培養(yǎng)。高效降解菌的獲取主要有3種方法：1）從受污染的環(huán)境中富集分離、篩選；2）通過馴化獲得降解菌種；3）將現(xiàn)有菌株通過基因改良技術提高其降解性能［43］。在獲取高效降解菌后，通常通過發(fā)酵工藝進行培養(yǎng)。發(fā)酵工藝包括：固體發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固液兩相發(fā)酵和分段培養(yǎng)工藝［43］。儲存是液體菌劑大規(guī)模應用的難題，一般需要在高效降解菌的發(fā)酵液或發(fā)酵離心后的重懸液中加入防腐劑和保護劑。徐銘陽等［44］比較了苯甲酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀3種具有抑菌防霉作用的防腐劑對雜菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉效果最好。研究人員還對有機物助劑、穩(wěn)定劑、無機鹽助劑3類保護劑進行了正交篩選與復配，加入復配保護劑保存45 d后的液體菌劑10 d內(nèi)對農(nóng)田土壤殘留啶蟲脒的降解率仍達92.75%［44］。

2.2 固體菌劑的制備

固體菌劑的制備包括高效降解菌的獲取、菌體混合培養(yǎng)、微生物固定化、干燥儲存等4個步驟［45］。微生物固定化通常采用吸附法、包埋法和交聯(lián)法等。菌劑載體是微生物生存的微環(huán)境，通過改變其傳質(zhì)特性可以提高微生物的存活率并保持活性。植物殘體及其轉(zhuǎn)化物用作菌劑載體可實現(xiàn)資源化利用。田秀梅等［46］以乙酸改性后的苧麻纖維為菌劑載體，菌劑活性較游離菌提高了30%。

固體菌劑的干燥方法有：鼓風干燥、噴霧干燥、冷凍干燥、微波真空干燥等。菌劑干燥通常需要添加干燥保護劑，常用的干燥保護劑有甘油、氨基酸、海藻糖、單糖、乳糖、多糖、聚乙烯二醇等［47］。將發(fā)酵、固定化、加入保護劑干燥粉碎、過篩制備的固體粉狀菌劑在低溫、密封無氧的條件下儲存，有利于延長菌劑的有效期［45］。ARCHACKA等［48］將益生菌制成菌劑，比較后發(fā)現(xiàn)噴霧干燥法比冷凍干燥法成本更低且更方便；同時發(fā)現(xiàn)，海藻糖作為低溫儲藏保護劑對益生菌的保護效果最好，脫脂牛奶作為保護劑的噴霧干燥法制備的益生菌菌劑對惡劣環(huán)境抵抗力最佳。研究者比較發(fā)現(xiàn)，噴霧干燥法與鼓風干燥法所得活菌數(shù)相差不大，故選擇易于操作、成本低廉、適合工業(yè)化生產(chǎn)的鼓風干燥法制備菌劑［49］。

3 微生物菌劑在農(nóng)藥污染土壤修復中的應用

目前，國內(nèi)外對于微生物菌劑修復農(nóng)藥污染土壤大都處于實驗室研究階段。CUI等［50］從稻田土壤中分離出一株芽孢桿菌FE-1，將其制成液體菌劑降解土壤中的氟磺胺草醚。對于土壤中含量分別為1.0，3.0，5.0 mg/kg的氟磺胺草醚降解率分別為90.0%、90.1%和89.4%。此外，他們通過對玉米的鮮重和株高的測定發(fā)現(xiàn)，可有效減少對后茬作物生長的負面影響，土壤中FE-1的存在對敏感作物玉米沒有有害影響。

然而土壤的理化性質(zhì)影響著菌劑的應用。GUL等［51］分別采用黑曲霉和產(chǎn)黃青霉修復苯磺隆污染土壤，21 d后pH最低（6.6）的土壤樣品中黑曲霉降解率最高（達95%）；而pH為8.6的土壤中黑曲霉降解率最低（為57%）；產(chǎn)黃青霉具有相同的趨勢?？梢娫谒嵝酝寥乐形廴疚锝到馑俾矢?。FUENTES等［52］研究發(fā)現(xiàn)，菌劑在不同質(zhì)地土壤中修復效果的大小順序為粘土粉質(zhì)壤土＞壤土＞砂土。

由于直接噴灑細菌懸浮液的降解效果很容易受到土壤性質(zhì)的影響，LIU等［53］以蠶業(yè)廢棄物蠶沙作為固定球形節(jié)桿菌菌株的載體，將在氯化鈉中懸浮的菌液（1013CFU/mL）噴灑在蠶沙中，獲得固體菌劑。通過表征發(fā)現(xiàn)，蠶沙能固定不同階段的細菌，且在沒有任何營養(yǎng)供應的情況下，一個月后大部分固定化細胞仍然存活。而后在廣東省生物工程研究所實驗農(nóng)場甘蔗田中進行實驗，發(fā)現(xiàn)使用固體菌劑后敵草隆平均半衰期從72.32 d縮短至7.69 d。將該固體菌劑用于不同類型土壤中（土壤含水率10%~50%）均具有良好的適用性，敵草隆降解率約為85%，且在中性、堿性條件下修復效果更好。徐銘陽等［54］以蚯蚓糞肥作為載體，制得的菌劑對土壤中含量為5 mg/kg的多菌靈的降解率為100.4%，且在保存30 d后對敵草隆的降解率仍能達到94.3%。

生物炭的高比表面積、高孔隙率及改善土壤理化性質(zhì)的能力使其廣泛應用于固體菌劑的制備［55-59］。ABDUL等［57］研究了生物炭固定復合菌群MB3R對馬鈴薯植被土壤中草克凈的降解效果，在單獨添加MB3R和MB3R固體菌劑的土壤中，草克凈降解率分別為82%和96%。TAO等［59］通過將Fe3+化學共沉淀到玉米秸稈生物炭上，制備了一種鐵改性生物炭（FeMBC）。由于FeMBC促進細菌胞外聚合物表面—NH官能團的形成，且通過與阿特拉津的芳香環(huán)相互作用，有利于微生物的捕獲。利用其制備的固體菌劑加速了阿特拉津的降解速率，同時使稀有細菌豐度增加，穩(wěn)定養(yǎng)分循環(huán)，有助于維持阿特拉津污染土壤中的細菌多樣性。

也有學者使用包埋法制備固體菌劑。LIU等［60］利用聚乙烯醇和氯化鈣固定無色桿菌JW-1，制備了固定化小球PSLB，其對土壤中含量為100 mg/kg的撲草凈的降解率可達70.4%，顯著高于未生物強化的處理效果。

關于土壤中長殘留農(nóng)藥污染物的修復研究大都處于實驗室階段，但近年來越來越多的研究進入中試試驗或現(xiàn)場實施。陳銳等［61］在西安植物園實驗棚室內(nèi)土壤中施用多菌靈并添加降解菌劑，發(fā)現(xiàn)多菌靈降解菌可在土壤中穩(wěn)定定殖并迅速降低土壤中多菌靈的含量，修復10 d后多菌靈含量下降78%，可改善污染土壤中真菌微生物的多樣性，對土壤理化性質(zhì)及番茄作物生長無不良影響。曹博［24］選擇玉米作為表征植物研究阿特拉津的原位土壤修復，利用草炭土等作為載體制備菌劑。結果表明：菌劑的加入不僅增加了農(nóng)田原位土壤中除草劑污染物的消減速度，還可增產(chǎn)玉米。

4 存在的問題與展望

微生物菌劑中的微生物是決定生物強化效果的關鍵。目前的研究大多針對細菌，對于真菌和放線菌的研究較少。且目前的微生物菌種生理生化特性和降解機理研究大部分是針對單一污染物的研究結果，實際情況往往是多種污染物共存的復雜環(huán)境。而多菌種混合有助于在實際應用時得到更穩(wěn)定的治理效果。傳統(tǒng)載體不利于微生物與污染物之間的傳質(zhì)，現(xiàn)今各種復合載體的使用及納米材料等新型載體的出現(xiàn)，顯著提高了菌劑的作用效果。總之，微生物菌劑或肥料制劑的應用是一種消除土壤農(nóng)藥污染的有效方法。

雖然盆栽試驗效果較好，但現(xiàn)場實驗時發(fā)現(xiàn)農(nóng)殘降解率有所衰減，且菌劑的有效期仍有提升空間。這些方面的改善將有助于推進菌劑商品化。

綜合以上分析，從微生物代謝網(wǎng)絡的角度全面認識和掌握微生物菌種的生理生化特性和降解機理，進一步優(yōu)化制備工藝和使用條件，并結合對環(huán)境中目標污染物及其他污染物特性的了解，研發(fā)出針對多種目標污染物、高耐受、長保質(zhì)期的微生物菌劑，將是未來發(fā)展的主要方向。