楊曉晴， 李佳芯， 呂 博， 付洪玲， 于寒松，*，宋 波， 劉珊珊

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118； 2.國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系研發(fā)中心大豆加工研究室， 吉林 長(zhǎng)春 130118； 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030)

石油基合成薄膜的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致不可再生資源的嚴(yán)重消耗，以天然植物基原料生產(chǎn)可食性生物降解薄膜受到了食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。大豆中蛋白質(zhì)含量高，大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)原料充足，成本相對(duì)較低，且分離蛋白具有良好的成膜、可再生降解和易加工成型等優(yōu)點(diǎn)，是制備可食性生物降解薄膜的潛在選擇[1]。SPI主要由大豆7S球蛋白和大豆11S球蛋白組成，7S球蛋白主要有β-伴大豆球蛋白、γ-伴大豆球蛋白和堿性7S球蛋白3種組分。β-伴大豆球蛋白占大豆7S球蛋白的50%以上，是由α、α′和β亞基組成的一種寡聚蛋白[2]。由于β-伴大豆球蛋白中α亞基(72 kDa)與α′亞基(76 kDa)分子質(zhì)量極其相似，科研人員通常將其作為共同研究對(duì)象探討其與蛋白質(zhì)功能性的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)β-伴大豆球蛋白多個(gè)亞基缺失時(shí)，不僅可以有效去除致敏蛋白質(zhì)，還能改善其氨基酸的組成及特征[3]。據(jù)報(bào)道，不同蛋白質(zhì)的組成還影響著SPI的加工特性，包括熱誘導(dǎo)可溶性聚集體的形成、凝膠性和成膜能力，蛋白質(zhì)組成對(duì)薄膜性能的影響是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)[4]。郭寬等[5]研究了不同比例的11S和7S大豆蛋白的成膜特性，并證明了7S球蛋白含量高時(shí)薄膜具有更優(yōu)異的斷裂伸長(zhǎng)率和透明度。Okamoto[6]報(bào)道了含有11S球蛋白的脂質(zhì)膜的抗拉強(qiáng)度比對(duì)照脂質(zhì)膜高2～3倍。然而，SPI薄膜的高親水性和較弱的機(jī)械性能，限制了其在食品包裝領(lǐng)域中的應(yīng)用[7]，為了提高SPI包裝薄膜的功能特性，人們已經(jīng)對(duì)大豆蛋白薄膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及功能特性進(jìn)行了大量的研究，開(kāi)發(fā)了各種技術(shù)改善SPI薄膜的水敏感性和機(jī)械性能，包括與其他可生物降解的聚合物混合、酶促交聯(lián)、物理處理和化學(xué)交聯(lián)，并將不同類型的SPI膜應(yīng)用到食品，醫(yī)藥等領(lǐng)域[8-9]。

目前有關(guān)SPI薄膜的研究多數(shù)集中在SPI的蛋白濃度、受熱環(huán)境等表觀因素對(duì)薄膜性能的影響，尚未見(jiàn)到從亞基水平上探討SPI分子結(jié)構(gòu)和成膜特性的關(guān)系。以不同蛋白亞基缺失的大豆品種作為原料，探索SPI不同單個(gè)亞基及不同亞基組成與薄膜加工特性的構(gòu)效關(guān)系，對(duì)于從分子水平上研究大豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與加工特性尤其是成膜特性的關(guān)系具有重要意義。

本研究擬采用東農(nóng)47(Wild對(duì)照)和3種不同亞基缺失型的大豆為原料提取SPI，制備不同亞基組成的SPI薄膜，并對(duì)薄膜的微觀結(jié)構(gòu)、流變特性、機(jī)械性能、水溶性、屏障特性、熱穩(wěn)定性、光學(xué)阻隔性進(jìn)行研究，探討亞基組成與成膜特性的關(guān)系，希望為提高亞基缺失型SPI薄膜的綜合包裝性能，為高成膜性大豆蛋白系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的4種大豆[東農(nóng) 47(Wild)、α-lack、α′-lack、(α+α′)-lack]是具有中國(guó)大豆遺傳背景的亞基缺失型原料，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉珊珊教授團(tuán)隊(duì)提供；無(wú)水乙醇、丙酮、鹽酸、硫酸、丙三醇、氫氧化鈉，北京化工廠；考馬斯亮藍(lán)G- 250、丙烯酰胺、甲醇、去離子水，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；過(guò)硫酸銨，索萊寶科技有限公司；冰乙酸、硼酸，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；溴酚藍(lán)、四甲基乙二胺、甲烷、雙叉丙烯酰胺、β-巰基乙醇，美國(guó)Sigma公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TP型大豆脫皮機(jī)，山東省魯曹高新機(jī)械制造有限公司；CS- 2000型高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；JK- MSH- 2L型磁力攪拌儀，上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；FDU- 7006型冷凍干燥儀，韓國(guó)OPERON公司；iBright CL1000型凝膠成像儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；ME204型分析天平、FE28型數(shù)顯pH計(jì)，上海梅特勒- 托利多儀器有限公司；MCR302型流變儀，奧地利安東帕(中國(guó))有限公司；VERTEX 70型紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司；XRD- 7000S/L型X射線衍射儀，日本島津企業(yè)管理有限公司；Sigma300型電子顯微鏡，卡爾蔡司(上海)管理有限公司；WDW- 200H型數(shù)顯式電子拉力試驗(yàn)機(jī)，濟(jì)南市凱德儀器有限公司；VICTOR NivoTM型熒光酶標(biāo)儀，珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司；UV- Vis 1700型紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；CR- 5型臺(tái)式色彩色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)控股公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1不同亞基組成脫脂豆粉的制備

將不同亞基組成大豆進(jìn)行脫脂處理。4種大豆經(jīng)脫皮機(jī)去皮后用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過(guò)60目篩得到脫皮豆粉。室溫下，脫皮豆粉與丙酮溶液按1∶5比例混合(g/mL)，磁力攪拌0.5 h后靜置1 h。將上清液吸出，重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)次，至上清液無(wú)色，吸出上清液后放在通風(fēng)櫥晾干，得到脫脂豆粉。

1.3.2不同亞基組成SPI的制備

SPI的制備參考Wang等[10]的堿溶酸沉法，并稍作修改。將脫脂豆粉與去離子水以1∶10(g/mL)的比例混合，用2 mol/L NaOH將豆粉分散體pH值調(diào)節(jié)至8.5，連續(xù)攪拌2 h，14 000 r/min、4 ℃，離心30 min，棄沉淀。用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH值至4.5，充分?jǐn)嚢? h，14 000 r/min、4 ℃，離心30 min，棄去上清液。收集沉淀，以1∶5(g/mL)的比例分散在水中，并用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，取上清液，4 ℃透析48 h(期間至少換水4次)。將完全透析后的蛋白溶液冷凍干燥，得到SPI，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?種SPI分別標(biāo)記為：Wild、α-lack、α′-lack和(α+α′)-lack。

1.3.3SPI分子質(zhì)量的測(cè)定

使用十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)對(duì)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量進(jìn)行分析。處理后的4種SPI樣品上樣量為10 μL，在由濃縮膠(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)和分離膠(質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%)組成的電泳系統(tǒng)上運(yùn)行，操作電壓最初設(shè)置為60 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，電壓改為90 V，直到電泳結(jié)束。從膠盒中取出凝膠，染色和脫色后拍照。

1.3.4SPI成膜液的制備

稱取3 g SPI溶于100 mL水中，以獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的SPI溶液，再加入1.5 g甘油，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)膜液pH值至10.0，磁力攪拌30 min。將獲得的膜液在90 ℃下水浴加熱30 min(期間不停攪拌，使溶液均勻受熱)，冷卻至室溫消泡，放在4 ℃下保存，待測(cè)。

1.3.5SPI成膜液流變特性的測(cè)定

使用裝有平行板(直徑25 mm，間隙1.0 mm)的流變儀進(jìn)行流變特性測(cè)量。取1.5 mL成膜液，在固定溫度(25 ℃)和剪應(yīng)力(1.0%)條件下，以0.1～100.0 rad/s的變化頻率測(cè)試1.5 mL成膜溶液的流變性。

1.3.6SPI薄膜的制備

采用溶液流延法，取一定量成膜液倒入有機(jī)玻璃槽(120 mm×80 mm×20 mm)中，在70 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥6 h，揭膜，放于相對(duì)濕度75%的室溫環(huán)境下保存48 h，待測(cè)。

1.3.7SPI薄膜官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

采用紅外光譜，以4 cm-1的分辨率從4 000 cm-1到400 cm-1對(duì)樣品進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)為32次。使用Peak Fit(4.12)軟件，利用二階導(dǎo)數(shù)和多個(gè)高斯曲線擬合分析，計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

1.3.8SPI薄膜晶型結(jié)構(gòu)的測(cè)定

采用配備Cu- Kα輻射源的X-射線衍射儀測(cè)定凍干的蛋白薄膜樣品的晶體結(jié)構(gòu)。設(shè)置條件：λ為0.154 nm，衍射角2θ范圍為5～40°，電流30 mA，電壓40 kV，掃描速率為5°/min。

1.3.9SPI薄膜形貌的觀察

將蛋白薄膜樣品冷凍干燥后噴金處理，使用掃描電子顯微鏡觀察薄膜的表面和斷面形態(tài)，在加速電壓為3～10 kV下操作。

1.3.10SPI薄膜機(jī)械性能的測(cè)定

參照GB/T 1040.3—2006測(cè)量薄膜的抗拉強(qiáng)度(tensile strength，TS)、斷裂伸長(zhǎng)率(elongation at break，EB)[11]。薄膜樣品裁成均勻尺寸(12 mm×150 mm)的長(zhǎng)條，初始夾距設(shè)為50 mm，拉伸速度10 mm/min。使用數(shù)字千分尺從10個(gè)不同位置測(cè)量薄膜厚度。

抗拉伸強(qiáng)度按式(1)計(jì)算，斷裂伸長(zhǎng)率按式(2)計(jì)算。

(1)

式(1)中：TS為抗拉伸強(qiáng)度，MPa；F為薄膜斷裂時(shí)的最大承受力，N；D為膜的寬度，mm；S為薄膜的厚度，mm。

(2)

式(2)中：EB為斷裂伸長(zhǎng)率，%；L0為薄膜的初始長(zhǎng)度，mm；L為薄膜斷裂時(shí)距離標(biāo)線的長(zhǎng)度，mm。

1.3.11SPI薄膜耐水性的測(cè)定

1.3.11.1 水分含量的計(jì)算

水分含量測(cè)定參照Luo等[12]的操作方法并適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取適量薄膜樣品(M1)，在105 ℃下干燥至恒重(M2)。水分含量(moisture content，MC)按式(3)計(jì)算。

(3)

1.3.11.2 水溶性的計(jì)算

將干燥的薄膜放入裝有50 mL蒸餾水的燒杯中，在25 ℃下浸泡24 h。在3 000 r/min離心5 min，將不溶性的薄膜分離出來(lái)，105 ℃干燥至恒重并再次稱重(M3)。水溶性(total soluble matter，TSM)按式(4)計(jì)算。

(4)

1.3.12SPI薄膜屏障特性的測(cè)定

1.3.12.1 水蒸氣透過(guò)系數(shù)的計(jì)算

參照GB/T 1077—1988[13]測(cè)定薄膜的水蒸氣透過(guò)率(water vapor permeability，WVP)，水蒸氣透過(guò)系數(shù)按式(5)計(jì)算。

(5)

式(5)中：WVP為水蒸氣透過(guò)系數(shù)，g·mm/(m2d·kPa)；Δm為t時(shí)間內(nèi)水蒸氣遷移量，g；L為薄膜厚度，mm；A為薄膜有效面積，m2；t為測(cè)量時(shí)間，d；Δp為兩側(cè)壓力差，kPa。

1.3.12.2 氧氣透過(guò)系數(shù)的測(cè)定

參考GB/T 1038—2000[14]，采用薄膜透氧測(cè)試儀進(jìn)行薄膜氧氣透過(guò)系數(shù)(oxygen permeability，OP)的測(cè)定。

1.3.13SPI薄膜熱力學(xué)特性的測(cè)定

將大豆蛋白薄膜通過(guò)液氮淬斷后研磨成粉末，采用熱失重分析儀對(duì)樣品進(jìn)行溫度- 質(zhì)量曲線和溫度- 質(zhì)量導(dǎo)數(shù)曲線分析。熱失重分析掃描范圍為30～700 ℃，加熱速率為10 ℃/min，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量為5～10 mg。

1.3.14SPI薄膜光學(xué)性能的測(cè)定

1.3.14.1 比色參數(shù)的計(jì)算

使用色差儀測(cè)量膜的表面顏色(L*、a*和b*)。用標(biāo)準(zhǔn)白板(L=99.28、a=-0.04和b=-0.31)作為背景對(duì)照?？偵?ΔE)按式(6)計(jì)算。

(6)

1.3.14.2 紫外光譜的測(cè)定

使用紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)下，以空氣作為參考，測(cè)量薄膜樣品(10 mm×40 mm)的透射率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；應(yīng)用Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為差異顯著；采用Origin 8.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同亞基組成對(duì)SPI分子質(zhì)量的影響

采用Image Lab 5.2.1軟件分析4種SPI的SDS- PAGE圖譜，結(jié)果如圖1。由圖1可知，在不同種類的SPI對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶組成中，Wild型SPI中β-伴大豆球蛋白由α′、α和β三個(gè)亞基組成，分別對(duì)應(yīng)在75、70、50 kDa左右的條帶；而在α亞基缺失型、α′亞基缺失型和(α+α′)雙缺失型的SPI中，通過(guò)SDS- PAGE圖譜的觀察，基本檢測(cè)不出α亞基、α′亞基和(α+α′)亞基的條帶，4種SPI的特征頻帶與前人的研究結(jié)論一致[15]。由此確定SPI的亞基缺失，并對(duì)各亞基的含量進(jìn)行分析，表明SPI具有穩(wěn)定的遺傳特性，滿足實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求。

2.2 不同亞基組成對(duì)SPI成膜溶液流變性能的影響

圖2 不同亞基組成對(duì)薄膜流變學(xué)特性的影響Fig.2 Effect of different subunit compositions on rheological properties of films

動(dòng)態(tài)流變學(xué)研究被認(rèn)為是表征聚合物形態(tài)結(jié)構(gòu)的有效方法。一般用儲(chǔ)能模量(彈性模量，G′)和損耗模量(黏性模量，G″)來(lái)反映薄膜材料的流變學(xué)行為。為探討不同亞基缺失對(duì)SPI薄膜的動(dòng)態(tài)流變特性影響，本實(shí)驗(yàn)采用流變儀對(duì)成膜溶液的流變行為進(jìn)行研究，不同亞基組成SPI薄膜黏彈性模量和復(fù)數(shù)黏度隨頻率變化結(jié)果如圖2。由圖2可知，在相同的剪切頻率(0～100 rad/s)下，所有樣品的G′值均大于G″值，并且所有樣品的G′和G″值與角頻率呈正相關(guān)，表明所有成膜溶液的彈性行為明顯高于黏性行為，表現(xiàn)出更多的類似固體的結(jié)構(gòu)[16]。α′-lack成膜液的G′值均高于Wild型、α-lack和(α+α′)-lack成膜液的G′值，而α-lack的G′值雖然也隨著角頻率的增大而增加，但其具有最小的G′值和增長(zhǎng)速率，說(shuō)明α′亞基缺失可以促進(jìn)成膜凝膠化的強(qiáng)度，從而形成緊密結(jié)構(gòu)。α亞基缺失會(huì)降低成膜滲液的G′，從而減弱成膜凝膠化的強(qiáng)度。由此可見(jiàn)，所有成膜溶液體系都表現(xiàn)出彈性液體的流變學(xué)行為。成膜溶液的復(fù)數(shù)黏度(η*)在0.1～1.0 rad/s的角頻率下驟降，隨即趨于穩(wěn)定，而后在10.0～100.0 rad/s的角頻率下，η*又逐漸增大，說(shuō)明η*對(duì)角頻率具有一定的依賴性。這種現(xiàn)象可能是由于成膜液經(jīng)過(guò)一段反應(yīng)時(shí)間后，在靜止?fàn)顟B(tài)下蛋白質(zhì)分子鏈相互聯(lián)結(jié)纏繞，在低頻剪切力作用下，蛋白質(zhì)分子鏈被解開(kāi)，內(nèi)部分子或質(zhì)點(diǎn)被重新排列成線，溶液流層間的作用力減小，黏度降低。隨著角頻率不斷增大，蛋白質(zhì)內(nèi)部有序排列再次改變，此刻蛋白質(zhì)分子間聚集程度不斷增加，蛋白質(zhì)分子間的相互作用力增強(qiáng)，黏度增大，使膜液表現(xiàn)為黏性流體[17]，證明SPI成膜溶液可以形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。成膜溶液中α′-lack的G′大于α-lack的G′，α′-lack的G″小于α-lack的G″，α′-lack溶液的復(fù)數(shù)黏度曲線增加趨勢(shì)最為明顯，說(shuō)明α′-lack的成膜液具有更好的潛在成膜能力。在一定程度上，亞基缺失所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異影響了SPI成膜溶液的流變學(xué)特性。

2.3 不同亞基組成對(duì)SPI薄膜結(jié)構(gòu)特性的影響

2.3.1對(duì)薄膜二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

表1 SPI薄膜二級(jí)結(jié)構(gòu)含量比例變化Tab.1 Changes in proportion of secondary structure content of SPI films %

數(shù)值=平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，同列不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.3.2對(duì)薄膜晶型結(jié)構(gòu)的影響

X射線衍射常用于檢測(cè)蛋白質(zhì)等生物大分子的無(wú)定型和晶型結(jié)構(gòu)[20]，不同亞基組成SPI薄膜X射線衍射分析結(jié)果如圖4。由圖4可知，對(duì)照組Wild薄膜在21.2°出現(xiàn)的衍射峰代表了SPI中β-折疊的二級(jí)構(gòu)象，并且較寬的峰形說(shuō)明了非晶態(tài)球蛋白(7S和11S)是SPI成膜中重要組成部分，且薄膜具有無(wú)定形特性[21]。α-lack、(α+α′)-lack薄膜與21.2°處Wild薄膜衍射峰型相似，而α′-lack薄膜的峰型發(fā)生了明顯的變化且衍射峰向左偏移至2θ為21.1°，寬度逐漸減小，強(qiáng)度逐漸增加，說(shuō)明α′亞基缺失在一定程度上可以影響SPI膜的晶體結(jié)構(gòu)。大豆分離蛋白具有四級(jí)球形結(jié)構(gòu)，其中α螺旋和β折疊構(gòu)成了SPI的次級(jí)結(jié)構(gòu)。次級(jí)結(jié)構(gòu)主要被其內(nèi)部主鏈上形成的氨鍵所穩(wěn)定[22]，α′亞基缺失改變了SPI分子中的次級(jí)鍵——氨鍵，將原來(lái)的次級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加緊湊、有序，使α′-lack的蛋白質(zhì)分子和甘油之間形成作用應(yīng)力的交聯(lián)程度增加，限制了SPI分子鏈的自身活動(dòng)，使薄膜結(jié)晶度降低[23]，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了紅外光譜的分析結(jié)果。同時(shí)相較于對(duì)照組，(α+α′)-lack薄膜在9.3°出現(xiàn)了較明顯的衍射峰，這是因?yàn)棣?、α′雙亞基缺失時(shí)蛋白質(zhì)在成膜過(guò)程中發(fā)生聚集，導(dǎo)致其分布不均勻，結(jié)晶度升高[24]。

圖4 不同亞基組成SPI薄膜的X-射線衍射圖Fig.4 X-ray diffraction analysis of SPI films composed of different subunits

2.3.3對(duì)薄膜微觀結(jié)構(gòu)的影響

掃描電鏡圖可以反映薄膜干燥過(guò)程中內(nèi)部組分的相互作用以及表面結(jié)構(gòu)特征，不同亞基組成SPI薄膜表面和斷面的微觀結(jié)構(gòu)如圖5。由圖5可知： Wild薄膜是成片型的基質(zhì)狀態(tài)，斷面出現(xiàn)的垂直裂紋是液氮淬斷造成的；α-lack薄膜稍有微孔氣泡出現(xiàn)；(α+α′)-lack薄膜表面出現(xiàn)了明顯的裂紋，紋理雜亂無(wú)規(guī)律，并且表面及斷面都出現(xiàn)了氣孔較多的現(xiàn)象，說(shuō)明α和α′雙亞基缺失會(huì)導(dǎo)致成膜體系相容性較差；α′-lack薄膜表面平整且致密、裂隙少、無(wú)明顯孔洞，呈有序波浪紋結(jié)構(gòu)，斷面也是相對(duì)緊密光滑的狀態(tài)，說(shuō)明α′亞基缺失會(huì)使SPI薄膜內(nèi)部氫鍵相互作用力加強(qiáng)，進(jìn)而網(wǎng)狀交聯(lián)程度增加，提高了薄膜的均勻性和致密性[25]，薄膜表現(xiàn)出優(yōu)異的、均勻致密的微觀結(jié)構(gòu)可以提高消費(fèi)者的接受能力，有利于后期在食品包裝中進(jìn)一步的應(yīng)用。

上排圖片放大倍數(shù)為5 000倍，下排圖片放大倍數(shù)為300倍。圖5 不同亞基組成SPI薄膜的掃描電鏡分析結(jié)果Fig.5 Results of scanning electron micrographs of SPI films composed of different subunits

2.4 不同亞基組成對(duì)SPI薄膜功能特性的影響

2.4.1對(duì)薄膜機(jī)械性能的影響

圖6 不同亞基組成對(duì)SPI薄膜機(jī)械性能的影響Fig.6 Effect of different subunit compositions on mechanical properties of SPI films

食品包裝材料需要具備足夠優(yōu)秀的機(jī)械強(qiáng)度才能在運(yùn)輸或貯藏過(guò)程中保證食品的完整性，因此薄膜材料的機(jī)械性能是決定其是否具有潛在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的主要因素。蛋白薄膜的機(jī)械性能包括抗拉伸強(qiáng)度(tensile strength，TS)和斷裂伸長(zhǎng)率(elongation at break，EB)，蛋白質(zhì)組成成分和內(nèi)部結(jié)構(gòu)也會(huì)影響薄膜的機(jī)械強(qiáng)度[6]。不同亞基組成SPI薄膜機(jī)械性能分析結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，β-伴大豆球蛋白中不同亞基組成對(duì)SPI薄膜的機(jī)械性能有顯著的影響(P<0.05)。與Wild薄膜相比，α′-lack薄膜的TS提高了40%，而α-lack和(α+α′)-lack的TS分別為1.73 MPa和1.6 MPa，明顯低于Wild薄膜。α-lack、α′-lack薄膜的斷裂伸長(zhǎng)率均低于對(duì)照組，表明薄膜柔韌性下降，連續(xù)緊密的薄膜結(jié)構(gòu)可能限制了基材的分子運(yùn)動(dòng)，因此導(dǎo)致柔性降低[26]。出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)棣?伴大豆球蛋白中α′亞基的缺失增強(qiáng)了SPI薄膜內(nèi)部的化學(xué)交聯(lián)程度，使大豆蛋白分子間作用力增強(qiáng)，并且有效地增加了蛋白質(zhì)分子鏈間的聯(lián)系，使分子鏈難以發(fā)生相對(duì)滑移，薄膜不易發(fā)生大的形變，保證了較好的力學(xué)性能，從而增加薄膜材料的機(jī)械強(qiáng)度；而α亞基缺失則會(huì)降低成膜強(qiáng)度，這與2.2中SPI成膜溶液流變特性的分析結(jié)果相符；(α+α′)-lack薄膜可能與自身微觀結(jié)構(gòu)中不均勻空腔的存在導(dǎo)致了抗拉伸強(qiáng)度的下降。Poysa等[27]研究7S球蛋白凝膠硬度時(shí)也有類似發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于完整的7S球蛋白，缺乏β-伴大豆球蛋白的α′亞基會(huì)增加凝膠硬度。

2.4.2對(duì)薄膜耐水性的影響

食品包裝薄膜在實(shí)際應(yīng)用時(shí)多面臨環(huán)境潮濕的問(wèn)題，考察其水分含量和水溶性是非常重要的[28]，不同亞基組成SPI薄膜的水分含量和水溶性分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，Wild薄膜由于其高含量的非極性氨基酸表現(xiàn)出高水溶性(36.53%)，而α′-lack薄膜的水溶性為30.81%，與前者相比，α′-lack薄膜的耐水性明顯提高(P<0.05)，表明了α′亞基缺失增強(qiáng)了薄膜中分子間的相互作用，在熱誘導(dǎo)作用下，形成的大分子蛋白質(zhì)的水溶性低和溶于水的小分子蛋白質(zhì)減少，新形成的共價(jià)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加牢固進(jìn)而減弱了薄膜在水中的溶解[29]。水分含量分析結(jié)果顯示，與Wild薄膜相比，α′-lack薄膜含水量較低，說(shuō)明薄膜內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊湊，薄膜水分含量的高低將直接影響其機(jī)械性能和阻水性，這也是α′-lack薄膜抗拉伸強(qiáng)度大的原因。Erdem等[30]對(duì)SPI復(fù)合薄膜的研究也表明，水溶性受成膜材料親水性的影響，與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的密度有關(guān)。

表2 不同亞基組成的SPI薄膜的水分含量和水溶性Tab.2 Moisture content and water solubility of SPI films composed of different subunits %

2.4.3對(duì)薄膜屏障特性的影響

圖8 不同亞基組成對(duì)SPI薄膜熱穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of different subunit compositions on thermal stability of SPI films

水蒸氣和氧氣的滲透性通常是衡量包裝薄膜質(zhì)量的重要指標(biāo)，薄膜低滲透性可以延緩新鮮產(chǎn)品的脫水率，另外，它可以減少某些食物成分(如多不飽和脂肪)的氧化，以延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[31]。不同亞基組成SPI薄膜屏障特性分析結(jié)果如圖7。由圖7可知，相比于Wild薄膜，不同亞基組成的薄膜水蒸氣透過(guò)性均表現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05)。α-lack薄膜的水蒸氣透過(guò)系數(shù)為31.30 g·mm/(m2d·kPa)，而α′-lack薄膜的水蒸氣透過(guò)系數(shù)較Wild薄膜降低了47%，為21.89 g·mm/(m2d·kPa)。透氧性也表現(xiàn)出類似趨勢(shì)，說(shuō)明α′-lack比α-lack具有更優(yōu)異的屏障特性。這種情況可能有兩方面原因：一方面，在Wild薄膜中存在很多水結(jié)合位點(diǎn)，而α′-lack薄膜中，α′亞基缺失增強(qiáng)了分子間相互作用，形成的氫鍵降低了SPI膜上水結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量[32]；另一方面，從掃描電鏡圖可以看出，α′-lack薄膜表面更加致密，內(nèi)部間隙減少，阻礙了水分子的通過(guò)，這顯著降低了水分子在SPI內(nèi)部的擴(kuò)散速率。

圖7 不同亞基組成對(duì)SPI薄膜屏障性能的影響Fig.7 Effect of different subunit compositions on the barrier properties of SPI films

2.4.4對(duì)薄膜熱穩(wěn)定性影響

對(duì)SPI薄膜的熱學(xué)性能進(jìn)行表征，不僅可以檢測(cè)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化，還能獲取膜結(jié)構(gòu)中的水合作用以及穩(wěn)定性等相關(guān)信息[33]。4種大豆蛋白薄膜熱失重(TG)分析曲線和導(dǎo)數(shù)熱重(DTG)分析結(jié)果如圖8。由圖8(a)可知，所有SPI薄膜均有3個(gè)階段的熱損失，隨著溫度從室溫加熱到100 ℃左右，所有的樣品薄膜均有大約10%的質(zhì)量損失，之后曲線趨于平緩。這主要是因?yàn)镾PI薄膜親水?dāng)y帶的水分和殘余溶劑受熱揮發(fā)導(dǎo)致的質(zhì)量下降，此時(shí)存在的失重水分子主要是以物理吸附和弱氫鍵結(jié)合在大豆蛋白分子上[34]。第二個(gè)熱降解階段是從130～210 ℃，主要是小分子增塑劑甘油的蒸發(fā)，此階段(α+α′)-lack薄膜顯示出最大的質(zhì)量損失(14.86%)，這是因?yàn)棣?、α′雙亞基缺失改變的蛋白結(jié)構(gòu)，形成的間隙遠(yuǎn)大于其他種類的薄膜(SEM結(jié)果保持一致)，使甘油更容易被揮發(fā)出去。第三階段是溫度大于230 ℃時(shí)4種不同亞基組成SPI開(kāi)始熱分解的階段，此時(shí)Wild薄膜的質(zhì)量損失了85.42%，(α+α′)-lack薄膜損失了90%，而α′-lack薄膜的質(zhì)量只損失了83.83%。結(jié)合圖8(b)的DTG圖中可以看出，與其他3種薄膜相比，α′-lack薄膜有著更高的質(zhì)量殘余量，在α′亞基缺失的影響下，蛋白質(zhì)分子更好地呈現(xiàn)線性并發(fā)生熱交聯(lián)，因此具有更高的熱穩(wěn)定性。

2.4.5對(duì)薄膜光學(xué)特性的影響

2.4.5.1 對(duì)薄膜色度的影響

不同亞基組成SPI薄膜的比色參數(shù)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，Wild薄膜具有最高的L*值(亮度)、a*值(綠度)和b*值(黃度)，ΔE(色差)最低。相比之下，α′-lack薄膜的a*值下降到-1.47，b*值下降到-0.58，這是由于a′亞基的缺失使薄膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)聚集所導(dǎo)致的結(jié)果。ΔE隨著β-伴大豆球蛋白中亞基的缺失而增大，這一結(jié)果與薄膜的色度數(shù)據(jù)一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明薄膜顏色變得更加鮮艷。(α+α′)-lack薄膜的ΔE最大，這是因?yàn)棣梁挺痢潆p亞基缺失使SPI的溶解性相對(duì)較弱，導(dǎo)致其在薄膜基質(zhì)中無(wú)序且不均勻分布，Wu等[35]也發(fā)現(xiàn)了，β亞基(α、α′雙亞基缺失)能促進(jìn)熱聚集程度優(yōu)于α和α′亞基，進(jìn)而降低蛋白的溶解度。本研究表明，薄膜不均勻分布使色差偏大，這一結(jié)果與薄膜的微觀結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明α和α′雙亞基缺失會(huì)降低成膜溶解相容性，影響了薄膜的色度。

2.4.5.2 對(duì)薄膜透射率的影響

紫外線照射可能會(huì)造成感光性食品出現(xiàn)氧化、營(yíng)養(yǎng)損失和脫味等質(zhì)量問(wèn)題，因此紫外線阻隔性能是評(píng)估食品包裝材料性能一項(xiàng)重要指標(biāo)。不同亞基缺失型薄膜的紫外- 可見(jiàn)透射光譜分析結(jié)果如圖9。由圖9可知，所有薄膜在200～300 nm的透射率均接近于0，SPI的這種特性歸因于蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸對(duì)紫外線輻射的吸收[36]。在300～800 nm的可見(jiàn)光區(qū)域，α-lack薄膜透射率與Wild薄膜相比無(wú)明顯差異，可見(jiàn)α亞基缺失不會(huì)提升SPI薄膜的光學(xué)性能；而α′-lack和(α+α′)-lack薄膜的光學(xué)阻隔性能都顯著優(yōu)于Wild薄膜，說(shuō)明α′亞基缺失可以降低薄膜的光學(xué)透射率，提升其阻隔效果。不同亞基組成的薄膜都呈現(xiàn)半透明狀，在透明食品包裝中的應(yīng)用潛力巨大。

圖9 不同亞基組成對(duì)SPI薄膜透射率的影響Fig.9 Effect of different subunit compositions on transmittance of SPI films

3 結(jié) 論

本研究以東農(nóng)47(Wild)、α亞基缺失型(α-lack)、α′亞基缺失型(α′-lack)以及α、α′雙亞基缺失型[(α+α′)-lack]4種不同蛋白亞基組成大豆為原料提取SPI，利用溶液流延法制備蛋白薄膜，研究α、α′亞基對(duì)大豆分離蛋白成膜特性的影響。通過(guò)紅外光譜、X-射線衍射等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法發(fā)現(xiàn)，不同亞基組成會(huì)影響SPI薄膜二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，α′亞基缺失使β折疊含量下降，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量增加；同時(shí)α′亞基缺失增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子間氫鍵的相互作用，內(nèi)部網(wǎng)狀交聯(lián)程度增加，提高了薄膜微觀結(jié)構(gòu)的均勻性和致密性。β-伴大豆球蛋白中不同亞基組成對(duì)薄膜結(jié)構(gòu)的影響會(huì)導(dǎo)致其功能特性的差異，對(duì)SPI薄膜的功能特性分析結(jié)果表明：α亞基缺失抑制了SPI成膜能力，降低了薄膜機(jī)械強(qiáng)度；α、α′雙亞基缺失使SPI薄膜出現(xiàn)明顯的縫隙和空腔結(jié)構(gòu)，降低了成膜體系的相容性；α′亞基缺失提高了薄膜的抗拉伸強(qiáng)度，降低了水分含量和水蒸氣透過(guò)性。與其他3種SPI薄膜相比，α′-lack薄膜表現(xiàn)出低吸水性、較強(qiáng)的屏障特性，最高熱穩(wěn)定性以及優(yōu)秀的機(jī)械強(qiáng)度和光學(xué)性能。本研究通過(guò)探索亞基缺失型大豆分離蛋白薄膜結(jié)構(gòu)與物性特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在一定程度上，α′亞基的缺失會(huì)改善大豆蛋白薄膜的結(jié)構(gòu)性能。在證明了分離蛋白中α′亞基的缺失對(duì)SPI成膜有重要影響后，可以單獨(dú)對(duì)特定亞基缺失型大豆品種進(jìn)行繁育和栽培，作為大豆SPI薄膜的專用加工品種，為產(chǎn)品品質(zhì)提升奠定基礎(chǔ)。