吳 杰，鄧 波，陳雪穎，王翰陽，張 城，林瑞平，沈亞菊，徐子偉*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000；3.杭州正興牧業(yè)有限公司，浙江杭州 311301；4. 平湖市畜牧獸醫(yī)站，浙江嘉興 314200）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Dеoxynivalеnol，DON）是鐮刀菌在生長過程中產(chǎn)生的一種有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于B 型非大環(huán)類單端孢霉烯族毒素的一種。DON 廣泛存在于谷物及其制品中，并且DON 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，研磨、加熱、高壓等處理均很難將其破壞，全球每年因DON 污染谷物而造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)十億美金。免疫系統(tǒng)是DON 攻擊的主要對(duì)象。研究表明，DON被腸道吸收后會(huì)隨著血液快速進(jìn)入胸腺、脾臟等免疫器官，影響細(xì)胞增殖并引發(fā)凋亡，造成氧化損傷，DON還會(huì)抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)病原體做出免疫應(yīng)答，影響疫苗接種效果，導(dǎo)致豬群爆發(fā)疾病。在日糧中添加吸附劑是緩解DON 對(duì)機(jī)體損害的一種常見的方法，然而由于DON 極性及親電性較弱，大多數(shù)吸附劑對(duì)其吸附效果很低。植物炭黑是以天然植物、殼等為原料經(jīng)高溫碳化、活化后得到，主要成分為碳，有效孔徑為3.56 nm，比表面積1 440.09 m/g，孔體積為1.28 cm/g，是一種活性炭類吸附劑，該類吸附劑具有較大的比表面積及較強(qiáng)靜電吸附力，對(duì)毒素有很好的吸附效果，在體外緩沖液體系中對(duì)DON 吸附率能達(dá)到84% 以上，然而關(guān)于植物炭黑在體內(nèi)應(yīng)用效果的研究還較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)0.1% 植物炭黑能抑制DON 對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的降低，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究添加植物炭黑對(duì)飼喂DON 污染飼糧仔豬疫苗抗體水平、血清免疫球蛋白和胸腺、脾臟抗氧化力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 植物炭黑由福建百草霜生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選取48 頭24 日齡的健康杜大長斷奶仔豬（公豬），平均體重為（7.76±0.24）kg，按照體重隨機(jī)分為4 組，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧（CTR組）、基礎(chǔ)飼糧+0.1% 植物炭黑（PCB 組）、基礎(chǔ)飼糧+1.5 mg/kg DON（DON 組）、基礎(chǔ)飼糧+1.5 mg/kg DON+0.1%植物炭黑（PD 組），每組12 頭仔豬分3 欄，每欄4 頭，每頭仔豬為1 個(gè)重復(fù)單位，試驗(yàn)期21 d。

1.3 飼養(yǎng)管理與試驗(yàn)日糧 本試驗(yàn)在浙江省杭州正興牧業(yè)有限公司內(nèi)進(jìn)行，所有欄舍為封閉式、漏縫地板。每日07:00、12:00、18:00 飼喂飼料，每次飼喂遵循少量多次原則，至下次飼喂余料基本沒有，自由飲水，免疫程序按照豬場常規(guī)方法進(jìn)行。每天對(duì)圈舍進(jìn)行清掃，定期對(duì)豬舍進(jìn)行消毒。試驗(yàn)期早晚觀察仔豬精神狀態(tài)。

基礎(chǔ)飼糧參照NRC（2012）豬營養(yǎng)需要配置，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)及疫苗抗體的測定 試驗(yàn)第10 天和第21 天，08:00 對(duì)所有仔豬進(jìn)行采血，靜置30 min 后3 000 r/min 離心10 min，分離得到血清，置于-20℃保存，用于測定測定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM），測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。第21 天血清同時(shí)測定豬瘟抗體、圓環(huán)2 型抗體及口蹄疫O 型抗體，測定試劑盒購自愛德士公司（IDEXX）。

1.4.2 胸腺、脾臟抗氧化指標(biāo)的測定 試驗(yàn)第21 天，每欄隨機(jī)挑選2 頭仔豬進(jìn)行屠宰采樣。仔豬采樣電擊致死后放血，分離胸腺和脾臟，裝入凍存管后立即放入液氮中速凍待測。脾臟及胸腺超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性嚴(yán)格按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書進(jìn)行測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以個(gè)體為重復(fù)經(jīng)Excеl 2019初步分析后，使用SPSS17.0 軟件對(duì)4 組數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因子方差分析，當(dāng)有顯著互作效應(yīng)或有顯著互作效應(yīng)趨勢(shì)時(shí)，采用LSD 多重比較檢測4 組間的顯著性。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以<0.05 為差異顯著，以0.05<<0.1 為有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物炭黑對(duì)飼喂DON 污染飼糧仔豬血清疫苗抗體的影響 如表2 所示，飼糧添加1.5 mg/kg DON 或0.1%植物炭黑對(duì)仔豬21 d 血清豬瘟抗體、2 型圓環(huán)抗體、O型口蹄疫抗體各無顯著影響。

表2 植物炭黑對(duì)飼喂DON 污染飼糧仔豬疫苗抗體水平的影響（n=12）

2.2 植物炭黑對(duì)飼喂DON 污染飼糧仔豬血清免疫球蛋白的影響 如表3 所示，飼喂1.5mg/kg DON 污染飼糧降低了第10 天仔豬血清IgA、IgG、IgM 及第21 天IgG 含量（<0.05），并有降低第21 天血清IgA 含量的趨勢(shì)（0.05<<0.1），飼糧中添加0.1% 植物炭黑對(duì)仔豬血清免疫球蛋白無顯著影響。DON 和植物炭黑對(duì)血清第10 天IgG 有互作效應(yīng)趨勢(shì)（0.05<<0.1），對(duì)第21 天IgG 有顯著互作效應(yīng)，多重比較結(jié)果顯示，較CTR 組相比，DON 組血清 第10 天 及21 天IgG 含 量顯著降低，飼糧中添加0.1% 植物炭黑能緩解DON 對(duì)血清IgG 的影響，PD 組第10 天及第21 天IgG 含量與CTR 無顯著差異。

表3 植物炭黑對(duì)飼喂DON 污染飼糧仔豬血清免疫球蛋白的影響（n=12） g/L

2.3 植物炭黑對(duì)飼喂DON 污染飼糧仔豬胸腺、脾臟抗氧化指標(biāo)的影響 如表4 所示， DON 會(huì)顯著增加胸腺M(fèi)DA 含量，顯著降低脾臟T-AOC、CAT 含量，并有降低脾臟GSH-Px 含量的趨勢(shì)（0.05<<0.1）。飼糧中添加0.1%植物炭黑對(duì)仔豬胸腺及脾臟抗氧化指標(biāo)無顯著影響。DON 刺激及添加植物炭黑對(duì)胸腺SOD 及脾臟CAT 活性有顯著互作效應(yīng)，對(duì)胸腺M(fèi)DA 及脾臟GSHPx 有互作效應(yīng)趨勢(shì)（0.05<<0.1），多重比較結(jié)果顯示，DON 組仔豬的胸腺M(fèi)DA 含量較CTR 組、PCB 組顯著增加，且其胸腺SOD 及脾臟GSH-Px 含量較CTR 組顯著降低。飼糧中添加0.1% 植物炭黑能緩解DON 對(duì)胸腺及脾臟的氧化損傷，PD 組仔豬胸腺SOD、MDA 含量及脾臟CAT、GSH-Px 含量較CTR 組仔豬無顯著差異。

表4 植物炭黑對(duì)飼喂DON 污染飼糧仔豬胸腺、脾臟抗氧化指標(biāo)的影響（n=6）

3 討 論

動(dòng)物可以通過接種疫苗來獲得對(duì)某些疾病的抗性，然而包括DON 在內(nèi)的多種霉菌毒素可通過細(xì)胞免疫、體液免疫來影響機(jī)體免疫系統(tǒng)，增加對(duì)病毒、細(xì)菌、寄生蟲等的易感性，從而影響疫苗的接種效率。Savard 等研究發(fā) 現(xiàn)，2.5 mg/kg 或3.5 mg/kg的DON 污染飼糧會(huì)降低仔豬藍(lán)耳病毒疫苗中病毒在體內(nèi)的復(fù)制，從而降低疫苗接種效率。DON 對(duì)疫苗接種的影響和DON 濃度有關(guān)，Yunus 等在肉雞中發(fā)現(xiàn)低濃度DON（1.68 mg/kg DON）對(duì)新城疫、傳染性支氣管病毒、傳染性法氏囊病毒抗體滴度無顯著影響，只有高濃度DON（12.21 mg/kg）才能顯著提高新城疫病毒抗體滴度，降低傳染性支氣管炎病毒抗體滴度。本研究中仔豬采食1.5 mg/kg DON 污染飼糧后血清抗體并無顯著變化，這可能是由于DON暴露時(shí)間偏短，有研究表明無論低濃度（1 mg/kg）或高濃度（3 mg/kg）DON 刺激仔豬都需要28 d 才會(huì)顯著影響血清中抗體滴度，而本試驗(yàn)期為21 d，DON對(duì)疫苗接種的效果可能還未顯現(xiàn)。在霉菌毒素污染飼糧中針對(duì)性添加吸附劑是降低毒素對(duì)機(jī)體免疫損傷的有效方法。Zhang 等發(fā)現(xiàn)飼料中添加水合鈉鈣鋁硅酸鹽能有效緩解DON 引起的豬血清中圓環(huán)抗體滴度下降。劉寧在飼喂自然霉變飼糧的仔豬中也發(fā)現(xiàn)，添加0.1%或0.25%的酵母細(xì)胞壁能顯著提高血清中豬瘟抗體效價(jià)，使其達(dá)到正常水平。本試驗(yàn)中，在正常飼糧或DON 污染飼糧中添加植物炭黑對(duì)血清疫苗抗體均未產(chǎn)生顯著影響，這從側(cè)面反映植物炭黑并不會(huì)主動(dòng)性影響疫苗接種效果，預(yù)防性添加是較為安全的。

免疫球蛋白是動(dòng)物發(fā)揮體液免疫應(yīng)答重要的免疫分子，其含量可反映動(dòng)物機(jī)體免疫性能。根據(jù)暴露時(shí)間及劑量的不同，DON 可能對(duì)機(jī)體表現(xiàn)免疫抑制或免疫激活作用。研究表明低劑量的DON 會(huì)上調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)，激活免疫系統(tǒng)，增加IgA、IgG 等免疫球蛋白含量，而高劑量DON 會(huì)引發(fā)白細(xì)胞凋亡，降低免疫球蛋白含量，抑制機(jī)體免疫。本試驗(yàn)中，斷奶公豬飼喂1.5 mg/kg DON 污染飼糧第10 天血清IgA、IgG 及IgM 含量便出現(xiàn)顯著降低，這提示在此試驗(yàn)條件下，DON 抑制了仔豬免疫應(yīng)答，降低機(jī)體抵抗力，結(jié)果與Wang 等研究一致，其在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將脾臟淋巴細(xì)胞暴露在0.1～0.8 μg/mL DON 培養(yǎng)基 中，12、24、48 h 細(xì)胞中IgG 及IgM 顯著降低，并且效果和DON 劑量呈正相關(guān)。楊婉瑩在斷奶仔兔中也發(fā)現(xiàn)，灌服0.5 mg/kg BW 或1.5 mg/kg BW DON 31 d 均會(huì)降低血清中IgA、IgG、IgM 含量，高濃度效果更顯著。本試驗(yàn)中，在霉變飼糧中添加植物炭黑以求其降低DON 對(duì)機(jī)體的免疫毒性，本次仔豬體內(nèi)試驗(yàn)顯示，在DON 污染飼糧中添加0.1%植物炭黑能有效抑制DON 引起的血清IgG 降低，免疫球蛋白水平與正常仔豬無顯著差異，說明植物炭黑能在體內(nèi)有效吸附DON，緩解DON 對(duì)機(jī)體的免疫抑制，結(jié)果與劉寧使用酵母細(xì)胞壁結(jié)果相一致。另外Chu 等研究發(fā)現(xiàn)在正常飼糧中添加活性炭類吸附劑能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高仔豬血清中IgG、IgM 水平，然而本研究未發(fā)現(xiàn)這種影響，這表明在本試驗(yàn)條件下，正常飼糧中添加植物炭黑不會(huì)影響機(jī)體的體液免疫。

脾臟及胸腺是動(dòng)物機(jī)體重要的免疫器官，胸腺是T 淋巴細(xì)胞分化成熟的中樞免疫器官，能誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞分化成熟為功能不同的T 細(xì)胞亞群，而脾臟是體內(nèi)最大的免疫器官，是T 細(xì)胞和B 細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場所。胸腺是對(duì)DON 最敏感的組織器官之一，DON 能快速激活胸腺中T 細(xì)胞受體并引起胸腺細(xì)胞陰性選擇。Zhang等在斷奶仔豬中發(fā)現(xiàn)，DON 會(huì)引起胸腺組織病變，加速細(xì)胞凋亡，并破壞其原有氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡。DON 吸收后也會(huì)快速進(jìn)入脾臟組織，Pеstka 等研究發(fā)現(xiàn)小鼠急性暴露在DON 下會(huì)增加促炎因子的釋放，對(duì)脾臟造成氧化損傷。Wang 等使用0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL DON 作用于 脾臟細(xì) 胞，細(xì)胞中GSH-Px、SOD、CAT 含量顯著下降，MDA 含量顯著增加，并且效果與DON 劑量及作用時(shí)間呈正相關(guān)。陳群等在仔豬中也發(fā)現(xiàn)，飼喂多種鐮刀菌毒素混合污染（DON、煙曲霉毒素、玉米赤霉烯酮）的飼糧會(huì)顯著降低斷奶仔豬脾臟中GSH-Px 及SOD 含量，顯著增加MDA 含量。與之前研究結(jié)果一致，本研究也發(fā)現(xiàn)DON 的攝入增加了胸腺M(fèi)DA 含量，降低了脾臟T-AOC、CAT 含量，并有降低脾臟GSH-Px 含量的趨勢(shì)，表明DON 打破了免疫組織原有的氧化-抗氧化穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，引起免疫器官的氧化應(yīng)激反應(yīng)。目前國內(nèi)外有關(guān)吸附劑緩解DON 對(duì)免疫器官損傷的研究還較少，葉飛在仔豬中發(fā)現(xiàn)添加吸附劑能緩解DON 引起的脾臟腫大，降低脾臟指數(shù)。Zhang 等研究表明水合鈉鈣鋁硅酸鹽能降低DON 引起的胸腺組織病理損傷并抑制抗氧化指標(biāo)代償性增加，減緩脾臟細(xì)胞凋亡，降低氧化損傷。與之前研究相一致，本試驗(yàn)在DON 污染飼糧中添加0.1% 植物炭黑后，脾臟和胸腺各抗氧化指標(biāo)均與對(duì)照組相比無顯著差異，這可能是因?yàn)橹参锾亢谶@種活性炭類吸附劑能有效在腸道吸附DON，降低DON 的吸收，從而減少DON 及其代謝產(chǎn)物在免疫器官的含量，降低對(duì)免疫器官的氧化損傷。另外單獨(dú)添加植物炭黑對(duì)胸腺、脾臟的抗氧化指標(biāo)未見顯著差異，說明單獨(dú)添加植物炭黑對(duì)免疫器官不會(huì)造成損傷，與Wang 等的結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加0.1%植物炭黑能有效抑制DON 引起的血清免疫球蛋白下降，減輕胸腺及脾臟的氧化應(yīng)激，從而緩解DON 對(duì)仔豬免疫系統(tǒng)的損傷。單獨(dú)添加植物炭黑并不會(huì)對(duì)機(jī)體疫苗接種效果、免疫球蛋白及免疫器官的抗氧化性能造成負(fù)面影響。