張晨晨，曾令霜，張 敬，徐 彬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 江蘇 南京 210095）

多年生黑麥草(Lolium perenne)為冷季型禾草，廣泛分布于全球溫帶地區(qū)[1]，是一種重要的經(jīng)濟(jì)草種[2]。作為草坪草，多年生黑麥草具有分蘗能力強(qiáng)、耐貧瘠、耐踐踏和耐修剪特性，是秋冬季交播的草坪先鋒草種[3]，被廣泛用于家庭草坪、高爾夫球場、城市景觀和其他運(yùn)動場地[4-5]。作為牧草，多年生黑麥草具有較高的產(chǎn)量和營養(yǎng)價值[6]，是我國南方中高海拔丘陵地區(qū)建植多年生栽培草地的重要草種[7]。近年來，科研單位和企業(yè)不斷從國外引入多年生黑麥草新品種和種質(zhì)資源，但多年生黑麥草種質(zhì)資源的性狀描述不清，親緣關(guān)系和種群結(jié)構(gòu)等信息較為模糊，制約了多年生黑麥草育種工作的開展。

種質(zhì)資源是植物種質(zhì)創(chuàng)新及利用的物質(zhì)基礎(chǔ)與前提，種質(zhì)資源的豐富程度直接影響品種改良和新品種培育[8]。對多年生黑麥草種質(zhì)物候期和形態(tài)性狀的評價和歸類，是多年生黑麥草種質(zhì)篩選和鑒定的基礎(chǔ)，也是分析其種質(zhì)遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)的重要手段。盡管鑒定多年生黑麥草種質(zhì)遺傳多樣性的分子標(biāo)記技術(shù)已較為成熟[9-11]，但是基于物候期和形態(tài)性狀的測定和比較仍然是種質(zhì)資源利用研究的重要方法和依據(jù)[12]，對篩選適應(yīng)我國環(huán)境特點的多年生黑麥草種質(zhì)及新品種培育具有十分重要的意義。

本試驗以南京地區(qū)種植的89 份國外引進(jìn)及10 份自主選育的多年生黑麥草種質(zhì)為材料，連續(xù)3 年觀察其物候期及形態(tài)性狀特征，通過主成分分析及其構(gòu)建的函數(shù)評價模型得分進(jìn)行綜合評價[13-14]，并采用聚類分析方法對種質(zhì)進(jìn)行分類比較[15]，以期探究多年生黑麥草種質(zhì)間的形態(tài)性狀差異，為多年生黑麥草遺傳資源的鑒定、篩選優(yōu)良種質(zhì)資源和新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料共計99 份多年生黑麥草種質(zhì)，其中89 份為國外引進(jìn)的多年生黑麥草種質(zhì)(https://www.ars-grin.gov)，其余10 份為自主選育材料(表1)。

表1 供試多年生黑麥草種質(zhì)材料來源Table 1 Source of perennial ryegrass germplasm used in this study

續(xù)表1Table 1 (Continued)

1.2 試驗方法

大田試驗分別于2018-2019 年和2019-2020年開展，供試種質(zhì)的種子分別于2018 年10 月11 日和2019 年10 月17 日播種于裝有營養(yǎng)土[泥炭土 :蛭石 : 沙 = 3 : 1 : 1 (V : V : V)]的育苗盤中發(fā)芽，待幼苗長至3～4 葉期后移栽至位于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的南京六合基地(118°37′ E，32°29′ N)和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溧水白馬基地(119°19′ E，31°62′ N)。兩基地均屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，試驗地土壤為黃棕壤，土壤肥力中等[16]。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)置，小區(qū)面積為1 m2，3 次重復(fù)，每小區(qū)內(nèi)均勻種植9 株多年生黑麥草，隨后整個生育期內(nèi)進(jìn)行正常的水肥管理，人工除草。

1.3 測定指標(biāo)

參照《黑麥草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[17]，在2018-2020 年觀測及記錄多年生黑麥草各生長發(fā)育節(jié)點物候期及8 個形態(tài)指標(biāo)。物候期包括播種期、出苗期、分蘗期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、開花期、乳熟期、蠟熟期、完熟期，均以50%植株進(jìn)入該生育期為準(zhǔn)，計算生育天數(shù)。形態(tài)指標(biāo)包括小穗數(shù)、旗葉長、倒二葉長、旗葉寬、倒二葉寬、莖粗、第一節(jié)間長和株高(營養(yǎng)枝的最高高度)，在開花期后每株取5 個具有花序的分蘗(生殖枝)進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2013 統(tǒng)計物候期和形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行形態(tài)性狀的主成分分析及聚類分析[18]；將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行離差標(biāo)準(zhǔn)化，使結(jié)果映射到[0, 1]區(qū)間后進(jìn)行主成分分析，參考南銘等[18]和雷雄等[19]的方法，在主成分因子得分基礎(chǔ)上，構(gòu)建出以主成分特征向量為系數(shù)的綜合評價函數(shù)式進(jìn)行綜合評價，采用Ward 離差平方和法聚類分析[18]，以歐氏距離繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多年生黑麥草種質(zhì)關(guān)鍵生育期差異

根據(jù)兩年秋季播種的大田試驗結(jié)果，在江蘇南京地區(qū)，99 份多年生黑麥草種質(zhì)關(guān)鍵生育期存在較大差異(表2)。其中，不同種質(zhì)的早期發(fā)育差異大，從播種至出苗所需時間(出苗期)和達(dá)到分蘗所需時間(分蘗期)的差異較大，變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)分別達(dá)17.06%和20.63%；而不同種質(zhì)的結(jié)種期差異最小，種子達(dá)到完熟期的CV 僅3.62%。

表2 多年生黑麥草種質(zhì)資源的物候期分析Table 2 Phenological analysis of perennial ryegrass germplasm resources

各種質(zhì)在播種7～18 d 后陸續(xù)出苗，其中PI 198958、PI 578758 和PI 403913 出 苗 較快，在播 種7 d 后出苗，而PI 601287、PI 619033 和PI 611036種質(zhì)出苗慢，播種后需18 d 出苗。各供試種質(zhì)進(jìn)入分蘗期所需時間差異大，自主選育的材料R2-4、R2-12 和R2-9 從出苗至分蘗僅歷時8 d，而PI 601287、PI 619033 和PI 611036 需歷時24 d。

在南京地區(qū)秋播多年生黑麥草，各種質(zhì)于次年4 月初先后進(jìn)入拔節(jié)期，4 月底開始進(jìn)入孕穗期，7～12 d 后進(jìn)入抽穗期，5 月初相繼進(jìn)入開花期。各種質(zhì)在開花期前各發(fā)育階段仍存在較大差異，CV在6.17%以上；但種質(zhì)間達(dá)到種子完熟期的差異較小，在7 月上旬相繼達(dá)到種子完熟期。其中PI 227020和PI 287853 種質(zhì)較早進(jìn)入生殖生長階段，抽穗、開花和種子結(jié)實均較早，播種后需252.0 d即達(dá)到種子完熟期(種子收獲期)；而PI 619033 和PI 601287 種質(zhì)較晚進(jìn)入生殖生長階段，播種后約310.0 d 才能收獲種子。

2.2 多年生黑麥草種質(zhì)的形態(tài)學(xué)差異

各形態(tài)性狀指標(biāo)兩年觀測值基本一致，2019 年平均旗葉寬及第一節(jié)間長較2020 年平均旗葉寬及第一節(jié)間長稍大，其他指標(biāo)均較2020 年小(表3)。總體來看，8 個形態(tài)性狀在供試種質(zhì)間差異明顯，各供試多年生黑麥草種質(zhì)間各形態(tài)性狀均存在顯著差異(P＜ 0.05)，變異較為豐富，變異系數(shù)在22.63%～44.11%，其中倒二葉長的變異系數(shù)最大，高達(dá)44.11%(2019 年)和40.94% (2020 年)，小穗數(shù)變異系數(shù)最小，為24.86% (2019 年)和22.63% (2020 年)，除小穗數(shù)外，其他指標(biāo)性狀的變異系數(shù)均大于27%。各形態(tài)指標(biāo)變異系數(shù)從大到小依次為倒二葉長 ＞ 旗葉長 ＞ 倒二葉寬 ＞ 第一節(jié)間長 ＞ 莖粗 ＞ 旗葉寬 ＞ 株高 ＞ 小穗數(shù)。

表3 2019 年和2020 年多年生黑麥草種質(zhì)主要形態(tài)性狀差異分析Table 3 Analysis of main phenotypic traits of perennial ryegrass germplasms in 2019 and 2020

2.3 基于形態(tài)指標(biāo)的多年生黑麥草種質(zhì)聚類分析

以上述8 個形態(tài)學(xué)指標(biāo)的兩年均值為依據(jù)，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行離差標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類分析。在歐氏距離為8.5 時，99 份種質(zhì)材料被分為4 個類群(圖1)。第Ⅰ類包括W6 20468、PI 593651、PI 601287、PI 632542和PI 265340 等25 份種質(zhì)，占整個種質(zhì)群的25.3%；第Ⅱ類包括PI 618999、PI 287851 和PI 619474 等12 份種質(zhì)，占整個種質(zhì)群的12.1%；第Ⅲ類包括PI 311447、PI 610920、PI 403863 等46 份種質(zhì)，占整個種質(zhì)群的46.5%；第Ⅳ類共16 份種質(zhì)材料，包括除R2-9 外的9份自主選育的種質(zhì)及PI 598839、PI 577273 和PI 610958等國外引進(jìn)的7 份種質(zhì)，占整個種質(zhì)群的16.2%。

圖1 基于8 個形態(tài)性狀特征的多年生黑麥草種質(zhì)聚類圖Figure 1 Dendrogram of perennial ryegrass germplasm based on eight phenotypic trait

對4 個類群的形態(tài)性狀進(jìn)行歸元統(tǒng)計和多重比較，第Ⅰ類種質(zhì)中小穗數(shù)、旗葉長、倒二葉長、莖粗、旗葉寬及倒二葉寬均最高，其中小穗數(shù)達(dá)24.18 個，倒二葉長達(dá)18.89 cm，莖粗為2.13 mm，表明其生長較為旺盛，植株粗壯且較為高大，適宜作為牧草育種材料；第Ⅱ類和第Ⅲ類種質(zhì)性狀表現(xiàn)則較為居中，小穗數(shù)在20.12 個，莖粗1.70 mm；第Ⅳ類種質(zhì)中株高最低(4.28 cm)，莖粗最細(xì)(1.30 mm)，旗葉和倒二葉長最短，分別為5.47 和6.31 cm，綜合來看，此類群種質(zhì)植株低矮，葉片細(xì)小，具有優(yōu)良的草坪草特性(表4)。

表4 供試種質(zhì)不同類群間形態(tài)性狀比較Table 4 Comparison of phenotypic traits among four types of test germplasms

2.4 多年生黑麥草種質(zhì)形態(tài)指標(biāo)的主成分分析及綜合評價

對上述8 個形態(tài)學(xué)指標(biāo)的兩年均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，根據(jù)主成分分析，得出4 個主成分因子，可代表原有指標(biāo)87.2%的信息量，各因子的權(quán)重系數(shù)分別為0.597、0.160、0.106 和0.074，根據(jù)主成分分析法，進(jìn)一步評價99 份多年生黑麥草種質(zhì)。各種質(zhì)資源的綜合形態(tài)指標(biāo)得分(表5)顯示，綜合得分較高的5 份種質(zhì)是W6 20468、PI 593651、PI 632542、PI 601287 和PI 265340，表明這5 份種質(zhì)植株高大、葉片寬闊，可以作為優(yōu)良的牧草型多年生黑麥草育種材料；而R2-12、PI 610958、PI 577273、R2-3 和PI 598839 5 份種質(zhì)的形態(tài)指標(biāo)綜合得分較低，是優(yōu)良的草坪型種質(zhì)。

表5 供試種質(zhì)的綜合得分Table 5 Factor scores of test germplasms

3 討論

種質(zhì)資源是育種工作的基礎(chǔ)，而分析種質(zhì)資源的遺傳背景是植物育種突破的關(guān)鍵[20]。本研究通過連續(xù)兩年觀測發(fā)現(xiàn)，供試種質(zhì)的物候期及其形態(tài)性狀均存在明顯的差異，且所有性狀的變異系數(shù)值均高于20%，說明多年生黑麥草種質(zhì)資源相對豐富，具有豐富的遺傳多樣性，適合品種篩選[21]，新品種培育及改良的發(fā)展?jié)摿^大。PI 593651 和W6 20468種質(zhì)的植株高大且粗壯，適宜作為牧草育種材料，而自主選育R2-3、R2-6 和R2-10 等種質(zhì)葉片細(xì)小，植株低矮，具有優(yōu)良的草坪草特性，為進(jìn)一步開展育種工作奠定了基礎(chǔ)。

根據(jù)多年生黑麥草種質(zhì)的8 個形態(tài)性狀，99 份多年生黑麥草種質(zhì)被聚為4 類，第Ⅰ類評分較高，為牧草型種質(zhì)材料，第Ⅳ類評分較低，為草坪型種質(zhì)材料。第Ⅰ類牧草型種質(zhì)資源多為美國的選育品種，它們的植株高大、粗壯，其旗葉長、倒二葉長、旗葉寬、莖粗及倒二葉寬等指標(biāo)數(shù)值均較高，而第Ⅳ類草坪型種質(zhì)材料的植株矮小及葉片細(xì)小，尤其是自主選育群體，除了株高、旗葉長、倒二葉長、旗葉寬、莖粗及倒二葉寬均最小外，其出苗期(10.6 d)及分蘗期(18.9 d)均早于牧草型種質(zhì)(第Ⅰ類)的出苗期(12.0 d)及分蘗期(24.6 d)，但整個生育期(288.9 d)卻晚于牧草型種質(zhì)(278.8 d)，這表明第Ⅳ類種質(zhì)還具有成坪快、生長持續(xù)時間長的優(yōu)良草坪特性。此外，第Ⅰ類群中PI 632 542，其株高中等、小穗數(shù)最高，生殖生長旺盛，種子生產(chǎn)潛力較高。第Ⅳ類群中自主選育R2-3、R2-6 和R2-10 等種質(zhì)葉片細(xì)小，植株低矮，但小穗數(shù)較低，二者相互雜交可選育出植株低矮、葉片細(xì)小及種子生產(chǎn)潛力較高的品種，將作為未來的育種目標(biāo)之一。此外，聚類分析還表明，4 類多年生黑麥草群體中，來自同一區(qū)域甚至同一國家的種質(zhì)資源并沒有聚為一類，這與王建麗等[22]和姜慧新等[23]的研究結(jié)果一致，可能與多年生黑麥草種質(zhì)資源的相互交叉利用有關(guān)，說明地理來源并不是造成種質(zhì)資源遺傳多樣性的唯一因素。

本研究供試種質(zhì)在南京地區(qū)均能完成整個生育期的生長，生育期范圍為252.0～310.0 d，均值為281.4 d，高于郭孝和陳二秋[24]、王向濤等[25]、王同軍等[26]分別針對多年生黑麥草在中原地區(qū)、西藏及低緯度高海拔地區(qū)等地域的生育期(105～292 d)，這可能是由于本研究播種期在秋季(10 月中旬)，造成部分種質(zhì)出苗較慢，影響后續(xù)發(fā)育進(jìn)程。秋播是長江流域以南地區(qū)的多年生黑麥草作為草坪或牧草生產(chǎn)利用的主要方式，因此本研究采用秋播，評價結(jié)果對實際生產(chǎn)和育種工作具有一定借鑒價值。

本研究僅針對多年生黑麥草種質(zhì)資源的主要形態(tài)性狀進(jìn)行了分析評價，有關(guān)多年生黑麥草種質(zhì)的牧草品質(zhì)性狀、抗逆性以及分子水平上的研究還有待深入。本研究在南京地區(qū)開展，年份間的各指標(biāo)數(shù)據(jù)差異不顯著。但由于形態(tài)學(xué)標(biāo)記易受環(huán)境條件影響，故今后的研究中，可增加多地點試驗。

4 結(jié)論

通過兩年田間試驗記錄并分析供試的99 份多年生黑麥草種質(zhì)形態(tài)表型，結(jié)果表明，各種質(zhì)形態(tài)性狀上差異顯著，基于主成分分析的綜合得分較高和較低的種質(zhì)，通過聚類分析將99 份種質(zhì)資源分為4 類，各種質(zhì)類群間形態(tài)性狀差異明顯，種質(zhì)類群Ⅰ具有優(yōu)良的牧草特性，種質(zhì)類群Ⅳ具有優(yōu)良的草坪草特性。