GDC-0449在CCl4聯(lián)合二乙酰氨基芴誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型中的作用

胡永紅， 肖 準(zhǔn)， 付亞東， 梁 悅， 張霖璋， 劉 偉， 慕永平，劉成海， 劉 平,3， 陳佳美

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所， 上海 201203；2 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203；3 上海中醫(yī)藥大學(xué) 交叉科學(xué)研究院， 上海 201203

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段[1]，最終可致終末期肝病甚至肝細(xì)胞癌[2-3]，成為危害人類健康的主要問題之一[4]。肝纖維化病因病理機(jī)制復(fù)雜，持續(xù)性毒性損傷、代謝性障礙等造成肝細(xì)胞受損和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)轉(zhuǎn)分化為可分泌膠原的肌成纖維細(xì)胞[5]，導(dǎo)致肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積而形成纖維疤痕[6]。目前已證實(shí)，抗病毒治療可有效逆轉(zhuǎn)慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎相關(guān)肝纖維化，但仍有約15%的慢性病毒感染者盡管有持續(xù)性病毒應(yīng)答，而肝纖維化并無改善[7-8]；在代謝性肝病中，雖然改變生活方式或減重手術(shù)可改善纖維化組織病理學(xué)變化[9]，但尚無有效治療非酒精性脂肪性肝病的化合藥物；且在去除誘發(fā)肝內(nèi)炎癥反應(yīng)的因素后，仍無法預(yù)防危及生命的并發(fā)癥。因此，除病因治療外，深入對(duì)肝纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的解析，找尋新的治療靶點(diǎn)或開發(fā)新的治療藥物以減緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化甚為重要。

Hedgehog信號(hào)通路是成人肝臟修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，該信號(hào)通路活化由Hedgehog配體Desert Hedgehog(Dhh)、Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)結(jié)合膜受體Patched(Ptch1、Ptch2)介導(dǎo)，解除對(duì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Smoothened(Smo)的抑制，激活下游轉(zhuǎn)錄因子膠質(zhì)瘤相關(guān)致癌基因(glioma-associated oncogene，Gli)家族(Gli1、Gli2、Gli3)，以調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化[10]。2001年經(jīng)cDNA陣列分析發(fā)現(xiàn)Ptch在原發(fā)性膽汁性膽管炎和原發(fā)性硬化性膽管炎患者肝組織中表達(dá)上調(diào)，首次提出Hedgehog信號(hào)通路參與肝臟疾病的發(fā)生[11]。隨之，越來越多的研究報(bào)道Hedgehog信號(hào)通路參與肝纖維化過程，且其活化程度與纖維化進(jìn)展和肝損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[10]?；贖edgehog信號(hào)通路在肝纖維化中的重要作用，本研究旨在證實(shí)該信號(hào)通路抑制劑維莫德吉(GDC-0449)在CCl4聯(lián)合二乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF)誘導(dǎo)的肝纖維大鼠模型中的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Fisher344雌性大鼠18只，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0011；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(滬)2014-008。

1.2 試劑及藥物 CCl4(貨號(hào)10006480)、橄欖油(貨號(hào)6918028)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。2-AAF(貨號(hào)A7015)購(gòu)于Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司。羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)A030-2-1)、HE染液試劑盒(貨號(hào)D006-1-3)均購(gòu)于南京建成生物工程研究所有限公司。蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(貨號(hào)P1050)、山羊血清(貨號(hào)C0265)、APS(貨號(hào)ST005)、30% Acr-Bis(29∶1)(貨號(hào)ST003)、1.5 mol/L Tris-HCl(貨號(hào)ST789)、1.0 mol/L Tris-HCl(貨號(hào)ST768)、10% SDS(貨號(hào)ST628)均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。免疫組化試劑盒(貨號(hào)GK500705)購(gòu)自基因科技有限公司?？俁NA提取試劑盒(Total RNA Purification Kit MagExtractor，貨號(hào)NPK-201)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover，貨號(hào)FSQ-301)、SYBR Green Real Time Master Mix(貨號(hào)QPK-201)均購(gòu)于東洋紡(上海)生物科技有限公司。GDC-0449(貨號(hào)S1082)購(gòu)于Selleck公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備 將18只Fisher344大鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常組、CCl4/2-AAF組和GDC-0449組，每組6只。應(yīng)用CCl4/2-AAF誘導(dǎo)肝纖維大鼠模型，模型大鼠按2 mL/kg體質(zhì)量皮下注射30% CCl4-橄欖油溶液，每周2次，持續(xù)6周，以誘導(dǎo)肝纖維化，正常組注射等體積的橄欖油溶劑；自第7周始，注射CCl4的大鼠同時(shí)予2-AAF 100 mg·kg-1·d-1灌胃，以達(dá)到肝纖維化進(jìn)展過程中抑制肝細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝祖細(xì)胞(hepatic progenitor cell，HPC)大量增殖的目的；GDC-0449組按照25 mg·kg-1·d-1灌胃干預(yù)，正常組大鼠予等體積生理鹽水灌胃對(duì)照。9周末處死取材。

1.3.2 肝組織HE染色 采用肝組織石蠟切片，二甲苯及梯度酒精脫蠟，蘇木素染色10 min，0.4%鹽酸酒精分化，伊紅染色30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用Leica SCN400掃片機(jī)掃描，ImageScope軟件觀察肝組織病理情況。

1.3.3 肝組織天狼猩紅(SR)染色及膠原陽性面積比計(jì)算 采用肝組織石蠟切片，二甲苯梯度酒精脫蠟，滴加SR染液，37 ℃孵育15 min，無水酒精分化4 s，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用Leica SCN400掃片機(jī)掃描，ImageScope軟件圈選整張切片面積，得出Percent Total Positive、Total Stained Area、Total Analysis Area值，計(jì)算膠原染色面積比=Percent Total Positive × Total Stained Area/Total Analysis Area。

1.3.4 Ishak炎癥活動(dòng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[12]按照不同損傷特征進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)分。(1)門管區(qū)周圍或周圍間隔區(qū)交界面肝炎(碎片狀壞死)：0～4分；(2)融合性壞死：0～6分；(3)局灶性(斑狀)溶解性壞死，凋亡及局灶性炎癥：0～4分；(4)門管區(qū)炎癥：0～4分。

1.3.5 羥脯氨酸(Hyp)水平測(cè)定 準(zhǔn)確稱取40～50 mg肝組織，加入水解液水解，調(diào)pH至中性，定容至10 mL，加活性炭離心，取1 mL上清加R1試劑，靜置10 min，加R2試劑，靜置5 min，加R3試劑，60 ℃水浴15 min，3500 r/min，離心10 min，取上清200 μL，酶標(biāo)儀550 nm處測(cè)OD值。計(jì)算Hyp(μg/mg)=(測(cè)定孔OD值-空白孔OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)孔OD值-空白孔OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品含量(5 μg/mL)×水解液總體積(10 mL)/肝組織樣品(mg)。

1.3.6 免疫組化染色 肝組織石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟，檸檬酸高溫修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，10%山羊血清封閉，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染1 min，0.4%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片?？贵w信息如下：兔抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體(貨號(hào)ab124964)、兔抗Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)抗體(貨號(hào)ab6586)、兔抗上皮細(xì)胞黏附分子(Epcam)抗體(貨號(hào)ab71916)均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；兔抗細(xì)胞角蛋白(CK)19抗體(貨號(hào)10712-1-AP)、兔抗CK7抗體(貨號(hào)15539-1-AP)均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.3.7 免疫熒光共染 采用肝組織冰凍切片，預(yù)冷丙酮固定肝組織，10%山羊血清封閉，同時(shí)加入兩種不同來源的一抗，4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫，加入二抗37 ℃孵育30 min，DAPI染核，抗熒光淬滅封片液封片，熒光倒置顯微鏡獲取圖像?？贵w信息如下：兔抗CK19抗體(貨號(hào)10712-1-AP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；鼠抗卵圓細(xì)胞標(biāo)志物6(OV6)抗體(貨號(hào)sc-101863)購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 使用MagExtractor total RNA提取試劑盒提取肝組織總RNA；采用Nano Vue濃度檢測(cè)儀檢測(cè)總RNA的濃度及純度；采用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，采用GAPDH校正，定量方法采用ΔΔCT法，SYBR Green兩步法反應(yīng)條件為：50 ℃預(yù)處理2 min，循環(huán)1次；95 ℃預(yù)變性60 s，循環(huán)1次；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，循環(huán)45次。

1.3.9 免疫蛋白印跡法(Western Blot) 采用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解肝組織，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，制備變性蛋白樣本。制備丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，使用Odyssey儀器掃描成像，Image-J軟件進(jìn)行灰度積分值分析?？贵w信息如下：兔抗α-SMA抗體(貨號(hào)ab5694)購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：PZSHUTCM190505002，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 GDC-0449對(duì)CCl4/2-AAF肝纖維化大鼠肝組織病理變化的影響 HE與SR染色顯示，與正常組相比，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中大量膽管細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞聚集，膠原沉積顯著增加，形成明顯的假小葉結(jié)構(gòu)；與CCl4/2-AAF組相比，GDC-0449組肝組織中膽管細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞聚集，膠原沉積顯著減少(圖1)。對(duì)SR全片陽染面積半定量分析顯示，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織SR陽性染色面積比較正常組顯著增加(P<0.05)，GDC-0449組大鼠肝組織SR陽性染色面積比較CCl4/2-AAF組顯著下降(P<0.05)(表1)。肝組織Hyp水平測(cè)定進(jìn)一步顯示，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中Hyp水平顯著高于正常組(P<0.05)；與CCl4/2-AAF組相比，GDC-0449組大鼠肝組織中Hyp水平則顯著減少(P<0.05)(表1)。Ishak評(píng)分結(jié)果顯示，與正常組相比，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織Ishak評(píng)分顯著增高(P<0.05)，而GDC-0449組較CCl4/2-AAF組Ishak評(píng)分顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠肝組織SR陽性染色面積比、Hyp水平及Ishak評(píng)分比較

圖1 各組大鼠肝組織HE、SR染色

2.2 GDC-0449對(duì)CCl4/2-AAF肝纖維化大鼠肝組織膠原表達(dá)和HSC活化的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，與正常組相比，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中Col-Ⅳ和α-SMA陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增多，GDC-0449組大鼠Col-Ⅳ和α-SMA表達(dá)則顯著減少(圖2)。qRT-PCR結(jié)果顯示，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅳ和Acta2 mRNA表達(dá)顯著升高(P值均<0.05)，而GDC-0449組肝組織中Acta2 mRNA表達(dá)較CCl4/2-AAF組則明顯下調(diào)(P<0.05)(表2)。Western Blot結(jié)果顯示，CCl4/2-AAF組大鼠α-SMA蛋白水平較正常組顯著增多(P<0.01)，GDC-0449組α-SMA蛋白水平較CCl4/2-AAF組則明顯減少(P<0.01)(圖3)。

圖2 Col-Ⅳ和α-SMA免疫組化染色(×200)

表2 各組大鼠肝組織Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、Acta2 mRNA表達(dá)量變化

注：a，α-SMA的Western Blot結(jié)果；b，α-SMA蛋白的相對(duì)含量。圖3 各組大鼠α-SMA蛋白水平

2.3 GDC-0449對(duì)CCl4/2-AAF肝纖維化大鼠肝組織HPC增殖、分化的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，與正常組相比，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中表達(dá)大量的HPC標(biāo)志物Epcam，以及膽管細(xì)胞標(biāo)志物CK19和CK7，GDC-0449組肝組織Epcam、CK19和CK7陽性細(xì)胞數(shù)較CCl4/2-AAF組顯著減少(圖4)。qRT-PCR結(jié)果顯示，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中Epcam、CK19、CK7和細(xì)胞周期蛋白1(Ccnd1)mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P值均<0.05)，GDC-0449組肝組織中Epcam、CK19、CK7和Ccnd1 mRNA表達(dá)較CCl4/2-AAF組明顯下調(diào)(P值均<0.05)(表3)。免疫熒光共染結(jié)果顯示，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中幾乎所有的CK19陽性細(xì)胞均表達(dá)HPC標(biāo)志物OV6，且共表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著多于正常組；而與CCl4/2-AAF組相比，GDC-0449組共表達(dá)CK19與OV6的陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(圖5)。

圖4 Epcam、CK19和CK7免疫組化染色(×200)

表3 各組大鼠肝組織Epcam、CK19、CK7和Ccnd1 mRNA表達(dá)水平

圖5 CK19(紅色)和OV6(綠色)免疫熒光共染

2.4 GDC-0449對(duì)CCl4/2-AAF大鼠肝組織Hedgehog信號(hào)通路活化的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中Smo、Dhh、Ptch2、Gli1、Gli2和Gli3的表達(dá)顯著升高(P值均<0.05)，予GDC-0449干預(yù)后，大鼠肝組織中Smo、Ptch2、Gli1、Gli2和Gli3表達(dá)較CCl4/2-AAF組顯著降低(P值均<0.05)(表4)。

表4 各組大鼠肝組織Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)量變化

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病遷延轉(zhuǎn)歸的中間環(huán)節(jié)，臨床研究[13]表明肝纖維化可延緩甚至可逆，因此，抗肝纖維化治療成為治療慢性肝病的重要環(huán)節(jié)。Hedgehog信號(hào)通路激活在受損肝臟再生修復(fù)過程中是必需的，是不同因素導(dǎo)致的肝臟修復(fù)與重建的共同信號(hào)通路；但過度和持續(xù)的活化會(huì)終止受損肝組織的再生修復(fù)，并促使其向肝纖維化進(jìn)展[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在CCl4/2-AAF誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中，肝組織炎性細(xì)胞大量聚集，形成明顯的假小葉結(jié)構(gòu)，提示實(shí)驗(yàn)大鼠肝硬化已形成；此外，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中Dhh、Smo、Ptch2、Gli1、Gli2和Gli3表達(dá)較正常組顯著上調(diào)，提示Hedgehog信號(hào)通路被激活。

GDC-0449是2012年首次獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療基底細(xì)胞癌的Hedgehog信號(hào)通路抑制劑[15]，可阻斷細(xì)胞表面受體Ptch和Smo活性，進(jìn)而抑制其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli2活化，阻斷Hedgehog信號(hào)通路。研究[16]發(fā)現(xiàn)，GDC-0449可改善膽管結(jié)扎大鼠早期肝纖維化程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GDC-0449可顯著降低CCl4/2-AAF大鼠肝組織Smo、Ptch2、Gli1、Gli2和Gli3的表達(dá)，抑制肝組織炎性細(xì)胞聚集，降低Hyp水平，減少肝內(nèi)膠原陽性面積比。提示GDC-0449可顯著改善CCl4/2-AAF大鼠肝組織纖維化程度。

肝纖維化進(jìn)展過程涉及多種細(xì)胞的激活，HSC活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)原代HSC活化后可表達(dá)Hedgehog配體、Hedgehog信號(hào)通路受體及其下游轉(zhuǎn)錄因子，且Hedgehog信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴胺(Cyclopamine)可阻抑HSC活化。本實(shí)驗(yàn)中，CCl4/2-AAF誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中HSC活化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)較正常組顯著升高，而GDC-0449組肝組織α-SMA表達(dá)顯著降低，提示GDC-0449可顯著抑制HSC的活化。肝纖維化進(jìn)展過程中，HSC活化后可分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，膠原沉積形成纖維間隔。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化進(jìn)展，CCl4/2-AAF組大鼠肝組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅳ表達(dá)明顯增多；而免疫組化結(jié)果顯示，GDC-0449組大鼠Col-Ⅳ表達(dá)降低。提示GDC-0449可顯著抑制肝纖維化大鼠肝組織HSC的活化及膠原沉積。

HPC是具有雙相分化潛能的干細(xì)胞，在肝損傷發(fā)生時(shí)，其可分化為肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞以修復(fù)受損的肝臟。然而，在肝損傷持續(xù)存在時(shí)，Hedgehog信號(hào)通路的持續(xù)激活可誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞之一的HPC增殖，抑制其凋亡，促使其向未成熟的上皮樣細(xì)胞分化，發(fā)生“膽管反應(yīng)”[19]，刺激膽管反應(yīng)細(xì)胞分泌各種促纖維化因子[20]，誘導(dǎo)肝纖維化進(jìn)展。膽管結(jié)扎后可上調(diào)肝內(nèi)Hedgehog配體表達(dá)，下調(diào)配體相互作用蛋白Hhip水平，激活Hedgehog通路，進(jìn)而誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管細(xì)胞異常增生發(fā)生膽管反應(yīng)，形成膽汁性肝纖維化[21]。而將表達(dá)Ptch受體的未成熟膽管細(xì)胞與HSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞均能產(chǎn)生Hedgehog配體[22]。本實(shí)驗(yàn)中，CCl4/2-AAF誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中高表達(dá)HPC標(biāo)志物Epcam和OV6、膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK19和CK7，免疫熒光共染顯示CCl4/2-AAF組肝組織中幾乎所有的CK19陽性細(xì)胞均表達(dá)OV6，提示CCl4/2-AAF誘導(dǎo)的大鼠模型中HPC增殖，且向膽管上皮細(xì)胞分化，發(fā)生膽管反應(yīng)；而GDC-0449顯著抑制了纖維化大鼠Epcam、CK19、CK7以及細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ccnd1的表達(dá)，且減少了共表達(dá)OV6和CK19的陽性細(xì)胞數(shù)，提示GDC-0449可顯著抑制CCl4/2-AAF肝纖維化大鼠HPC活化、增殖，并抑制其發(fā)生膽管反應(yīng)。

本研究表明，GDC-0449抑制Hedgehog信號(hào)通路活化后可顯著改善CCl4/2-AAF誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，且其作用機(jī)制與抑制HSC的活化、膠原沉積，阻抑HPC的活化增殖，并抑制其向膽管上皮細(xì)胞分化有關(guān)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：胡永紅參與課題設(shè)計(jì)，實(shí)施課題，撰寫論文；肖準(zhǔn)、付亞東、梁悅、張霖璋參與課題實(shí)施；劉偉參與數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計(jì)分析；慕永平、劉成海參與課題設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；劉平、陳佳美進(jìn)行課題設(shè)計(jì)，擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。