水楊酸調(diào)控芥菜芽苗生理及褪黑素代謝研究

張 靜 尹永祺 陶 俊

(1 揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009；2 揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 3 揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

褪黑素(melatonin，MT)是一種吲哚胺類神經(jīng)激素，特異的天然抗氧化能力[1]，使其具有延緩衰老[2]、抗擊腫瘤[3]、改善睡眠[4]、調(diào)節(jié)免疫[5]等多種生理功效。同時褪黑素具備脂溶性和水溶性兩種性質(zhì)，因而易透過各種生理屏障到達(dá)體內(nèi)任何部位從而發(fā)揮獨(dú)特的藥理作用[6]。褪黑素廣泛存在于大多數(shù)生命體中，其在植物機(jī)體中含量顯著高于動物體內(nèi)[7]。褪黑素在植物中主要是由色氨酸經(jīng)色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase，TDC)催化形成色胺，然后經(jīng)色胺5-羥化酶(tryptamine 5-hydroxylase，T5H)催化形成5-羥色胺，5-羥色胺由血清素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(serotonin N-acetyltransferase，SNAT)轉(zhuǎn)化為N-乙酰基-5-羥色胺，最后經(jīng)N-乙酰基-5-羥色胺-甲基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylserotonin methyltransferase，ASMT)催化形成褪黑素[8]。在植物籽粒發(fā)芽階段，褪黑素合成關(guān)鍵酶被激活，褪黑素含量顯著增加，且生長環(huán)境改變會誘導(dǎo)褪黑素合成關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達(dá)及酶活性提高，進(jìn)一步促進(jìn)褪黑素的生物合成[9-10]。因此，通過控制的籽粒發(fā)芽條件以使芽苗中的褪黑素富集是一種有效的方式。

水楊酸(salicyliCAcid，SA)是普遍存在于植物體內(nèi)常見的小分子酚類物質(zhì)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，外源SA處理會影響植物多種生理活動，對植物的生長和發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，是植物應(yīng)對逆境脅迫的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)因子[12-13]。褪黑素與SA具有共同的合成前體且相似性較高，在植物生理學(xué)中，尤其是在應(yīng)對生物和非生物脅迫等方面，均發(fā)揮著重要的作用[14-16]。然而，有關(guān)SA處理對芥菜芽苗生理及褪黑素代謝影響的研究鮮見報道。

本研究以芥菜(BrassicajunceaL.)為試材，研究SA處理下芥菜芽苗主要生理生化和褪黑素代謝的變化，以期從生理生化代謝及基因水平探討SA處理對芥菜芽苗中褪黑素代謝的調(diào)控機(jī)理，為開發(fā)富含褪黑素的蕓薹屬芽類食品提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，推動芽菜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芥菜籽粒(長合甜脆大肉芥菜)，2017年購自廣州長合種子有限公司，-20℃保存。

褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%)，購自美國Sigma公司；TB Green Premix Dimer Eraser(RR091A)，購自日本TaKaRa公司。

1.2 試驗設(shè)計

稱取2.0 g(約500粒)芥菜種子，置于1%(v/v)次氯酸鈉水溶液中，浸泡消毒15 min后，用蒸餾水沖洗至pH值呈中性，置于蒸餾水中30℃浸泡4 h。將浸泡后種子置于鋪有蛭石的小盒中，噴施60 mL蒸餾水，置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，16 h光照/8 h黑暗。分別設(shè)置SA處理和對照，SA濃度及芽苗處理時間根據(jù)前期預(yù)試驗研究篩選確定，SA處理為芥菜種子正常發(fā)芽2 d后，其后每天噴施20 mL 1 mmol·L-1SA溶液，對照處理為每天噴施20 mL蒸餾水，分別于發(fā)芽4和7 d取樣測定芽長、褪黑素含量及相關(guān)基因表達(dá)等指標(biāo)。每處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，指標(biāo)測定進(jìn)行3次平行試驗。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)

1.3.1.1 形態(tài)特征 從各處理組中隨機(jī)選取15株芥菜芽苗，擺放整齊后，觀察其形態(tài)特征。

1.3.1.2 芽長 隨機(jī)選取15株發(fā)芽芥菜芽苗，用游標(biāo)卡尺測定其地上部分芽長，并取平均值。

1.3.1.3 單株芽苗鮮重 隨機(jī)選取30株發(fā)芽芥菜芽苗測定其鮮重，并取平均值。

1.3.2 電解質(zhì)滲透率 參照Dionisio-Sese等[17]的方法并加以修改。稱取0.3 g芽苗并切至3 mm的長度，轉(zhuǎn)移至20 mL去離子水中，于37℃水浴條件下振蕩1 h后，測定其電導(dǎo)率記為EC1；隨后沸水浴處理10 min，經(jīng)冷卻后調(diào)整最終體積為30 mL，測定煮沸后電導(dǎo)率記為EC2，根據(jù)公式計算電解質(zhì)滲透率：

電解質(zhì)滲透率=(EC1/EC2)×100%

1.3.3 可溶性蛋白含量 采用考馬斯亮藍(lán)G250法測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)[18]。

1.3.4 褪黑素含量 參照Arnao等[19]的方法并加以修改。準(zhǔn)確稱取0.2 g芥菜芽苗切片處理(3～5 mm)，轉(zhuǎn)移至棕色小瓶中，加入3 mL氯仿∶甲醇(30∶1，v/v)，4℃條件下震蕩16 h。萃取液于12 000×g離心10 min，取下層清液在真空濃縮器中40℃濃縮蒸干，加入100 μL 35%甲醇復(fù)溶，通過用高效液相色譜法測定褪黑素。色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(5 μm粒徑，4.6 mm×250 mm)；流動相A為超純水，流動相B為純甲醇(色譜級)，洗脫程序：0 min～27 min～35 min，42%甲醇～50%甲醇～50%甲醇；流速：0.3 mL·min-1；通過FLD檢測器檢測，檢測器溫度：30℃；激發(fā)波長：280 nm，發(fā)射波長：348 nm。

1.3.5 總抗氧化能力和谷胱甘肽過氧化物酶活性 采用總抗氧化能力檢測試劑盒(A015-1，南京建成生物試劑公司)測定總抗氧化能力；采用GPX試劑盒(A005-1-2，南京建成生物試劑公司)測定谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性。

1.3.6 褪黑素合成關(guān)鍵基因表達(dá) 參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行引物設(shè)計，引物序列見表1。參照植物RNA提取試劑盒(R6827，美國OMEGA公司)說明書提取芥菜芽苗中RNA并按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A，日本TaKaRa公司)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄試驗，參考Ma等[21]的方法構(gòu)建熒光定量PCR體系，實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次，繪制溶解曲線，檢測各褪黑素合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR中使用的引物Table 1 The primers used in qRT-PCR

1.4 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2013軟件處理數(shù)據(jù)，SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行繪圖，SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Tukey多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析(P<0.05表示差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA處理對芥菜芽苗外部形態(tài)的影響

注：*表示同一時期不同處理間差異顯著性(P<0.05)。下同。Note: * indicates significant difference amonGTreatments at 0.05 level aTThe same time. The same as following.圖1 SA處理下芥菜芽苗形態(tài)、芽長及單株鮮重的變化Fig.1 Changes of sprout morphology, length and per fresh weight of mustard sprouts under SATreatment

由圖1可知，與對照相比，經(jīng)SA處理的芥菜芽苗形態(tài)和生理特征均發(fā)生變化。圖1-A直觀顯示出，芥菜芽苗在經(jīng)SA處理后，芽苗整體長勢較對照出現(xiàn)明顯的差異，SA抑制了芽苗的生長，隨著發(fā)芽時間延長，SA處理處于快速生長階段，至發(fā)芽7 d時與對照差異減小。SA處理組地上部芽長在發(fā)芽4和7 d時分別為對照的81.6%和81.4%(圖1-B)，單株鮮重與對照相比分別降低了38.12%和20.80%(圖1-C)。

2.2 SA處理對芥菜芽苗電解質(zhì)滲透率的影響

由圖2可知，芥菜芽苗在受到SA處理后，電解質(zhì)滲透率提高。芽苗生長7 d時，SA處理的電解質(zhì)滲透率顯著高于對照，是對照的1.27倍。

圖2 SA處理對芥菜芽苗電解質(zhì)滲透率的影響Fig.2 Effects of SATreatment on electrolyte permeability of mustard sprouts

2.3 SA處理對芥菜芽苗可溶性蛋白含量的影響

由圖3可知，隨著發(fā)芽時間延長，SA處理下芥菜芽苗中可溶性蛋白含量均較對照處理組顯著提高，SA處理組可溶性蛋白含量在發(fā)芽4和7 d時分別為對照的1.86和1.29倍。

圖3 SA處理對芥菜芽苗可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of SATreatment on soluble protein content of mustard sprouts

2.4 SA處理對芥菜芽苗褪黑素含量的影響

由圖4可知，芥菜種子在發(fā)芽期間經(jīng)SA處理后，其褪黑素含量發(fā)生顯著變化，發(fā)芽時間也會影響褪黑素的含量。SA處理組發(fā)芽4和7 d時其褪黑素含量分別為42.75 ng·g-1FW和27.56 ng·g-1FW，是對照的1.88和1.96倍。隨發(fā)芽時間延長，發(fā)芽7 d時對照和SA處理芥菜芽苗褪黑素含量較4 d時分別下降38.27%和35.53%。

圖4 SA處理對芥菜芽苗褪黑素含量的影響Fig.4 Effects of SATreatment on melatonin content of mustard sprouts

2.5 SA處理對芥菜芽苗總抗氧化能力及谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

由圖5-A可知，芥菜經(jīng)SA處理后，芽苗總抗氧化活性顯著高于對照，芽苗生長4和7 d時分別為對照的2.21和1.93倍。此外，芽苗中谷胱甘肽過氧化物酶活性在發(fā)芽4和7 d時均顯著高于對照，分別較對照提高了33.95%和13.77%。

圖5 SA處理對芥菜芽苗總抗氧化能力 及谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響Fig.5 Effects of SATreatment on T-AOCAnd glutathione peroxidase activity of mustard sprouts

2.6 SA處理對芥菜芽苗褪黑素合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

由圖8可看出，發(fā)芽期間，噴施SA影響芥菜芽苗褪黑素合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。與對照相比，發(fā)芽4 d后，SA處理顯著上調(diào)芥菜芽苗中BjTDC2基因相對表達(dá)水平，且在發(fā)芽7 d時BjTDC1和BjTDC2基因的相對表達(dá)量均顯著上調(diào)；此外，BjT5H1和BjT5H2基因在發(fā)芽4 d時相對表達(dá)量均顯著提高，而在發(fā)芽7 d時BjT5H2基因的相對表達(dá)量顯著下調(diào)。芥菜芽苗經(jīng)SA處理BjSNAT1和BjSNAT4基因在發(fā)芽4 d時相對表達(dá)量均較對照顯著上調(diào)，而BjSNAT2和BjSNAT3基因相對表達(dá)量均顯著下調(diào)。另外，SA處理較對照上調(diào)了發(fā)芽4 d時BjASMT1基因的表達(dá)，卻抑制了BjASMT2和BjASMT3基因的表達(dá)；發(fā)芽7 d時則上調(diào)了BjASMT3基因的表達(dá)。

3 討論

圖6 SA處理下芥菜芽苗褪黑素合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)變化Fig.6 Changes of genes expression of key enzymes for melatonin synthesis in mustard sprouts under SATreatment

植物籽粒在發(fā)芽期間，植物中的內(nèi)源酶系統(tǒng)被激活，具有多種生理作用的功能性物質(zhì)得以富集[22]。SA作為一種植物激素，參與大多數(shù)植物活性成分的生物合成[23]。本研究通過SA處理芥菜芽苗，結(jié)果表明，SA處理后，芽苗中內(nèi)源褪黑素水平相對于對照顯著提高，芽苗的生理指標(biāo)也發(fā)生一系列明顯變化，芽長及鮮重較對照均明顯降低，表明SA處理抑制了芥菜芽苗的生命活動，減緩了相關(guān)代謝，從而引起一系列生理活動發(fā)生改變；另外，SA處理導(dǎo)致芽苗電解質(zhì)滲透率提高。電解質(zhì)滲透率作為植物細(xì)胞膜損傷指標(biāo)，能夠反映細(xì)胞的完整性[24]。有研究表明，細(xì)胞膜損傷會導(dǎo)致H2O2產(chǎn)生，H2O2在植物中起到信號分子作用，促進(jìn)褪黑素生物合成中色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase, TDC)和色胺5-羥化酶(tryptamm 5-hydroxylase, TSH)等酶活性，從而誘導(dǎo)植物的褪黑素含量上升[25]。含氮化合物、蛋白質(zhì)等含量的變化可以反映脅迫下植物代謝過程中蛋白質(zhì)的損傷程度[26]。本研究中，芥菜芽苗經(jīng)SA處理后可溶性蛋白含量顯著增加，表明SA處理加速了蛋白質(zhì)的合成以維持正常生命活動。SA處理提高了芥菜芽苗的總抗氧化活性和谷胱甘肽過氧化物酶活性，這與孫彤彤[27]關(guān)于外源SA提高了黃瓜幼苗抗氧酶活性的研究結(jié)果一致。說明外源SA可能通過調(diào)控抗氧化酶系統(tǒng)，減少活性氧在芥菜芽苗體內(nèi)的積累，從而維持生命大分子正常的功能。

褪黑素在植物中的生物合成途徑及合成關(guān)鍵酶尚不完全清楚。水稻中部分褪黑素合成酶基因已被克隆，然而芥菜芽苗中有關(guān)于褪黑素代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)的研究較少[28]。外界脅迫處理可以誘導(dǎo)褪黑素合成酶基因轉(zhuǎn)錄以合成褪黑素[29]。水稻突變體缺失TDC基因，其內(nèi)源5-羥色胺及褪黑素含量顯著下降[30]，表明褪黑素的生物合成與TDC基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。芥菜芽苗經(jīng)SA處理上調(diào)了BjTDC基因的表達(dá)，有助于色氨酸脫羧酶的合成，其中，芽苗中褪黑素含量與BjTDC2基因表達(dá)的變化趨勢一致，SA可能通過上調(diào)TDC基因的表達(dá)，促進(jìn)5-羥色胺的積累，以提高褪黑素的生物合成。過表達(dá)T5H基因的水稻植株內(nèi)源色胺水平下降，抑制T5H基因表達(dá)可以提高水稻中褪黑素的含量，表明T5H基因的轉(zhuǎn)錄與褪黑素的生物合成存在特殊關(guān)系[31]，然而本研究發(fā)現(xiàn)，SA處理均顯著提高了發(fā)芽4 d時芥菜芽苗BjT5H1和BjT5H2基因表達(dá)水平及褪黑素含量，這可能是由于研究物種及處理方式不同。芥菜芽苗中部分BjSNAT基因的相對表達(dá)量與褪黑素含量變化并不一致，這與Lee等[32]關(guān)于過表達(dá)OsSNAT基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株在Cd脅迫下，其褪黑素含量與OsSNAT基因存在負(fù)相關(guān)的研究結(jié)果相似。另外，SA處理可顯著調(diào)控芥菜芽苗BjASMT基因的表達(dá)水平。物種之間的同源序列表明，高等植物都可能存在ASMT基因的同源序列，這與物種均含有褪黑素一致[33]，表明ASMT基因可能在調(diào)控植物合成褪黑素以響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。盡管褪黑素與其合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)關(guān)系密切，但褪黑素在植物中的形成可能由多種因素共同調(diào)控，仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

芥菜芽苗經(jīng)SA處理后，其生長受到抑制，生物量顯著下降，電解質(zhì)滲透率顯著上升。芥菜芽苗通過加速合成蛋白質(zhì)，提高總抗氧化能力以及過氧化物谷胱甘肽酶活性，以維持芽苗正常的生命活動。SA處理后發(fā)芽4 d的芥菜芽苗BjTDC1基因、BjTDC2基因、BjT5H1基因和BjT5H2基因的相對表達(dá)水平均不同程度上調(diào)，部分基因表達(dá)與褪黑素含量變化趨勢一致，表明SA通過調(diào)控BjTDC和BjT5H基因表達(dá)誘導(dǎo)褪黑素的生物合成，而BjSNAT與BjASMT的相對表達(dá)水平與褪黑素合成的相關(guān)性較低。芥菜芽苗經(jīng)SA處理后內(nèi)源褪黑素含量在第4天達(dá)42.75 ng·g-1FW，表明SA處理是富集芥菜芽苗中褪黑素的有效方式。