李 娜，寧程程，郭 蘊(yùn)，季春輝，王立霞，張亞萍，孟慶玲，喬 軍，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.中國(guó)獸藥監(jiān)察所，北京 100081)

沙門菌被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)確定為引起重大疾病和死亡的食源性病原體[1]。沙門菌在自然界中分布廣泛，可感染人類、家畜和家禽，引起人類腸炎和畜禽、犬、貓及試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生副傷寒；同時(shí)還可導(dǎo)致在牛、羊和馬流產(chǎn)及急性胃腸炎，具有較強(qiáng)的致病性。對(duì)于老人、兒童以及有免疫缺陷的人還會(huì)造成生命危險(xiǎn)[2]。抗生素的長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致沙門菌引起的感染日趨嚴(yán)重，對(duì)全球公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅[3-4]。因此，深入研究沙門菌侵染和致病的分子機(jī)制，對(duì)于該病的科學(xué)防控及公共衛(wèi)生安全具有重要的意義。

細(xì)菌非編碼小RNA(sRNAs)是細(xì)菌的一種重要調(diào)控分子，通常位于基因間隔區(qū)(IGRs)中，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用[5-6]。細(xì)菌sRNAs在不同的環(huán)境中廣泛表達(dá)，可調(diào)節(jié)包括鐵穩(wěn)態(tài)、外膜蛋白的生物合成、群體感應(yīng)和毒力等多種生命活動(dòng)過(guò)程[7-8]。近年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，已在沙門菌 SL1344株的基因組中發(fā)現(xiàn)并鑒定了280種sRNAs[9]，然而其大部分sRNAs的生物學(xué)特性暫不清楚，Srikumar等[10]研究發(fā)現(xiàn)，sRNASTnc1220在沙門菌感染巨噬細(xì)胞時(shí)該基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，推測(cè)STnc1220可能與沙門菌侵染及環(huán)境應(yīng)激相關(guān)。然而，至今sRNASTnc1220生物學(xué)功能尚不清楚。

本研究通過(guò)克隆STnc1220基因，分析其分子特征，并利用λ-Red重組技術(shù)對(duì)sRNASTnc1220進(jìn)行基因缺失株的構(gòu)建，比較缺失株與親本株之間生物學(xué)特性的差異，旨在為揭示sRNASTnc1220在沙門菌環(huán)境應(yīng)激和毒力的調(diào)控作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

鼠傷寒沙門菌SL1344標(biāo)準(zhǔn)毒株、大腸桿菌(E.coli)DH5α、RAW264.7細(xì)胞、質(zhì)粒 pKD46、pKD3、pCP20和PBR322 均由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)動(dòng)物均為6周齡BALB/c小鼠(雌雄各半)，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)。PCR Mix、DNA Marker，pMD19-T載體和T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)布的沙門菌 SL1344株基因組序列(登錄號(hào)：FQ312003.1)，使用DNAStar軟件設(shè)計(jì)引物。P1/P2用于sRNASTnc1220擴(kuò)增及缺失驗(yàn)證，P3/P4引物用于擴(kuò)增打靶片段，其5′端含有50 bp部分與sRNASTnc1220基因序列同源，3′端與氯霉素抗性基因cat(來(lái)源于質(zhì)粒pKD3)同源。引物均由北京華大生物公司合成(表 1)。

表1 PCR擴(kuò)增所需引物Tab.1 Primers required for PCR amplification

1.3 沙門菌 STnc1220基因擴(kuò)增及分子特征分析

提取SL1344基因組并作為模板，P1/P2為引物PCR擴(kuò)增出沙門菌非編碼sRNASTnc1220。PCR反應(yīng)體系：PCR Mixture 10 μL，H2O 7 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物各 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃保存。對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收，與pMD19-T載體經(jīng)16 ℃過(guò)夜連接，篩選陽(yáng)性單菌落并送測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行啟動(dòng)子序列分析。利用RNAtarget 2在線軟件(http：//RNA.informatik.uni-freiburg.de/)進(jìn)行STnc1220所調(diào)控靶基因的預(yù)測(cè)。

1.4 沙門菌 STnc1220基因缺失株的構(gòu)建

提取pKD3質(zhì)粒并作為模板，P3/P4為引物PCR擴(kuò)增出含有STnc1220基因上、下游同源臂的打靶片段，進(jìn)行重疊融合PCR(SOE-PCR)擴(kuò)增。將目的基因進(jìn)行回收和測(cè)序。制備SL1344感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)入pKD46質(zhì)粒，然后將擴(kuò)增出的打靶片段電轉(zhuǎn)入SL1344-pKD46 感受態(tài)細(xì)胞，用含有 Amp 和 Cm 抗性的 LB 平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(ΔSTnc1220∷cat)進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入ΔSTnc1220∷cat感受態(tài)細(xì)胞中(已消除pKD46質(zhì)粒)，用含有氨芐抗性的LB平板進(jìn)行篩選，獲得缺失株ΔSTnc1220。

1.5 STnc1220基因缺失對(duì)沙門菌生長(zhǎng)及生化特性的影響

將3株菌在LB液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)至50代，選取第10，20，30，40，50代細(xì)菌，用STnc1220基因內(nèi)部引物P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定其是否具備遺傳穩(wěn)定性。參照文獻(xiàn)[11]的方法，分別將3株菌接種BHI培養(yǎng)基中，將過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶100轉(zhuǎn)接新BHI，37 ℃同步振搖培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定菌液OD600繪制各菌株生長(zhǎng)曲線。挑取3株菌的單菌落至木糖、棉子糖、葡萄糖、氰化鉀、枸櫞酸鈉、硫化氫等生化鑒定管，放置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)靜置培養(yǎng)18～24 h，按操作說(shuō)明書觀察其生化特性。

1.6 STnc1220基因缺失對(duì)沙門菌生物被膜形成的影響

將親本株和缺失株過(guò)夜培養(yǎng)次日轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液OD600≈0.2，以每孔200 μL加入96孔微孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。按照參考文獻(xiàn)[12]方法，將菌液吸出后用200 μL去離子水清洗3次，室溫晾30 min后每孔加入1%結(jié)晶紫100 μL染色45 min，PBS清洗3次；將96孔微孔板置于室溫自然晾干，加入95%的乙醇進(jìn)行脫色，酶標(biāo)儀測(cè)定其OD600。

1.7 STnc1220基因缺失對(duì)沙門菌環(huán)境應(yīng)激的影響

挑取親本株和缺失株的單菌落于BHI培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)12 h，以1∶100比例分別轉(zhuǎn)接于pH=4.8、pH=9、4% NaCl、2 mmol/L的H2O2、3.8%乙醇的新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，調(diào)整其初始OD600相同時(shí)，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取樣測(cè)OD600值并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.8 STnc1220基因缺失對(duì)沙門菌細(xì)胞黏附和侵襲能力的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗滌3次后用DMEM重懸備用，用預(yù)冷無(wú)菌 PBS將新鮮培養(yǎng)的親本株和缺失株洗滌后調(diào)整OD600為0.5后置于冰上。參考文獻(xiàn)[13]的方法，菌液以感染復(fù)數(shù)MOI=10侵染細(xì)胞，分別進(jìn)行細(xì)胞黏附、侵襲試驗(yàn)，梯度稀釋，涂板計(jì)數(shù)。

1.9 STnc1220基因缺失對(duì)沙門菌致病力的影響

將沙門菌 SL1344、ΔSTnc1220培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，收集菌體并用預(yù)冷的無(wú)菌PBS洗滌3次，以無(wú)菌 PBS重懸菌體并進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋。分別以1.0×108，1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103cfu/mL的劑量腹腔感染 BALB/c小鼠，注射無(wú)菌PBS作為對(duì)照組，攻毒之后觀察10 d，記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，使用改良寇氏法計(jì)算每株菌的半數(shù)致死量LD50。分別對(duì)6周齡小鼠注射1.0×104cfu/mL的親本株、缺失株進(jìn)行腹腔感染。取感染第5 天的小鼠處死后無(wú)菌收集它們的肝臟和脾臟，經(jīng)固定后制作成組織切片進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門菌 sRNA STnc1220基因擴(kuò)增及分子特征分析

以P1/P2引物擴(kuò)增出的片段大小為275 bp，測(cè)序結(jié)果顯示，其中sRNASTnc1220基因大小為73 bp，位于基因ssaK和ssaL之間。預(yù)測(cè)顯示在sRNASTnc1220的上游5′-UTR區(qū)域存在-10和-35區(qū)啟動(dòng)子核心序列。靶基因預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，sRNA的47—54位可與barA基因mRNA的5′-UTR端-50—-57位堿基互補(bǔ)配對(duì)(圖1)。

A.STM STnc1220基因克?。篗.DNA Marker DL2000；1.陰性對(duì)照；2.sRNA STnc1220基因。B.STM STnc1220基因的測(cè)序分析。C.sRNA STnc1220與靶基因barA的互補(bǔ)配對(duì)位置。A.STM STnc1220 gene clone：M.DNA Marker DL2000;1.Negative control;2.sRNA STnc1220 gene.B.Sequencing analysis of STM STnc1220 gene.C.Complementary pairing position of sRNA STnc1220 and target gene barA.

2.2 沙門菌 STnc1220基因缺失株的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

以pKD3質(zhì)粒為模板，P3/P4引物擴(kuò)增出的打靶片段為1 159 bp，與預(yù)期大小一致(圖2-A)。以P1/P2引物擴(kuò)增出的sRNASTnc1220、ΔSTnc1220∷cat、ΔSTnc1220片段大小分別為275 ，1 261，330 bp(圖2-B)。PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果證明缺失株ΔSTnc1220構(gòu)建成功。

A.STnc1220打靶片段：M.Marker DL2000；1.陰性對(duì)照；2.打靶片段。B.沙門菌ΔSTnc1220的鑒定：M.Marker DL2000；1.陰性對(duì)照；2.sRNA STnc1220基因；3.ΔSTnc1220∷cat擴(kuò)增產(chǎn)物；4.ΔSTnc1220基因擴(kuò)增產(chǎn)物。A.STnc1220 targeting fragment：M.Marker DL2000；1.Negative control；2.Targeting fragment.B.Identification of STM ΔSTnc1220:M.Marker DL2000；1.Negative control；2.sRNA STnc1220 gene；3. ΔSTnc1220∷cat amplification product；4.ΔSTnc1220 gene amplification product.

2.3 沙門菌 STnc1220基因缺失株生長(zhǎng)與生化特性分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，連續(xù)傳代的第10，20，30，40，50代的細(xì)菌，其凝膠電泳擴(kuò)增條帶大小一致，表明缺失株沙門菌ΔSTnc1220具有良好的遺傳穩(wěn)定性(圖3)。生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明，親本株和缺失株在37 ℃培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)速率基本相同，表明sRNASTnc1220基因缺失不影響鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)特性(圖4)。缺失株ΔSTnc1220和親本株的生化特性相同，證明sRNASTnc1220基因缺失不影響鼠傷寒沙門菌的生化特性。

圖3 ΔSTnc1220遺傳穩(wěn)定性PCR驗(yàn)證Fig.3 Identification genetically stable of ΔSTnc1220 by PCR

圖4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig.4 Growth curve measurement

2.4 STnc1220基因缺失對(duì)沙門菌生物被膜形成的影響

生物膜形成結(jié)果顯示，測(cè)得的野生株OD600為1.22，缺失株OD600為1.17，由此可知，野生株和缺失株生物膜形成能力差異不顯著(P>0.05)，表明缺失株沙門菌ΔSTnc1220不影響生物被膜的形成。

2.5 STnc 1220基因缺失對(duì)沙門菌環(huán)境應(yīng)激的影響

與親本株相比，缺失株在pH=4.8、pH=9和含有2 mmol/L 30% H2O2條件下差異性不顯著(P>0.05)；在4% NaCl的BHI液體培養(yǎng)基中，缺失株在7 h后生長(zhǎng)速率明顯高于親本株(P<0.05)； 在含有3.8%乙醇的條件下，缺失株在4～8 h的生長(zhǎng)顯著高于親本株(P<0.05)(圖5)。

不同小寫字母表示差異顯著( P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

2.6 STnc1220基因缺失對(duì)沙門菌細(xì)胞黏附和侵襲能力的影響

與親本株SL1344相比，缺失株ΔSTnc1220對(duì)細(xì)胞的侵襲率下降了88.66%；黏附率下降了62.76%，(圖6)，提示STnc1220缺失后沙門菌細(xì)胞黏附和侵襲能力極顯著降低(P<0.01)。

同組織間不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；不同組織間未做顯著性分析。Different capital letters in the same tissue showed significant differences(P<0.01)；There was no significantly different analysis between different tissues.

2.7 STnc 1220基因缺失對(duì)沙門菌致病力的影響

沙門菌 SL1344和ΔSTnc1220的LD50分別是6.46×104，1.48×105cfu/mL，但缺失株小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(表2、圖7)，表明缺失株沙門菌ΔSTnc1220毒力顯著低于親本株。解剖及觀察組織切片發(fā)現(xiàn)，與PBS對(duì)照組相比，SL1344和ΔSTnc1220均出現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化(圖8)。肝臟出現(xiàn)出血，邊緣明顯，組織學(xué)出現(xiàn)肝索排列不規(guī)則，竇狀隙擴(kuò)張，出現(xiàn)細(xì)胞核溶解，單核細(xì)胞浸潤(rùn)；脾臟明顯腫大，出現(xiàn)紅髓白髓界限模糊，紅髓充血、散在性出血，白髓變小，有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。與SL1344相比，ΔSTnc1220的組織病理學(xué)改變較輕，表明STnc1220基因缺失可降低沙門菌對(duì)小鼠器官的病理?yè)p傷能力。

表2 6周齡小鼠腹腔注射SL1344、ΔSTnc1220菌株后LD50的測(cè)定Tab.2 Determination of LD50 after intraperitoneal injection of SL1344 and ΔSTnc1220 strains in 6-week-old mice

圖7 不同菌株感染小鼠死亡生存曲線Fig.7 Death and survival curve of mice by intraperitoneal infected with different strains

圖8 SL1344、ΔSTnc1220感染小鼠臟器的病理學(xué)變化Fig.8 Pathological changes of organs in mice infected with SL1344 and ΔSTnc1220

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，sRNA可通過(guò)堿基配對(duì)與靶mRNA相互結(jié)合，通過(guò)多種方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)菌的物質(zhì)代謝、環(huán)境適應(yīng)性、毒力等多個(gè)生理過(guò)程[14]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA對(duì)靶基因mRNA的調(diào)控主要包括以下幾種：第一，sRNA與靶mRNA的結(jié)合，可增強(qiáng)靶基因mRNA穩(wěn)定性，防止Rnase E對(duì)靶基因mRNA的降解，發(fā)揮正調(diào)控作用[15]。其次，sRNA與靶mRNA的結(jié)合形成雙鏈后，可誘導(dǎo)Rnase Ⅲ的降解，對(duì)靶基因的表達(dá)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[16]。第三，sRNA與靶mRNA的結(jié)合，可打開靶基因mRNA遮蔽核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，有利于核糖體30S與RBS的結(jié)合，從而促進(jìn)靶蛋白的翻譯。此外，sRNA可與靶mRNA上的RBS結(jié)合，抑制核糖體30S與RBS的結(jié)合，從而抑制靶蛋白的翻譯[17]。Houserova等[14]研究鑒定了在沙門菌SL1344基因組中差異表達(dá)的475個(gè)sRNA，然而大部分sRNA 的生物學(xué)功能和致病性尚不清楚。Kim等[18]發(fā)現(xiàn)，sRNARaoN可抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，控制亞硝化氧化應(yīng)激抗性。Chien等[19]驗(yàn)證了在厭氧環(huán)境下，sRNAFnrS可以通過(guò)與其靶基因堿基配對(duì)來(lái)抑制 mRNAMetE+基因的表達(dá)。陳斌杰等[20]發(fā)現(xiàn)，sRNARyhB可增強(qiáng)沙門菌的侵襲力進(jìn)而調(diào)控沙門菌的毒力。Meng等[5]研究表明，sRNASTnc640可以調(diào)控腸炎沙門菌菌毛基因的表達(dá)，影響?zhàn)じ絹?lái)抑制沙門菌的毒力。由于沙門菌 sRNA對(duì)靶mRNA的調(diào)控方式具有明顯的多樣性，這可能也是沙門菌具有廣泛的感染譜(能在多種動(dòng)物體內(nèi)生存繁殖)和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力(耐酸和胞內(nèi)生存)的重要原因之一。

在細(xì)菌中，許多 sRNA可以直接感知多種環(huán)境信號(hào)[10]。本研究結(jié)果顯示，STnc1220的缺失后增強(qiáng)了對(duì)高滲、乙醇環(huán)境的適應(yīng)能力，表明 sRNASTnc1220在對(duì)外界應(yīng)激環(huán)境發(fā)揮了一定作用。同時(shí)，本研究通過(guò)RNAtarget 2軟件預(yù)測(cè)出 sRNASTnc1220的47—54位堿基可和barAmRNA的5′-UTR端-50—-57位堿基互補(bǔ)配對(duì)，提示STnc1220調(diào)控的靶基因?yàn)閎arA。有研究發(fā)現(xiàn)，barA是入侵基因表達(dá)和細(xì)菌穿透上皮細(xì)胞所需的磷酸化類型的傳感器激酶，與反應(yīng)調(diào)節(jié)分子SirA構(gòu)成了一個(gè)雙組分調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)SPI-1基因的表達(dá)以響應(yīng)未知的細(xì)胞外信號(hào)[21]。Fortune等[22]研究證實(shí)ΔbarA對(duì)細(xì)胞的侵襲能力與親本株相比顯著降低；Altier等[23]發(fā)現(xiàn)，barA的缺失對(duì)入侵基因表達(dá)的調(diào)控顯著降低。因此，本研究推測(cè)STnc1220可通過(guò)調(diào)控靶基因barA的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)菌的致病力，上述推測(cè)還需要通過(guò)進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

總之，本研究通過(guò)λ-Red方法構(gòu)建了沙門菌STnc1220基因缺失株ΔSTnc1220，驗(yàn)證了STM-ΔSTnc1220的部分生物學(xué)特性，證實(shí)STnc1220在沙門菌侵襲黏附細(xì)胞及致病力上發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。