王淑玲 趙衛(wèi)紅

在女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)生率和病死率位居第四，嚴(yán)重危害女性健康。2018年，全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約57萬例，死亡病例約31.1萬例，且大部分發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。可以確定的是，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染是宮頸癌前病變和宮頸癌的首要原因，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。臨床上現(xiàn)行的宮頸病變篩查手段存在局限性，仍需有效的分流策略避免無病女性的不必要轉(zhuǎn)診和HR-HPV陽性女性的過度治療。因此，有必要闡明導(dǎo)致宮頸病變惡性進(jìn)展的機(jī)制并開發(fā)新的篩查和治療方案。

越來越多的研究表明，宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展離不開表觀遺傳學(xué)的參與。表觀遺傳修飾(epigenetic modification)是指在不干擾有絲分裂或減數(shù)分裂的情況下對(duì)表觀基因組基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，如DNA甲基化(DNA methylation)、羥甲基化、組蛋白修飾、去甲基化、非編碼RNA的調(diào)節(jié)等[2]。目前DNA甲基化是研究得最透徹的表觀遺傳修飾，也是最重要的化學(xué)修飾形式。在HPV感染期間，宿主基因和HPV的異常甲基化促使相應(yīng)基因表達(dá)異常，進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和宿主免疫反應(yīng)，推動(dòng)腫瘤病情進(jìn)展[3]。HPV感染與宿主DNA甲基化可互相調(diào)控，DNA甲基化異?？捎绊慔PV感染，HPV感染也與DNA甲基化異常有關(guān)。異常的DNA甲基化可能有助于區(qū)分非漸進(jìn)性HPV感染以及癌變等級(jí)，在宮頸病變篩查中表現(xiàn)出極大的應(yīng)用價(jià)值。

一、宿主DNA甲基化

DNA甲基化通常發(fā)生在腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶上，通過啟動(dòng)子沉默抑制基因表達(dá)導(dǎo)致整體低甲基化和基因特異性高甲基化，在包括宮頸癌在內(nèi)的致癌機(jī)制中起關(guān)鍵作用[4]。目前在宮頸組織中已檢測出超過100種甲基化標(biāo)志物, 近20種在文獻(xiàn)中被報(bào)道, 其中約有10種基因的甲基化水平在宮頸高級(jí)別病變 (high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL) 和宮頸癌中升高[5]。同時(shí)由于DNA甲基化有較高的特異性，故現(xiàn)階段也正被研究作為宮頸病變篩查的潛在標(biāo)志物。

1.CADM1甲基化：細(xì)胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)，最初也稱為肺癌抑制基因1(lung cancer tumor inhibitor 1，TSLC1)，是編碼免疫球蛋白家族的一種跨膜蛋白，參與上皮細(xì)胞黏附[6]。Yanatatsaneejit等[7]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CADM1在轉(zhuǎn)染HPV16 E7的人宮頸癌細(xì)胞系C33a細(xì)胞中因甲基化而失活，并進(jìn)一步證明了E7癌蛋白與內(nèi)源性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)結(jié)合形成復(fù)合體誘導(dǎo)CADM1啟動(dòng)子甲基化，引起腫瘤抑制基因表達(dá)沉默，導(dǎo)致下游基因表達(dá)水平發(fā)生變化，誘發(fā)腫瘤。Steenbergen等[8]早在2004年提出CADM1基因超甲基化與宮頸病變的進(jìn)展有關(guān)。CADM1的甲基化水平可隨著宮頸病變的嚴(yán)重程度而增加，也就是說，CADM1有區(qū)分各級(jí)宮頸病變的潛力[9]。而且Dankai等[10]在對(duì)3種腫瘤抑制基因(CADM1、FAM19A4和MAL)的甲基化水平進(jìn)行評(píng)估時(shí)，發(fā)現(xiàn)在區(qū)分HSIL與低度鱗狀上皮內(nèi)病變(≤LSIL)時(shí)CADM1基因甲基化的診斷效能最高，其受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)下的面積(area under curve,AUC)為0.684。CADM1不僅是宮頸篩查的高效生物學(xué)標(biāo)志物，而且血漿CADM1甲基化和D-二聚體(D-dimer)聯(lián)合檢測有望成為宮頸癌的轉(zhuǎn)移標(biāo)志物。Rong等[11]在預(yù)測宮頸癌轉(zhuǎn)移時(shí)，血漿CADM1甲基化和D-dimer聯(lián)合的AUC為0.903(95% CI：0.845～0.961，P<0.001)，敏感度為80.4%，特異性為90.5%。因此，CADM1甲基化可作為宮頸病變篩查、診斷及宮頸癌轉(zhuǎn)移潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

2.FAM19A4/miR124-2甲基化：具有序列相似性的19家族[趨化因子(c-cmotif)-樣]成員A4(family with sequence similarity 19 member A4，F(xiàn)AM19A4)，又名TAFA4,是編碼小分泌蛋白的5個(gè)高度同源基因TAFA家族成員。FAM19A4在正常組織中表達(dá)水平較低，在巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬和遷移起促進(jìn)作用，并調(diào)控炎癥感染和應(yīng)激反應(yīng)。伍恒英等[12]推測，F(xiàn)AM19A4基因甲基化診斷宮頸癌的的檢測方法能夠不受HPV的干擾, 尤其是在HR-HPV陰性宮頸癌的診斷中優(yōu)勢更加突出。同樣，Vink等[13]的一項(xiàng)全球性研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM19A4的甲基化水平與宮頸病理組織類型、宮頸癌臨床分期、HPV狀態(tài)及HPV基因型均無關(guān)。該團(tuán)隊(duì)在荷蘭篩查隊(duì)列中將FAM19A4/miR124-2 基因甲基化與細(xì)胞學(xué)相結(jié)合，檢測CIN3+的敏感度達(dá)84.6%(95% CI：78.3%～90.8%),特異性為69.6%(95% CI：66.5%～72.7%)，展現(xiàn)出良好的分診效能[14]。Bu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM19A4與細(xì)胞學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，甲基化率由低到高依次為正常宮頸組織、LSIL、HSIL、宮頸癌(10.61%、35.48%、56.14%和93.44%)。De Strooper等[16]對(duì)FAM19A4/miR124-2甲基化測試細(xì)胞學(xué)陰性(

3.PAX1甲基化：配對(duì)盒家族基因1(paired box1，PAX1)是PAX家族的成員，位于人染色體20p11.2，在胚胎發(fā)育和調(diào)控細(xì)胞分裂和增殖方面發(fā)揮重要作用[17]。它參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在宮頸癌的篩查、診斷、治療及預(yù)后中發(fā)揮著重要的作用。PAX1基因主要負(fù)責(zé)維持宮頸上皮內(nèi)激酶和磷酸酶之間的開關(guān)穩(wěn)態(tài)。PAX1基因通過激活蛋白酪氨酸磷酸酶受體R(protein tyrosine phosphatase, receptor type R，PTPRR)抑制ERK1/2磷化，抑制致癌激酶的活性。同樣，在SET1B和WDR5作用下PAX1基因誘導(dǎo)組蛋白H3第4號(hào)賴氨酸(histone H3 lysine 4，H3K4)甲基化，激活了一系列的磷酸酶。然而，HPV感染可能會(huì)使PAX1發(fā)生甲基化，引起PAX1蛋白表達(dá)缺失，抑制致癌激酶級(jí)聯(lián)，破壞這種平衡[18]。Lai等[19]報(bào)道了PAX1異常甲基化與宮頸癌有關(guān)，PAX1發(fā)生高甲基化抑制其表達(dá)，經(jīng)去甲基化處理后基因重新表達(dá)，發(fā)揮其抑癌作用。李碧軍等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PAX1基因的甲基化具有較高的敏感度和特異性,在細(xì)胞學(xué)異常(ASC-US、LSIL、ASC-H)女性中通過PAX1甲基化檢測分流可提高對(duì)HSIL+的檢出率，而且使用PAX1甲基化代替HPV檢測對(duì)細(xì)胞學(xué)進(jìn)行分流時(shí),陰道鏡轉(zhuǎn)診率可降至34.91%。當(dāng)宮頸惡性與非惡性病變的臨界值(△Cp值)為13.28時(shí)，PAX1甲基化檢測的敏感度、特異性和AUC分別可達(dá)92.30%、78.60%和0.902，其陽性預(yù)測值為80.00%，陰性預(yù)測值為91.67%[21]。

二、HPV-DNA甲基化

除宿主DNA甲基化與宮頸病變有關(guān)外，HPV-DNA甲基化也與宮頸病變進(jìn)展有關(guān)，HPV-DNA甲基化正被用作宮頸病變篩查的重要標(biāo)志物。HPV基因組有3個(gè)功能域，即早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(E1～E7)、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(L1和L2)、以及一個(gè)控制區(qū)(long control region，LCR)，這些區(qū)域中的甲基化與CIN和宮頸癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系。其中，研究最多的有E6、E7、L1、L2和LCR區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化。研究表明，L1和L2區(qū)的甲基化程度隨著疾病的嚴(yán)重程度而增加[22]。關(guān)于LCR區(qū)的甲基化研究結(jié)果尚不一致。Bowden等[22]對(duì)44項(xiàng)HPV DNA甲基化研究進(jìn)行系統(tǒng)回顧和Meta分析，發(fā)現(xiàn)HPV LCR區(qū)的甲基化與疾病嚴(yán)重程度無關(guān)，15項(xiàng)研究報(bào)告在HSIL中LCR區(qū)甲基化程度較高，另6項(xiàng)研究的結(jié)果卻與之相反。

在12種致癌HPV類型中，HPV16、HPV18與HPV45甲基化水平與CIN3和宮頸原位腺癌(cervical adenocarcinoma in-situ, AIS)相關(guān)性最強(qiáng)[23]。有研究表明，HPV16L1、L2、E2和E4區(qū)的高甲基化與CIN3和HPV持續(xù)感染的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，E6基因的高甲基化提示發(fā)生高級(jí)別宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)降低[24,25]。在一項(xiàng)基于10年隨訪宮頸癌篩查隊(duì)列中，評(píng)估了HPV16單獨(dú)甲基化或聯(lián)合E6癌蛋白對(duì)CIN3+的預(yù)測能力。Dong等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在HPV16陽性女性中，甲基化組結(jié)合E6癌蛋白表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，AUC值為0.72～0.82，明顯優(yōu)于細(xì)胞學(xué)。

三、HPV與宿主DNA甲基化相互作用

雖說HPV感染與DNA甲基化間的關(guān)系尚未研究透徹，但可以確定的是，二者間相互作用共同促進(jìn)宮頸癌的惡性病變。Yang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染與宮頸癌中DNA甲基化的調(diào)控相關(guān)。Huang等[28]探討基因啟動(dòng)子甲基化與HR-HPV感染的相互作用，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌前病變中HR-HPV感染與基因啟動(dòng)子環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)和線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)的甲基化水平之間有協(xié)同作用。高危型HPV16和HPV18感染與APC(P=0.008 和P=0.007)、SFRP1(P=0.003和P=0.0067)和PTTEN(P=0.049和P=0.008)啟動(dòng)子甲基化呈顯著正相關(guān)[29]。Nedjai等[30]提出紅細(xì)胞膜蛋白配體4.1樣3(EPB41L3)甲基化可能發(fā)生在HR-HPV感染之前，并與病毒基因組擴(kuò)增和遺傳不穩(wěn)定有關(guān)，使宮頸病變進(jìn)展加快。

HPV基因組不僅自身會(huì)發(fā)生甲基化，HPV蛋白還可誘導(dǎo)宿主基因甲基化，影響相關(guān)基因的表達(dá)。在宮頸病變惡性轉(zhuǎn)化過程中，HPV感染會(huì)引起宿主細(xì)胞的表觀遺傳重新編碼，隨后導(dǎo)致相應(yīng)的HPV基因組表型變異[27]。特別是HPVE6 E7蛋白基因在感染HR-HPV到發(fā)展為宮頸癌中有著至關(guān)重要的作用。它們可誘導(dǎo)DNMT過表達(dá)，該酶可催化蛋白質(zhì)編碼基因和miRNA的異常甲基化[31]。HPV16 E6通過直接結(jié)合宮頸癌細(xì)胞中載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B，APOBEC3B)的啟動(dòng)子來上調(diào)APOBEC3B, 這與細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1，CCND1)低甲基化和宮頸癌細(xì)胞增殖有關(guān)[32]。同樣，HPV16 E7蛋白可以操控宿主細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平引起乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)入核，入核后的LDHA獲得一種非典型酶活性，產(chǎn)生α-羥基丁酸，并觸發(fā)DOT1L介導(dǎo)的組蛋白H3賴氨酸79(histone H3 lysine 79，H3K79)高甲基化，導(dǎo)致抗氧化反應(yīng)和Wnt信號(hào)通路的激活，Wnt通路異常活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[33]。此外，E7癌蛋白還可誘導(dǎo)組蛋白去甲基化酶(lysine-specific demethylase 5A, KDM5A)上調(diào)，而KDM5A與miR-424-5p的啟動(dòng)子結(jié)合，并通過去除H3K4的三甲基和二甲基來抑制miR-424-5p表達(dá)，進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移[34]。Na等[35]研究表明，HPV E7蛋白會(huì)引起C1QBP、BCAP31、CDKN2A和PTMS 4個(gè)基因啟動(dòng)子的異常甲基化，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，但其具體的機(jī)制還有待研究。從這些研究可以看出，與HPV16 E6比較，E7癌蛋白在腫瘤的進(jìn)展中似乎發(fā)揮更強(qiáng)大的作用。

四、展 望

鑒于DNA甲基化在宮頸病變中的關(guān)鍵作用，已有研究提出DNA甲基化有望成為宮頸癌篩查的生物學(xué)標(biāo)志物，有助于探索病毒基因組與宿主基因組的整合，更深入了解宮頸癌的發(fā)病機(jī)制、更準(zhǔn)確地篩查癌前病變，減少不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診。而且聯(lián)合甲基化檢測可以獲得更高的敏感度和特異性，展現(xiàn)出廣闊的研究前景。但是目前的研究尚不充分，如各研究尚沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致不少研究結(jié)果不一致，關(guān)于甲基化的前瞻性研究較少等。因此，仍需深入探尋甲基化在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中作用，尋找最佳的生物學(xué)標(biāo)志物，為宮頸癌的篩查和治療提供新靶點(diǎn)。