牽牛子提取物改善洛哌丁胺所致的大鼠功能性便秘和腸道菌群失調(diào)

陳肖敏,王 煦,陳苗苗

陳肖敏,王煦,陳苗苗,浙江省臺州醫(yī)院、臺州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))路橋醫(yī)院藥劑科 浙江省臺州市 318050

0 引言

功能性便秘(functional constipation,FC)是一種常見的慢性胃腸功能紊亂性疾病,主要是指排除全身及胃腸道器質(zhì)性病變而引發(fā)的排便次數(shù)減少、排便困難以及便不盡感等為主要表現(xiàn)的一種消化系統(tǒng)多發(fā)病.便秘不僅會(huì)導(dǎo)致肛裂、痔瘡等肛周病變的發(fā)生,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及身心健康.甚至有研究提示,長期慢性便秘可誘發(fā)心血管事件,增加腸癌等疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn).腸道微生態(tài)以及腦腸軸等胃腸病學(xué)新概念為探究FC的病因和治療手段提供了新的思路.且研究證實(shí)腸道菌群紊亂與FC的發(fā)生發(fā)展互為因果,便秘人群中普遍存在腸道菌群失調(diào),表現(xiàn)為有益菌數(shù)量減少,有害菌數(shù)量增多;有害菌的大量繁殖又會(huì)進(jìn)一步破壞腸粘膜的保護(hù)功能,加重便秘.中醫(yī)的整體觀念與腸道的微生態(tài)平衡在理論上有著異曲同工之妙,都是強(qiáng)調(diào)整體性和動(dòng)態(tài)平衡;故中醫(yī)中藥在治療便秘上有著獨(dú)特的優(yōu)勢且中藥材中的一些生物活性成分被證實(shí)可防治便秘.牽牛子是旋花科植物裂葉牽?；驁A葉牽牛的干燥成熟種子,常用于治療二便不通、蟲積腹痛以及水腫脹滿等.藥理作用研究顯示,牽牛子具有抑菌瀉下、抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞生長等多種作用.為研究牽牛子對功能性便秘的是否具有治療作用,本研究采用大鼠洛哌丁胺(loperamide,Lop)致便秘模型觀察牽牛子提取物(pharbitis nil extract,PN)對功能性便秘癥狀、腸道菌群平衡和腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響.

1 材料和方法

1.1 材料 BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),電熱恒溫干燥箱(南京蘇恩瑞干燥設(shè)備有限公司),JY-SPCT水平瓊脂糖凝膠電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司),JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)(遼寧賽亞斯科技有限公司),Axioplan 2 imaging E顯微鏡(德國Carl Zeiss AG公司),ELx808酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司).

血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、P物質(zhì)(substance P,SP)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,H&E)染色試劑盒(廣州賴德生物技術(shù)有限公司),E.Z.N.A.Stool DNA試劑盒(美國Omega Bio-tek公司),鹽酸洛哌丁胺膠囊(西安楊森制藥有限公司).

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理∶ 35只SPF級雄性SD大鼠(200 g±20 g)購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)在SPF級動(dòng)物房內(nèi),室溫(23±1) ℃,濕度65%-75%,12 h光暗循環(huán).適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,將其按照隨機(jī)數(shù)表法分為對照組(每天灌胃等體積的生理鹽水,Ctrl,11只),模型組(3 mg·kg·dLop灌胃兩周,Lop,12只)和實(shí)驗(yàn)組(在Lop灌胃的第2周起,增加1.5 g·kg·dPN灌胃,Lop+PN,12只).

(1)排便實(shí)驗(yàn)∶ 給藥方案結(jié)束后,將各組大鼠置于代謝籠中自由活動(dòng)6 h,收集并記錄6 h內(nèi)大鼠糞便顆粒的數(shù)量.稱取并記錄糞便重量(濕重),而后將糞便于60 ℃干燥12 h后再次稱重(干重).糞便含水量=(濕重-干重)/濕重×100%.

(2)小腸推進(jìn)率檢測(墨汁推進(jìn)法)∶ 給藥方案結(jié)束后,各組大鼠均灌胃墨汁2 mL,6 h后麻醉處死大鼠,打開腹腔,取出上至幽門下至回盲部的腸管,平置于桌面上輕輕拉成,測量墨汁推進(jìn)長度(cm)和小腸的總長度(cm).墨汁推進(jìn)率=墨汁推進(jìn)長度/小腸總長度×100%.

(3)結(jié)腸肌電檢測∶ 各組大鼠麻醉后取仰臥位固定于鼠臺上,腹部局部消毒備皮后,沿腹部正中線做縱行切口,充分暴露回盲部.將銀絲電極的一端放置于距盲腸2 cm處的結(jié)腸平滑肌肌層內(nèi);另一端置于距離0.5 cm處,之后縫合固定.將導(dǎo)線接入生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)腸肌電測定.系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置∶ 標(biāo)準(zhǔn)電壓2 mv·cm,高頻濾波10 Hz,時(shí)間常數(shù)3 s,連續(xù)記錄1 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以3 min為一個(gè)時(shí)間段,統(tǒng)計(jì)慢波頻率和振幅的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù).頻率變異系數(shù)=頻率標(biāo)準(zhǔn)差/頻率均值×100%;振幅變異系數(shù)=振幅標(biāo)準(zhǔn)差/振幅均值×100%.

(4)腸道微生態(tài)實(shí)驗(yàn)∶ 各組大鼠處死后,經(jīng)無菌容器收集盲腸內(nèi)糞便,并依據(jù)E.Z.N.A.Stool DNA試劑盒說明書提取糞便DNA,之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的濃度及純度.以所提的DNA為模板,選擇16S rDNA V3V4可變區(qū)序列作為靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增和測序.之后再進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE),并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)鑒定和分析糞便樣本中微生物菌群的組成和差異.引物為帶有barcode的通用上游(338F)和下游(806R)引物.PCR反應(yīng)條件為∶ 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物,并送樣品至廣州永諾生物科技有限公司進(jìn)行測序和分析.

(5)H&E染色∶ 麻醉后處死各組大鼠,打開腹腔并解剖分離結(jié)腸組織.取一部分經(jīng)PBS清洗后置于4%福爾馬林緩沖液中固定24 h,脫水透明后,石蠟包埋大鼠結(jié)腸組織,并將組織切為5 μm厚的石蠟切片.所得切片烤片后置于二甲苯中脫蠟,并經(jīng)梯度乙醇至水化處理.然后按照H&E染色試劑盒說明書步驟,對切片先后進(jìn)行蘇木精和伊紅染液染色.最后常規(guī)進(jìn)行脫水、透明及封片后,于顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的形態(tài)學(xué)特征.

(6)ELISA∶ 取各組大鼠結(jié)腸組織加冰生理鹽水后,于冰上用勻漿器勻漿,1500 rpm、4 ℃離心15 min,收集上清液,依據(jù)試劑盒操作說明書檢測組織中VIP、SP和5-HT的含量.

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,使用GraphPad Prism 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOWA).＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 PN對便秘大鼠腸功能的影響 在排便觀察的6 h內(nèi),與對照組比較,Lop組大鼠的糞便粒數(shù)(圖1A)、糞便含水率(圖1B)和小腸推進(jìn)率(圖1C)均顯著降低(＜0.05);與Lop組比較,Lop+PN組大鼠糞便粒數(shù)(圖1A)、糞便含水率(圖1B)和小腸推進(jìn)率(圖1C)則顯著升高(＜0.05).結(jié)腸肌電檢測結(jié)果顯示(表1)顯示,與對照組比較,Lop組大鼠結(jié)腸慢波頻率顯著減慢,同時(shí)頻率和振幅的變異系數(shù)均顯著升高;與Lop組比較,灌服PN顯著增快結(jié)腸慢波頻率,降低頻率和振幅的變異系數(shù).

圖1 PN對功能性便秘大鼠腸功能的影響.A:糞便顆粒計(jì)數(shù);B:糞便含水量;C:腸道推進(jìn)率.Ctrl組(n=11),Lop組(n=12),Lop+PN組(n=12).數(shù)據(jù)表示為mean±SD,aP＜0.05,cP＜0.05,eP＜0.05 vs Ctrl組;bP＜0.05,dP＜0.05,fP＜0.05 vs Lop組.Ctrl:對照;Lop:洛哌丁胺;PN:牽牛子提取物.

表1 PN對功能性便秘大鼠結(jié)腸肌電活動(dòng)的影響

2.2 PN對便秘大鼠腸道菌群的影響 各組大鼠糞便的PCR-DGGE菌群指紋圖譜和相似性聚類分析結(jié)果如圖2所示,DGGE圖中每個(gè)泳道中不同條帶代表了不同的菌群,條帶的亮度則可以反映菌群含量.指紋圖譜的結(jié)果顯示(圖2A),相較于Ctrl組,Lop組大鼠腸道菌群種類顯著減少,而灌服PN可部分恢復(fù)腸道菌群的多樣性.相似性聚類分析的結(jié)果顯示(圖2B),Lop組大鼠的腸道菌群單獨(dú)歸為一類,而Ctrl組和Lop+PN組歸為一類;說明灌服PN之后,大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能性便秘組之間存在顯著差異.16S rDNA測序結(jié)果顯示,各組大鼠的腸道菌群基本是由四個(gè)菌門組成(圖2C),相較于Ctrl組,Lop組大鼠的擬桿菌門的表達(dá)豐度升高,而厚壁菌門和疣微菌門的表達(dá)豐度降低;灌服PN后,擬桿菌門和疣微菌門的豐度有一定程度的恢復(fù).從科分類水平分析(圖2D),相較于Lop組,灌服PN可顯著增加大鼠腸道內(nèi)乳桿菌科和雙歧桿菌科的表達(dá)豐度.

圖2 PN對功能性便秘大鼠腸道菌群的影響. A:聚合酶鏈反應(yīng)變性梯度凝膠電泳檢測的菌群指紋圖譜;B:相似性聚類分析;C:門類豐度;D:科屬豐度.Ctrl:對照;Lop:洛哌丁胺;PN:牽牛子提取物.

2.3 PN對便秘大鼠結(jié)腸組織學(xué)形態(tài)影響 H&E染色(圖3)結(jié)果顯示,與對照組相比,Lop組大鼠結(jié)腸肌層明顯變薄,腸絨毛排列紊亂,杯狀細(xì)胞數(shù)量減少;灌服PN可顯著改善這一變化,肌層增厚且腸絨毛排列趨向正常,杯狀細(xì)胞數(shù)量也有一定程度的恢復(fù).

就上海市而言，裁執(zhí)分離無疑取得了巨大成功，除了在全市層面上實(shí)施的國有土地上房屋征收補(bǔ)償案件、部分區(qū)探索的環(huán)保行為罰案件領(lǐng)域以外，實(shí)踐中還有大量行政行為有待納入裁執(zhí)分離適用范圍。目前呼聲較為強(qiáng)烈的是規(guī)劃國土部門的責(zé)令退還非法占地、城管部門的責(zé)令恢復(fù)建筑承重墻等方面。這些領(lǐng)域的相關(guān)違法行為嚴(yán)重?fù)p害公共利益，當(dāng)事人拒不執(zhí)行的現(xiàn)象也較為普遍，行政機(jī)關(guān)苦于沒有強(qiáng)制執(zhí)行權(quán)，只能申請法院強(qiáng)制執(zhí)行；而法院往往因?yàn)檫@類強(qiáng)制執(zhí)行工作涉及專業(yè)性較強(qiáng)、執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)不明確、難度過大而難以執(zhí)行。最終各方面的原因?qū)е逻@類違法現(xiàn)象得不到有效整治。如果將其納入裁執(zhí)分離范圍，則可以有效解決執(zhí)行難問題。

圖3 PN對功能性便秘大鼠結(jié)腸組織學(xué)形態(tài)的影響.Ctrl:對照;Lop:洛哌丁胺;PN:牽牛子提取物.

2.4 PN對便秘大鼠結(jié)腸組織中SP、VIP和5-HT表達(dá)的影響 ELISA的檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,Lop組大鼠結(jié)腸組織中SP和5-HT(圖4A和C)水平顯著降低,VIP(圖4B)水平顯著升高;與Lop組比較,灌服PN可顯著上調(diào)便秘大鼠結(jié)腸組織中SP和5-HT水平(圖4A和C)的,并顯著下調(diào)VIP水平(圖4B).

圖4 PN對功能性便秘大鼠結(jié)腸組織中SP、VIP和5-HT水平的影響. A:SP水平;B:VIP水平;C:5-HT水平.Ctrl組(n=11),Lop組(n=12),Lop+PN組(n=12).數(shù)據(jù)表示為mean±SD,aP＜0.05,cP＜0.05,eP＜0.05 vs Ctrl組;bP＜0.05,dP＜0.05,fP＜0.05 vs Lop組.Ctrl:對照;Lop:洛哌丁胺;PN:牽牛子提取物;SP:P物質(zhì);VIP:血管活性腸肽;5-HT:5-羥色胺.

3 討論

牽牛子是一種臨床常用的傳統(tǒng)中藥,其功效繁多,可用于消化不良和便秘的治療.本研究的結(jié)果也證實(shí),PN能促進(jìn)Lop致功能性便秘大鼠的排便,增加糞便含水量;此外,PN還可增加小腸推進(jìn)率,增快結(jié)腸收縮頻率.這些結(jié)果提示,PN可促進(jìn)腸蠕動(dòng),緩解便秘.

寄生于腸道的微生物種類繁多,數(shù)量龐雜,彼此依存并互相制約,維持動(dòng)態(tài)平衡,在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)腸道的功能以確保正常的生理機(jī)能.當(dāng)內(nèi)外環(huán)境發(fā)生變化導(dǎo)致菌群失調(diào),打破正常的生態(tài)平衡就會(huì)誘發(fā)或加重相關(guān)的腸道疾病,功能性便秘即是其中之一,同樣修復(fù)腸道菌群失調(diào)能減輕功能性便秘的嚴(yán)重程度.對便秘患者和正常人群腸道微生物的分析顯示,功能性便秘患者腸道中益生菌的數(shù)量顯著降低.Liang等的研究提示,在門水平上,Lop致便秘小鼠腸道中擬桿菌門豐度增加;在屬水平上,便秘小鼠腸道中的擬桿菌屬、菌以及副擬桿菌屬()等9種菌的表達(dá)豐度降低,而乳桿菌屬的表達(dá)豐度升高.本研究的結(jié)果顯示灌服PN可部分恢復(fù)便秘大鼠腸道中擬桿菌門和疣微菌門的豐度,增加乳桿菌科和雙歧桿菌科的表達(dá).其中擬桿菌是正常腸道中的優(yōu)勢菌,乳桿菌科和雙歧桿菌科均是腸道中的有益微生物,其表達(dá)上調(diào)側(cè)面說明PN可改善腸道微生態(tài),緩解便秘;但腸道菌群對PN的代謝具體有何影響及兩者之間的相互作用還有待進(jìn)一步的研究.

隨著對便秘病因病機(jī)的深入研究,其與腸神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系日漸受到關(guān)注.其中,SP、VIP以及5-HT等均是已被證實(shí)與胃腸道蠕動(dòng)密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì).其中SP是一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),可通過傳導(dǎo)內(nèi)臟痛覺、刺激壁內(nèi)神經(jīng)從以及促進(jìn)消化道平滑肌收縮等方式促進(jìn)胃腸蠕動(dòng).5-HT是廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的一種興奮性遞質(zhì),可通過與相應(yīng)的受體結(jié)合,調(diào)控胃腸道運(yùn)動(dòng)及胃腸激素的分泌.VIP既是胃腸激素也是抑制性神經(jīng)遞質(zhì),可擴(kuò)血管、松弛腸道平滑肌,減慢腸道推進(jìn)型蠕動(dòng).本研究發(fā)現(xiàn),灌服PN可顯著上調(diào)便秘大鼠結(jié)腸組織中SP和5-HT的表達(dá),并顯著下調(diào)VIP表達(dá).這些結(jié)果顯示,PN改善便秘癥狀的作用可能與上調(diào)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)SP、5-HT和下調(diào)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)VIP相關(guān).

4 結(jié)論

綜上所述,PN可緩解Lop所致的FC大鼠的便秘癥狀,促進(jìn)便秘大鼠的腸道蠕動(dòng),降低結(jié)腸肌電活動(dòng),并改善結(jié)腸組織形態(tài)、腸道菌群失衡和腸神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào).

牽牛子具有瀉下、利尿、消腫和抗炎的作用,而其對功能性便秘的具體藥理作用和機(jī)制并不完全清楚.

探索牽牛子提取物對功能性便秘大鼠的改善作用及其初步機(jī)制.

將大鼠分為對照組、模型組和牽牛子提取物治療組.觀察各組大鼠的排便情況并測定各組大鼠的小腸運(yùn)動(dòng)、大腸肌電活動(dòng)、結(jié)腸組織形態(tài)、腸道菌群以及神經(jīng)遞質(zhì).

牽牛子提取物增加功能性便秘大鼠的排便和糞便含水量,增強(qiáng)小腸運(yùn)動(dòng),降低結(jié)腸的慢波的頻率和振幅的變異程度,改善結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)和腸道菌群失調(diào),并增加結(jié)腸組織中P物質(zhì)和5-羥色胺水平,降低血管活性腸肽水平.

牽牛子提取物可通過促進(jìn)腸蠕動(dòng),修復(fù)腸道菌群失調(diào),上調(diào)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)和5-羥色胺以及下調(diào)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)血管活性腸肽,進(jìn)而緩解大鼠功能性便秘.

牽牛子提取物有望成為功能性便秘的潛在治療藥物.