印度梨形孢對櫻桃番茄產量、品質及采后抗性的影響

王慧俐 鄭曉冬

(1浙江特殊教育職業(yè)學院藝術系，浙江 杭州 310023； 2浙江大學食品生物科學技術研究所，浙江 杭州 310058)

櫻桃番茄(LycopersiconesculentumMill.)起源于南美洲，其果實色澤鮮亮，酸甜可口，富含谷胱甘肽、番茄紅素、類黃酮和蘆丁等活性物質[1-4]，具有抗氧化、抗癌和防治心血管疾病等作用[5-6]，深受消費者喜愛。但因其果實皮薄汁多，采后呼吸作用旺盛，在貯運過程中易因機械損傷和病原菌侵染而引起腐爛變質，從而影響商品價值。目前，櫻桃番茄采后保鮮方法主要有冷藏、氣調貯藏、保鮮劑處理、精油處理及生物拮抗劑處理等[7-10]，同時已有研究表明影響果實采后耐貯性最關鍵的因素是果實采收時的品質[11-12]。因此，研究采前技術措施以提高櫻桃番茄果實品質、延長貯藏期及提高果實采后抗性具有非常重要的意義。

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是從印度塔爾沙漠中分離到的一種內生真菌。它能定殖于多種植物的根部，促進植物生長，改善品質，并能誘導植物系統(tǒng)抗性，增強植物抗逆性[13-18]。印度梨形孢和番茄互惠共生，能促進番茄植株的生長，提高番茄對早疫病、黃萎病和番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)等的抗性[19-22]。但目前鮮見接種印度梨形孢對櫻桃番茄采后抗性影響的報道。本試驗研究櫻桃番茄苗期植株根部接種印度梨形孢對櫻桃番茄產量、品質及采后抗性的影響，以期為其在櫻桃番茄生產上的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試櫻桃番茄品種為杭雜5號，由杭州農業(yè)科學研究院蔬菜所提供。印度梨形孢來自德國耶拿大學Ralfoelmuller教授實驗室。病原菌灰葡萄孢(Botrytiscinerea)及鏈格孢(Alternariaalternata)均為浙江大學食品生物技術實驗室保存菌種。

1.2 試驗方法

1.2.1 印度梨形孢菌培養(yǎng) 印度梨形孢在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)平板上25℃培養(yǎng)一周后用直徑0.5 cm的無菌打孔器打孔，接種5個菌塊到含馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)的錐形瓶(50 mL/250 mL)中，培養(yǎng)一周(25℃，150 r·min-1)取出，4 000 r·min-1離心10 min，再用無菌水離心水洗3次收集菌絲體，將菌絲低速渦旋打碎2 min，備用。

1.2.2 櫻桃番茄育苗與接種 選取飽滿的櫻桃番茄種子播種在裝有育苗基質的32孔穴盤中，每孔1粒，苗床用電熱線加溫，置于溫室大棚內常規(guī)管理。育苗期間白天平均溫度約13℃，夜晚平均溫度約6℃，日照4 h·d-1。栽培基質為加拿大發(fā)發(fā)得泥炭∶蛭石=3∶1(v∶v)混合調配，并用高壓滅菌鍋滅菌2 h。處理組栽培基質按1%(m∶v)加入印度梨形孢菌絲體和孢子的混合物，攪拌均勻，對照組不接菌，然后將兩組栽培基質裝入塑料盆(7 L)中，每盆約裝3.5 L。選取株高及長勢一致的4～5片真葉期秧苗60株，洗凈根系后栽種于處理組和對照組塑料盆中，每盆2株苗，每組各15盆，將栽種好的塑料盆置于溫室大棚內，兩周后每盆各間去一株苗，整個生長期不使用任何殺蟲或殺菌劑，其他按常規(guī)管理。

1.2.3 病原菌的培養(yǎng)與孢子懸浮液制備 在SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)上分別挑取適量的供試病原菌灰葡萄孢及鏈格孢到PDA斜面，置于28℃ LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)中培養(yǎng)7～14 d，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们?，取出保存的病原菌斜面，于超凈工作臺上用無菌接種環(huán)刮取適量孢子，轉移至裝有無菌水的小試管中，在Olympus光學顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)下用血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌水將病原菌孢子濃度調配為1×104spores·mL-1，待用。

1.2.4 櫻桃番茄產量及品質測定 待處理組和對照組果實商業(yè)成熟期開始測產，總產量為第一穗果始收至最后一穗果終收(7月初)的所有果實的累計重量，5株累計測產，3次重復。將每次測得的產量除以果實個數(shù)即得單果重。每組分別取8～10個櫻桃番茄測定果實品質，3次重復，測定環(huán)境溫度為20℃。

1.2.5 果實采后自然腐爛試驗 印度梨形孢處理組和對照組果實分別采自苗期植株接種印度梨形孢和未接種印度梨形孢的對照植株，各取60個商業(yè)成熟且形狀、大小、色澤一致、無損傷及無病蟲害的果實，不進行清洗消毒，分別置于3個塑料筐中，每框20個果實，用保鮮膜封口，并貯藏在恒溫恒濕的貯藏室(溫度25℃，相對濕度95%，下同)內。貯藏過程中觀察果實的腐爛情況，果實開始發(fā)病并有破損即記為腐爛。21 d后記錄果實的腐爛率。

1.2.6 貯藏期果實品質及酶活性檢測 各取處理組和對照組果實30個，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，再用自來水沖洗干凈并晾干，然后分別置于2個塑料筐中，用保鮮膜封口后置于恒溫恒濕貯藏室內,每隔5 d檢測果實品質(包括可溶性蛋白含量、硬度、維生素C)和過氧化物酶(peroxidase，POD)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase activity，PPO)的活性。

1.2.7 果實采后病原菌抗性試驗 印度梨形孢處理組和對照組分別選取60個果實，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，再用自來水沖洗干凈，于室溫晾干后置于3個塑料筐，每框20個果實。用直徑5 mm無菌打孔器在果實赤道部位制造一傷口。在每個傷口接入20 μL濃度為1×104spores·mL-1病原菌孢子懸浮液。果實自然晾干后，用保鮮膜封口置于恒溫恒濕貯藏室內，5 d后觀察并記錄果實腐爛率，2次重復。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 櫻桃番茄品質測定 可溶性蛋白含量測定按 Bradford[23]的方法，采用牛血清蛋白制作標準曲線，每處理 3 個平行，每平行取自 6 個果實。采用WYT-4型手持折光儀(泉州中友光學儀器有限公司)測定可溶性固形物含量，每個果實測2次；采用GY-1型硬度計(杭州托普儀器有限公司)測定果肉硬度，每個果實測2次[24]；采用2,6-二氯酚靛酚法測定維生素C含量[25]；采用酸堿中和滴定法測定可滴定酸含量[26]，用0.1 mol·L-1NaOH滴定，結果表示為含蘋果酸的百分數(shù)(%)。

1.3.2 果實貯藏期酶活性測定 酶的提取和活性測定采用如下方法[26]：稱取組織樣品0.3 g于研缽中，加入4.5 mL約4℃的50 mmol·L-1含1.33 mmol·L-1EDTA和1% 聚乙烯吡咯烷酮的 pH值7.8的磷酸緩沖鹽溶液緩沖液，加少量石英砂于冰浴中碾磨，于SIGMA 3K-15離心機(德國希格瑪公司)離心10 min(4℃、12 000 r·min-1)。 取上清液置于冰浴中用于測定酶活性和可溶性蛋白含量。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[27]測定，以每分鐘上升0.01為一個酶活性單位，用U·g-1FW表示。PPO活性采用鄰苯二酚法[28]測定，以每分鐘上升0.01為一個酶活性單位，以U·g-1FW表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA進行顯著性分析(P<0.05)，采用Excel 2010進行作圖。

2 結果與分析

2.1 印度梨形孢對櫻桃番茄單果重和產量的影響

由圖1可知，在櫻桃番茄生長前期，接種印度梨形孢植株上果實的單果重比對照增加了14.0%，達顯著水平；但在櫻桃番茄生長后期，兩者無顯著差異。另外，由圖2可知，接種印度梨形孢植株上果實的產量與對照組無顯著差異(P>0.05)。

注：*表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: * indicates significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.圖1 印度梨形孢對櫻桃番茄單果重的影響Fig.1 Effect of P.indica on the weight of single fruit

圖2 印度梨形孢對櫻桃番茄產量的影響Fig.2 Effect of P.indica on the yield of fruit

2.2 印度梨形孢對櫻桃番茄果實品質的影響

由表1可知，苗期植株接種印度梨形孢的果實硬度、總可溶性固形物含量和可滴定酸含量均與對照組無顯著差異，但果實的可溶性蛋白含量和維生素C含量均顯著高于對照組，可見苗期接種印度梨形孢能顯著提高櫻桃番茄的果實品質。

表1 印度梨形孢對櫻桃番茄品質的影響Table 1 Effects of P. indica on the quality of cherry tomato

2.3 印度梨形孢對櫻桃番茄果實自然腐爛率的影響

由圖3可知，在室溫貯藏21 d后，對照組果實的腐爛率為37.5%，苗期接種印度梨形孢的處理組果實的腐爛率為12.5%，處理組果實腐爛率比對照組降低了25.0個百分點，達顯著水平。

圖3 印度梨形孢對果實自然腐爛率的抑制效果Fig.3 Effect of P. indica on the fruit of natural decay rate

2.4 印度梨形孢對櫻桃番茄果實采后病原菌抗性的影響

由圖4可知，苗期接種印度梨形孢能夠誘導櫻桃番茄果實對鏈格孢(A.alternata)和灰葡萄孢(B.cinerea)的抗性，果實黑斑病和灰霉病的發(fā)病率分別比對照降低了20.0和17.5個百分點，均達顯著水平。

圖4 印度梨形孢對果實發(fā)病率的影響Fig.4 Effects of P. indica on disease incidence of fruit

2.5 印度梨形孢對櫻桃番茄貯藏期酶活性的影響

由圖5可知，在櫻桃番茄果實貯藏過程中，印度梨形孢處理組果實的POD和PPO活性在貯藏11 d時達到峰值，且顯著高于對照；對照的POD和PPO活性一直呈下降趨勢。可見，印度梨形孢能誘導果實POD和PPO的活性。

2.6 印度梨形孢對櫻桃番茄貯藏期間果實品質變化的影響

由圖6可知，在櫻桃番茄貯藏過程中，果實可溶性蛋白含量、維生素C含量和硬度均逐漸下降。在貯藏第1和第6天時，印度梨形孢處理組的果實可溶性蛋白含量和維生素C含量均顯著高于對照；在貯藏第6和第11天時，印度梨形孢處理組的果實硬度顯著高于對照。

圖5 印度梨形孢對果實貯藏期POD和PPO活性的影響Fig.5 Effect of P. indica on POD and PPO activities of fruit during storage

圖6 印度梨形孢對果實貯藏期品質變化的影響Fig.6 Effect of P.indica on the change of fruit quality during storage

3 討論

王鳳讓等[29]研究表明，苗期接種印度梨形孢的番茄果實總重量顯著高于對照，其原因是接種印度梨形孢提高了番茄植株坐果率，但單果重未提高。本研究結果與之不同，接種印度梨形孢后櫻桃番茄果實總產量與對照無顯著差異，可能是由于本研究考察的是櫻桃番茄全生育期的產量，櫻桃番茄是長季節(jié)作物，印度梨形孢于定殖前期在其根部進行活體營養(yǎng)生長，能促進根系生長和植株的營養(yǎng)生長，因而生長前期單果重明顯提高，而生長后期，印度梨形孢以寄主植株的根細胞進行腐生，導致其根細胞程序性死亡[30-32]，致使生長后期根的生長不及對照，導致其整個生育期產量并未較對照顯著提高。Andrade-Linares等[32]研究也發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢定殖前期番茄產量顯著提高，但10周后產量與對照無顯著差異。

對果實品質進行分析表明，印度梨形孢處理能提高果實的品質，主要體現(xiàn)在果實中與抗性相關的可溶性蛋白含量和與抗氧化抗衰老相關的維生素C含量高于對照，這與在芹菜[33]上的研究結果相似。并且果實中可溶性蛋白和維生素C含量在貯藏前期顯著高于對照，說明苗期植株接種印度梨形孢，可在一定程度上延緩采后果實的成熟衰老進程；另外，果實硬度下降的速度也比對照緩慢，說明苗期接種印度梨形孢能降低貯藏期果實的軟化速度。

果實的采后抗性主要表現(xiàn)為對常見病原菌的抗性，櫻桃番茄采后常見病原菌包括鏈格孢和灰葡萄孢。本研究結果表明，苗期櫻桃番茄植株接種印度梨形孢，能誘導果實對采后病原菌鏈格孢和灰葡萄孢的抗性，并顯著降低采后果實的自然腐爛率。印度梨形孢可提高煙草對根部黑脛病和青枯病的抗性[34-35]，顯著提高小麥對冠腐病[36]、玉米對根腐病[37]等根部病害的抗性，同時也能提高擬南芥葉部白粉病和番茄葉部黃萎病的抗性[18,38]。印度梨形孢可通過誘導與抗性相關基因的表達和激活抗性相關酶的活性，提高植物對病原物的抗性[16,18,24,36-37]。印度梨形孢誘導煙草對黑脛病和青枯病、擬南芥對葉部白粉病的抗性及感病番茄品種對TYLCV的抗性均與提高抗性相關基因的表達和誘導抗性相關酶的活性密切相關[22,34-35,38]。在櫻桃番茄果實室溫貯藏試驗中還發(fā)現(xiàn)，貯藏第10天時，對照果實開始發(fā)病腐爛，而處理組果實貯藏第16天才發(fā)病，且對照果實的腐爛率顯著高于處理果實，這一現(xiàn)象剛好與處理果實貯藏中期POD和PPO活性被激活相符。前期已有研究表明，印度梨形孢能夠誘導番茄葉部抗性相關基因的表達[22]，印度梨形孢是否能誘導采后果實抗性及成熟軟化相關基因的表達以及可能的信號通路將是下一步的研究任務。

4 結論

研究表明，苗期櫻桃番茄植株接種印度梨形孢對櫻桃番茄總產量無顯著影響，但能夠提高櫻桃番茄果實的品質，延緩果實品質下降的速度，降低果實自然貯藏條件下的腐爛率，并對采后病原菌鏈格孢和灰葡萄孢有較好的抑制作用。其可能的作用機制包括提高了果實的采后品質，降低了果實軟化速度及延緩了果實成熟衰老的進程，并激活了貯藏期間與抗性相關的酶包括POD和PPO的活性。綜上，苗期接種印度梨形孢能有效提高櫻桃番茄果實品質和采后抗性。