綿羊源大腸桿菌的分離以及對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性分析

依再提古麗·熱依木江 狄汶潔 馬雪， 張麗媛， 李劼 周霞* 黃新 吳桐忠 韓猛立 張星星 鐘發(fā)剛

1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院 832003

2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室 832000

大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）是導(dǎo)致人和動物感染及全球食源性疾病暴發(fā)的主要原因。目前，在臨床中綿羊感染大腸桿菌主要應(yīng)用抗生素控制和治療。同時抗生素的普遍使用，使得E.coli耐藥菌株不斷產(chǎn)生，治療效果不佳。研究表明，來自健康動物的E.coli也表現(xiàn)出不同程度的耐藥特性。而且動物體內(nèi)正常菌群E.coli可通過自身基因突變或捕獲外源基因獲得新的耐藥性，此外耐藥基因還能水平轉(zhuǎn)移和垂直傳播，成為動物體內(nèi)潛在的耐藥基因庫?；讦?內(nèi)酰胺類抗生素在獸醫(yī)臨床中的長期廣泛應(yīng)用，綿羊消化道E.coli是否存在β-內(nèi)酰胺類耐藥表型以及攜帶β-內(nèi)酰胺類某些耐藥基因值得研究。因此本研究在分離綿羊腸道正常菌群大腸桿菌基礎(chǔ)上，測定分離株對綿羊源β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥表型和基因的攜帶情況，為后期羊源致病性E.coli耐藥性的研究提供有意義的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便來源于2019 年5 月無菌采集石河子地區(qū)部分羊場阿勒泰羊、新疆細毛羊、哈薩克健康羊糞便。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基E.coli質(zhì)控菌株ATCC25922 購自中國獸藥監(jiān)察所。Mix Taq 酶、dNTP、10×PCR buffer、DL2 000 DNA Marker 等均為TaKaRa 公司產(chǎn)品。其他培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 引物的設(shè)計與合成β-內(nèi)酰胺類耐藥基因引物和細菌16S rRNA 通用引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物情況見表1。耐藥基因包括SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、TEM、CTX-M -9。

表1 大腸桿菌16S rRNA 通用引物、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因所用引物

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離及生化鑒定將綿羊糞便樣品稀釋采用無菌棉簽均勻地涂布于普通瓊脂平板，放置恒溫箱經(jīng)過37℃，18h～24h 培養(yǎng)后，觀察細菌菌落生長特點，將細菌純化后涂片、革蘭染色、鏡檢。將可疑菌接種于葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、VP、MR、吲哚試管中，37℃培養(yǎng)2～3d 觀察結(jié)果。

1.2.2 細菌16S rRNA 序列分析以細菌基因組DNA 提取試劑盒提取的DNA 為模板對目的基因進行擴增。PCR 反應(yīng)體系20μL。條件：95℃ 5min 預(yù)變性，94℃ 50s 變性，56.5℃退火30s，72℃延伸90s，30 個循環(huán)，72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物送至公司（北京睿博興科生物技術(shù)有限）進行測序。

1.2.3 耐藥表型檢測依據(jù)K-B 紙片法和美國臨床試驗實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會手冊進行藥物敏感性表型測定，以ATCC25922 質(zhì)量控制菌，檢測100 株綿羊源E.coli對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥表型檢測。檢測的抗生素包括青霉素、阿莫西林、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢他啶。

1.2.4 細菌的耐藥基因PCR 檢測參照文獻進行引物的合成，引物信息見表1。在提取細菌總DNA 基礎(chǔ)上進行PCR 擴增。

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離及生化鑒定結(jié)果在普通瓊脂平板上呈現(xiàn)灰白色、濕潤、圓形、半透明、表面凸起、直徑約2mm 左右的菌落；在麥康凱平板上呈現(xiàn)紅色、扁平、圓形、濕潤、表面光滑、邊緣整齊的中等大小的菌落。染色鏡檢結(jié)果呈現(xiàn)兩端鈍圓、大量中等大小的革蘭氏陰性菌。初步鑒定了104 株E.coli，經(jīng)過生化鑒定，有100 株與E.coli生化反應(yīng)相符。

2.2 分離細菌16S rRNA 序列分析結(jié)果

16S rRNA 基因進行PCR 擴增、電泳檢測，最終得到大小約為1500 bp 的目的基因條帶。通過BLAST 比對，與大腸桿菌相應(yīng)序列相似度在99%以上（圖1），結(jié)合生化反應(yīng)結(jié)果與細菌16S rRNA 基因序列分析結(jié)果，確定分離的細菌為E.coli。

圖1 同源性分析結(jié)果

2.3 耐藥表型檢測結(jié)果將動物臨床上常用的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物與E.coli生化特性相符的100 株菌進行的耐藥表型檢測，結(jié)果100 株E.coli對青霉素為100%、阿莫西林89%、頭孢拉定80%、對頭孢他啶和頭孢唑林為1%，其中抗1 種藥物的菌株有18 株，占18%，抗2 種藥物的菌株有3 株，占3%，抗3 種藥78 個，占78%，抗4 種藥物的菌株有1 個，占1%，耐藥菌株占總菌株的100%。結(jié)果詳見表3。

表3 100 株綿羊源E.coli 對5 種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥表型

2.4 細菌的耐藥基因PCR 檢測結(jié)果對100 株E.coli進行SHV、TEM、CTX-M-1、CTX-M -2、CTX-M -9耐藥基因擴增，其中98%（98/100）株檢測到了TEM基因大小約為512 bp 的目的片段，100%（100/100）菌株檢測到CTX-M-1大小約為864 bp 基因的目的片段，未檢測到SHV、CTX-M-2和CTX-M -9基因片段。

3 討論

在獸醫(yī)臨床中細菌耐藥率的不斷升高與廣泛使用抗生素所造成的選擇性壓力有關(guān)，而β-內(nèi)酰胺類藥物則是應(yīng)用最普遍的抗菌藥物之一，在臨床感染的治療中發(fā)揮著重要的作用，因此致病性E.coli的耐藥性也成為全球關(guān)注的問題。本研究從健康綿羊糞便中分離100 株羊正常菌群大腸桿菌，通過對5 種臨床常用的β-內(nèi)酰胺類藥物進行耐藥表型分析發(fā)現(xiàn)100 株菌對青霉素耐藥率最高為100%，對阿莫西林和頭孢拉定耐藥率分別為89%、80%，對頭孢他啶、頭孢唑林耐藥率最低均為1%，其中分離株對某些抗生素的耐藥率甚至高于王鵬勇等報道禽源致病性E.coli的耐藥率，如阿莫西林，低于張忠[12]報道寧夏地區(qū)人源臨床分離株E.coli阿莫西林和頭孢他啶的耐藥率。本研究分離的E.coli的耐藥譜型主要以CTX-M-1和TEM為主，耐藥基因的檢出率分別為100%和98%，是本研究中細菌耐藥主要的耐藥基因。菌株所含耐藥基因類型越多，其耐藥率越高。因此石河子地區(qū)部分羊源E.coli對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥存在不同程度的耐藥性。這一結(jié)果為本地區(qū)相關(guān)疾病的防控提供理論依據(jù)。