楊美萍,何江濤*,鄒 華,鄧 璐,張金剛

(1.中國地質大學(北京)水資源與環(huán)境學院，北京 100083;2.中國地質大學(北京)水資源與環(huán)境工程北京市重點實驗室，北京 100083)

0 引 言

近年來，環(huán)境中抗生素對反硝化過程的影響已被多項研究證實。Chen等研究指出諾氟沙星濃度從0 μg·L增加到100 μg·L時，硝酸鹽去除率從0.68 mg·L·h降低到0.44 mg·L·h；Ahmad等研究表明1.0 mg·L磺胺二甲嘧啶和金霉素對亞硝酸鹽的抑制率分別為82.0%和31.1%；D’Alessio等研究發(fā)現(xiàn)單獨使用莫能菌素或磺胺二甲嘧啶對亞硝酸鹽還原無影響，而莫能菌素、林可霉素和磺胺二甲嘧啶的聯(lián)合使用可通過抑制亞硝酸鹽的還原影響反硝化過程。根據(jù)這些研究可以看出，反硝化過程所受影響與抗生素的種類、濃度以及聯(lián)合使用息息相關。

此外，有研究指出抗生素的輸入方式也是重要的影響因素。例如，Yi等研究發(fā)現(xiàn)在厭氧和好氧環(huán)境交替條件下，一次性輸入2 mg·L環(huán)丙沙星對總氮去除無影響，而連續(xù)輸入可使其去除率減少15.6%，且有亞硝酸鹽積累的現(xiàn)象；Chen等研究表明一次性輸入磺胺甲惡唑的濃度越高，對反硝化活性影響越大，分階段連續(xù)輸入由低到高濃度的磺胺甲惡唑，在0.1 mg·L增加至2 mg·L時反硝化活性逐漸減弱，而2 mg·L增加至100 mg·L時反硝化活性有所恢復；Li等設計了連續(xù)6個周期更換上清液以及輸入10 mg·L鹽酸金霉素的實驗，結果表明硝酸鹽去除率不受影響，但去除速率降低了67.0%；姚曉婧研究發(fā)現(xiàn)，在與文獻[6]相同的實驗條件下，連續(xù)輸入1 mg·L鹽酸金霉素可使硝酸鹽去除率降低了27.78%，明顯抑制了反硝化過程。在上述這些研究中多采用模擬實驗的方式，環(huán)境中抗生素的輸入方式主要有一次輸入、間斷輸入和連續(xù)輸入，在一定程度上可分別反映含抗生素等污水和廢水一次性、分批次進入環(huán)境介質，或者畜牧養(yǎng)殖場、污水處理廠等場地長期連續(xù)排放到水環(huán)境和土壤環(huán)境中等情景。從已有的研究結果來看，抗生素輸入方式對反硝化過程有明顯影響，但是缺少抗生素總量相同時，不同輸入方式對反硝化過程影響的對比研究。此外，鹽酸洛美沙星(Lomefloxacin Hydrochloride,LOM)污染很常見，在水環(huán)境和城市污水處理廠中抗生素的檢出濃度多集中在每升納克級到微克級之間，醫(yī)療相關的水環(huán)境中可檢測到濃度高于每升毫克級的抗生素。因此，進一步探討不同濃度抗生素在總量相同、輸入方式不同時的影響，對揭示水土環(huán)境中不同抗生素污染情景具有重要的實際意義。

基于此，本文選取典型抗生素LOM，分別以一次輸入和兩次輸入兩種方式開展批實驗，探究水環(huán)境和醫(yī)療廢水環(huán)境濃度(200 ng·L和2 mg·L)條件下LOM對反硝化過程的不同影響，并從微生物響應方面探究其影響機制，以期為水土環(huán)境中不同污染模式下抗生素對反硝化過程產(chǎn)生的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 抗生素的選擇

Zou等研究表明，氟喹諾酮類抗生素LOM在低濃度條件下對(假單胞菌屬)、(寡養(yǎng)單胞菌屬)和(無色桿菌屬)占主導的反硝化細菌有較強的抑制作用，其抗菌機制是抑制核酸的轉錄和復制，影響細胞活性和酶的合成，具有抗菌譜廣、作用強、高效等特點，溶解度為27.2 mg·mL。因此，本實驗選取第三代氟喹諾酮類抗生素LOM作為典型抗生素。實驗所用LOM購置于上海麥克林生化科技有限公司，其純度高于98%。

1.1.2 碳源的選擇

納米乳化油是一種新型綠色緩釋液態(tài)碳源，具有廉價、無毒、緩釋和長效等特性。在以往抗生素對反硝化過程影響的研究中，納米乳化油在維持穩(wěn)定的反硝化條件以及多個實驗周期順利進行等方面取得了良好的效果。因此，本研究同樣選擇納米乳化油作為碳源，以營造穩(wěn)定的反硝化環(huán)境。

1.1.3 反硝化菌的選擇

水環(huán)境中有多種反硝化菌，為保證實驗更貼合真實的水環(huán)境狀況，選擇上海甘度環(huán)境工程有限公司提供的菌種。該菌種提取于自然環(huán)境中的混合反硝化菌，主要是由假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、科奈瑟菌科、紅螺菌科、芽孢桿菌科、纖維粘菌科等組成的反硝化菌群，對總氮的去除效率大于90%，適應溫度為10 ℃～60 ℃，pH值為6～9。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

本研究共設計5組實驗，每組包含3個平行對照，以保證實驗結果的準確性。每個反應體系裝有1 L的反應溶液，反應溶液含有常規(guī)組分NaHCO(質量為0.208 0 g)、NaSO(0.073 9 g)、NaCl(0.041 1 g)和污染組分KNO(0.360 9 g)。溶液pH值調節(jié)至7.1±0.1，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌和氬氣吹掃20 min后，加入0.75 g反硝化菌劑和3 mL納米乳化油密封，最后利用錫箔紙包裹反應容器，為反硝化菌提供避光環(huán)境以及防止抗生素的光解。

表1 各反應體系LOM濃度和投加方式Table 1 Concentrations and Adding Methods of LOM in Each Reaction System

1.2.2 實驗裝置

模擬實驗裝置如圖1所示。其中，反應容器為1.5 L的廣口瓶，裝有1 L反應溶液；用套針和探針式溫度計穿透的橡膠塞密封，套針用于取樣，溫度計用于監(jiān)測反硝化環(huán)境的溫度。

圖1 實驗裝置示意圖Fig.1 View of Experimental Setup

1.3 分析方法

表2 PCR引物序列Table 2 Sequences of Primers in PCR Conductions

2 結果分析與討論

2.1 常規(guī)指標及氮素濃度的變化

各反應體系的常規(guī)指標溫度()、pH值和總有機碳平均值如表3所示。溫度和pH值會影響微生物的反硝化速率。當<15 ℃，pH值小于6.5或大于9時，反硝化速率會下降。實驗兩個階段內溫度在20.50 ℃～20.90 ℃之間波動，pH值在7.57～8.18之間波動，均屬于正常的反硝化環(huán)境。總有機碳可反映反硝化菌維持正常生命活動所需碳源是否充足，實驗周期內總有機碳平均值為164.89～286.38 mg·L，變化范圍較大。其原因是微生物的利用和定期取樣使納米乳化油含量逐漸減少，但各反應體系總有機碳均大于115 mg·L，滿足反硝化過程所需碳源，其不會成為制約反硝化過程的因素。

表3 各反應體系溫度、pH值和總有機碳平均值Table 3 Average Values of Temperature,pH and TOC of Each Reaction System

表4 各反應體系去除率和抑制率Table 4 Removal and Inhibition Rates of in Each Reaction System

馴化階段的Ⅴ周期也是正式實驗階段的空白周期；Ⅰ～Ⅳ誤差棒表示15個平行樣之間標準差，Ⅴ～Ⅷ誤差棒表示3個平行樣之間標準差圖2 Ⅰ～Ⅷ周期和濃度變化Fig.2 Concentration Variations of and in Ⅰ-Ⅷ Cycles

2.2 反硝化動力學特征

反硝化過程硝酸鹽的還原符合一級動力學模型和Monod動力學模型。本文對各反應體系進行動力學擬合，以期獲取擬合參數(shù)來進一步說明LOM對反硝化過程的影響。

2.2.1 一級動力學模型

圖3 Ⅴ～Ⅷ周期各反應體系還原一級動力學曲線Fig.3 First-order Kinetic Plots of Concentrations for Each Reaction System in Ⅴ-Ⅷ Cycles

2.2.2 Monod動力學模型

表還原一級動力學擬合方程及參數(shù)Table 5 First-order Kinetic Fitting Equation and Parameters of Concentration

表6 各反應體系最大還原速率隨周期變化Table 6 Variation of Vmax with Cycle for Each Reaction System

2.3 微生物數(shù)量和活性

誤差棒表示各周期OD600值或OD490值標準差圖4 Ⅴ～Ⅷ周期各反應體系OD600和OD490平均值柱狀圖Fig.4 Histograms of Average Values of OD600 and OD490 for Each Reaction System in Ⅴ-Ⅷ Cycles

投加抗生素后微生物數(shù)量和活性的變化可以反映抗生素對反硝化過程的影響。細菌數(shù)量用菌懸液在600 nm波長處測定的吸光度表征，吸光度越大，細菌數(shù)量越多；細菌活性用LDH釋放試劑和LDH檢測工作液孵育后的菌懸液在490 nm波長處測得的吸光度表征，LDH釋放也被看做細胞膜完整性的重要指標，吸光度越大，具有活性的細胞數(shù)量越多。Ⅴ～Ⅷ周期各體系OD和OD平均值如圖4所示。各反應體系實驗周期的細菌數(shù)量和活性均小于空白周期，且隨周期的進行逐漸減小。分析其原因為LOM導致了DNA斷裂、細胞死亡和細胞膜破裂，使細菌數(shù)量和活性均減小，進而抑制了反硝化過程。

圖5 各反應體系的OD600和OD490抑制率及其相關性Fig.5 Inhibition Rates of OD600 and OD490 for Each Reaction System and Their Correlation

2.4 微生物的豐富度、多樣性和群落結構

表7 微生物群落Alpha多樣性指數(shù)Table 7 Alpha Diversity Indexes of Microbial Community

為進一步說明微生物受LOM不同輸入方式的影響，對各樣本物種豐度進行聚類分析，結果如圖6所示。圖6右側揭示了屬層面相對豐度較大的20種菌屬，左側是對各樣本進行聚類而建立的聚類樹。各反應體系的6種主導菌屬中，、(蒼白桿菌屬)、(無色桿菌屬)、(固氮螺菌屬)、(鞘氨醇桿菌屬)和(腸桿菌屬)均為水環(huán)境中典型的反硝化菌屬，具有較強的反硝化作用。投加抗生素后的Ⅷ周期，各反應體系主導菌屬的豐度發(fā)生變化。其中，#1體系Ⅷ周期末的主導菌屬豐度減小，豐度增大；#2和#5體系在Ⅷ周期末分別增加了11.1%和9.57%，這兩組體系抗性基因豐度大，微生物對抗生素有一定抵抗力，高濃度體系中部分微生物大量死亡使豐度增加；#3體系的主導菌屬和變化較小；#4體系的逐漸被取代。由聚類結果可以看出，含LOM體系與不含LOM體系的物種豐度有一定差異，而同一體系的物種豐度在Ⅶ周期和Ⅷ周期趨于聚類，相似度較高，沒有顯著性差異(>0.05)，表明Ⅷ周期末不能體現(xiàn)微生物群落結構變化受輸入方式的影響，這可能與群落結構的響應滯后于細菌數(shù)量和活性有關。

圖6 各樣本物種相對豐度聚類圖Fig.6 Cluster Diagram of Species Relative Abundance of Each Sample

2.5 抗性基因及其潛在宿主

抗性基因與內參基因比值單位為copies/16SrRNA;圖(b)中,**表示p<0.01，*表示p<0.05圖7 抗性基因聚類熱圖及其與細菌菌屬的Person相關性聚類熱圖Fig.7 Cluster Heatmaps of ARGs and Person Correlation Between ARGs and Bacterial Genera

細菌耐藥性是對試圖阻止其生長的外界條件的自然適應。微生物處理含抗生素污水往往會產(chǎn)生抗性基因(ARGs)，并通過外排抗生素、修飾抗生素作用靶點、保護細胞核糖體和使抗生素失活等方式來減少抗生素對微生物的毒害作用，并使微生物保持正常的脫氮能力。本研究檢測了反硝化菌的6種氟喹諾酮類抗性基因(、、、、和)，抗性基因聚類熱圖以及抗性基因與細菌菌屬Person相關性聚類熱圖如圖7所示。在6種抗性基因中，豐度最高，在#2體系內有較高豐度，其他抗性基因豐度均小于0.01 copies/16SrRNA，可忽略不計。由各樣本抗性基因聚類樹可知，不同反應體系抗性基因豐度變化不同，進一步進行顯著性差異分析表明：各反應體系在Ⅶ周期末到Ⅷ周期末的抗性基因豐度變化不受抗生素輸入方式影響(>0.05)，這可能與抗性基因的響應具有滯后性有關。此外，抗性基因與細菌菌屬的Person相關性顯示，、和菌屬分別為抗性基因、和的潛在宿主，在#2和#5體系中豐度較大。分析其原因為投加LOM后，的潛在宿主豐度增加并形成優(yōu)勢種群，使微生物攜帶的抗性基因增多，但可能是由于具有低抗性或微生物大量死亡，反硝化過程仍受到了不同程度的抑制作用。

本文研究結果表明高濃度抗生素一次性輸入在短期內對反硝化過程的影響不容忽視，這為水土環(huán)境中抗生素不同污染模式下對反硝化過程產(chǎn)生的影響提供參考，但由于實驗周期較短，長期以不同輸入方式輸入抗生素對反硝化過程以及群落結構與抗性基因的影響尚不清楚，有待進一步研究。

3 結 語