孫晨皓，羅 婷，馬海東，程 佳，路宏朝，張 濤，曾文先

（陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001）

非人靈長類動物（non-human primates，NHPs）的基因組和生理結構最接近人類，且規(guī)避了倫理的限制［1］，使其在生物醫(yī)學和生命科學實驗中具有不可替代性。獼猴屬（Macaca）隸屬靈長目猴科，其下分為22個種，包括恒河猴（Macaca mulatta）、食蟹猴（Macaca fascicularis）和藏酋猴（Macaca thibetana）等［2］，目前常用的實驗猴主要為恒河猴和食蟹猴。我國是野生靈長類動物分布較為豐富的國家之一，獼猴屬動物的人工飼養(yǎng)也在迅速發(fā)展［3］；但近年來隨著生物制藥的熱度越來越高，以及在新冠病毒肆虐全球的嚴峻形勢下，全球制藥企業(yè)及科研機構對于非人靈長類實驗動物旺盛的需求導致實驗猴供應緊張。自然條件下獼猴屬動物性成熟年齡為3～4歲，孕期約6個月，自然妊娠率低，且基本上為一年一胎，恒河猴繁殖有較明顯的季節(jié)性，但食蟹猴繁殖不具有季節(jié)性［4-6］。獼猴屬動物種群數(shù)量很難滿足現(xiàn)在的市場需求，因此人工授精技術顯得尤為重要。人工授精（artificial insemination，AI）是較為簡單的輔助生殖技術，將新鮮精子、冷凍保存解凍后的精子或附睪精子轉移到雌性生殖道中。AI在包括人類在內(nèi)的許多哺乳動物繁殖中取得了成功，但在獼猴屬動物中應用較少，從側面反應出獼猴屬動物研究成本昂貴及其特殊性。為提高實驗動物的利用率和降低成本，可使用冷凍精子完成AI，精子冷凍保存也可以保存種質(zhì)資源，跨越時間和空間的限制，提供穩(wěn)定且質(zhì)量較好的精子，待需要時解凍精子。

1 精子的采集

人工授精技術的第一步是精子的采集。獼猴屬動物的采精方法有陰莖電刺激法（penile electrical stimulation method，PEM）［7-9］和直腸探頭電刺激法（rectal probe electrical stimulus method，REM）［10-13］等。相較于陰莖電刺激法，REM操作步驟較繁瑣，且電壓是否灼傷直腸不易觀察，同時有研究表明REM收集的精子樣本質(zhì)量不如PEM［14］，因此獼猴屬動物采集精子多使用PEM。

用于冷凍保存的精子樣本應滿足精子活力≥70%［15］，精子密度調(diào)整范圍5.0～10.0×107個／mL［16］。采精不宜過于頻繁，同一只公猴一周采集不應超過2次。電刺激法可能誘使公猴出現(xiàn)自淫現(xiàn)象，若發(fā)現(xiàn)有自淫現(xiàn)象應及時調(diào)換實驗動物，以避免影響后續(xù)精子樣本質(zhì)量。

2 精子的冷凍保存

精子可在超低溫下長期保存，但在冷凍和解凍復蘇的過程中會對精子細胞造成一定程度的損傷。冷凍損傷可能的機制有冷休克、冰晶形成、滲透壓應激［17-18］和氧化應激［19］等，但其具體機制仍不完全清楚。精子冷凍保存涉及一系列連續(xù)步驟，每一步都與解凍后的精子質(zhì)量息息相關，因此應探尋最適用于猴精子的冷凍保存液和冷凍保存步驟以提高冷凍后的精子質(zhì)量。

2.1 精子密度

L.T.Denis等［20］對松鼠猴的研究表明，精子濃度可能影響解凍后精子的質(zhì)量。Dong Q.等［16］研究表明，在較高密度下冷凍保存恒河猴精子，解凍后的精子活率較高。建議恒河猴精子冷凍保存時將精子濃度調(diào)整為（5.0～10.0）×107個／mL。

2.2 冷凍保存稀釋液液成分

因暫無商業(yè)化的猴精子冷凍保存稀釋液，冷凍保存稀釋液多現(xiàn)配現(xiàn)用。常用的兩種基礎液是TTE（Tes-Tris-egg yolk）稀釋液［15，21-22］和TCG（Triscitric acid-glucose）稀釋液添加卵黃［23］。

2.2.1 精子冷凍保存液中糖的作用 作為精子能量代謝的底物，糖通過糖酵解途徑或者三羧酸循環(huán)分解產(chǎn)生ATP，為精子提供能量，同時也調(diào)節(jié)稀釋液的滲透壓［24］。SiW.等［25］對比單獨或聯(lián)合添加葡萄糖（單糖）、乳糖（雙糖）和棉籽糖（三糖）對恒河猴精子冷凍和解凍過程中精子質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)多種糖聯(lián)合使用能比單獨使用棉籽糖具有更好的保護作用，低濃度（0.15 mol／L）時，葡萄糖和棉籽糖聯(lián)合使用比乳糖和棉籽糖提供更好的保護效果。最近有研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物甲基乙二醛（methylglyoxal）會對細胞產(chǎn)生毒性作用，且甲基乙二醛的產(chǎn)生與葡萄糖濃度成正比［26-27］。冷凍保存稀釋液中低濃度的葡萄糖可能產(chǎn)生更少的甲基乙二醛，有利于種馬精子的冷凍保存［28］。由于不同物種間的差異性較大，糖毒性作用是否適用于獼猴屬動物精子還需進一步探索。

近年來，冷凍保護液中添加海藻糖（trehalose）的研究越來越多。海藻糖是一種天然的非滲透性雙糖，在精子冷凍保存過程中一方面提供高滲環(huán)境，在冷凍操作前使細胞適度脫水，可減少細胞內(nèi)冰晶的形成［29-31］；另一方面通過與膜磷脂反應并使細胞膜更快地降到玻璃化轉變溫度，穩(wěn)定膜的完整性和頂體 狀 態(tài)［31-33］。目 前 研 究 者 已 在 豬［34］、羊［31，35］、兔［36］和牛［37］等動物精子稀釋液中添加一定濃度的海藻糖，均可減少凍后精子細胞膜和頂體的損傷，但未在獼猴屬動物精子冷凍保存中驗證。

2.2.2 動物源蛋白的添加 自從研究者發(fā)現(xiàn)卵黃有利于維持公牛精子功能與結構的完整性［38］之后，在動物精子冷凍保存稀釋液中通常添加卵黃。卵黃對精子的保護機制尚不完全明確，有學者推測低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）可能是提供保護的主要成分［39-41］。LDL有兩方面作用：一方面可以結合或附著在精子膜上，在精子膜表面形成保護膜［42］或取代已丟失的磷脂［43-44］；另一方面LDL可能通過減少精漿中脂結合蛋白對精子膜的有害影響而間接保護精子［45］。精漿中存在一些脂結合蛋白，可與精子膜結合，導致膽固醇和磷脂外流［46-47］，進而降低精子在冷凍保存過程中的抗打擊能力。但在恒河猴的精子冷凍保存過程中發(fā)現(xiàn)，精子在精漿中存留5 h不會降低精子冷凍后的活率，推測卵黃對恒河猴精子冷凍可能有其他保護機制［48］。

卵黃的成分復雜，含有很多未知的化合物，而且可能帶有禽類的病原微生物，有疾病傳播的風險，因此需要研發(fā)不添加卵黃的稀釋液。Dong Q.等［48］研究表明，冷凍保護劑中添加不同濃度卵黃對恒河猴精子解凍后的質(zhì)量并無顯著影響，但添加組均高于不添加組。Yan Y.P.等［49］和陳衍等［50］研究使用不含卵黃的人用精子冷凍保存液，成功保存了食蟹猴精子，但與含卵黃冷凍保存液相比精子凍后活率較低。

除卵黃外，也有研究在馬、牛和山羊等的精子冷凍保存液中添加脫脂牛奶［45］，但牛奶對精子具體的保護機制仍不清楚。抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）可以減少冰晶的形成和精子復蘇時水重結晶的形成［51］，Wang S.N.等［52］報道，在食蟹猴精子冷凍保存研究中用AFPⅢ代替卵黃是可行的，但高濃度AFPⅢ（100μg／mL）對精子頂體完整性有不利影響，其具體影響機制尚不清楚。

2.2.3 滲透性抗凍劑的作用 甘油、二甲基亞砜、乙二醇和丙二醇等都是滲透性抗凍劑。有研究表明乙二醇在精子冷凍保存過程中發(fā)揮的作用與甘油相當［23，53］，但二甲基亞砜不適用于獼猴精子的冷凍保存［54］。Li Y.H.等［15］的研究對比了不同甘油濃度（1%、3%、5%、10%和15%）和平衡時間（10，30，60，90 min）對精子活率和精子細胞膜完整性的影響，結果表明，添加5%甘油并平衡30 min，解凍后精子活力和精子細胞膜完整性最高。其他研究也表明甘油的最適添加濃度為3%或5%［21-22，55］。加入甘油時的溫度、冷凍降溫速率和稀釋液其他成分等也影響冷凍效果，因此不同稀釋液或不同冷凍降溫程序選擇的甘油濃度可能不同。

由于甘油等滲透性抗凍劑對精子也可能造成損害［56-57］，因此考慮是否能不加入抗凍劑。Dong Q.等［58］首次證明，在不含甘油或乙二醇等冷凍保護劑的情況下可以成功冷凍保存獼猴精子，但解凍后的精子活率較添加甘油差。因此，還需進一步優(yōu)化稀釋液配方，如加入抗凍蛋白等替代抗凍劑的作用。

2.2.4 抗氧化劑的作用 精子在降溫、冷凍和解凍過程中活性氧（ROS）不斷累積，而過量ROS會導致氧化應激，對恒河猴精子產(chǎn)生不利的影響［59］，引起精子DNA損傷［60］。因此，可在冷凍保存液中添加抗氧化劑，以彌補精子自身自由基清除系統(tǒng)的有限性［61-62］，改善凍后精子的質(zhì)量。根據(jù)抗氧化劑的化學結構，可將其分為酶類和非酶類［63］，其中常見的酶類抗氧化劑有谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶；非酶類抗氧化劑有自由基清除劑，如維生素E（α-生育酚）、維生素C（抗壞血酸）、褪黑素和L-肉堿等［64-65］。獼猴屬動物精子冷凍保護液中抗氧化劑的添加鮮有報道，將來應更深入探究添加不同抗氧化劑的冷凍保存液對獼猴屬動物精子凍后質(zhì)量的影響。

2.3 精子冷凍程序

甘油只需要幾秒鐘就能滲透到精子細胞［66］，加入甘油后的平衡時間較為重要。F.Cho等［67］在稀釋液中加入甘油，對比甘油未平衡和平衡0.5 h的效果，發(fā)現(xiàn)未平衡組精子冷凍后活率更低。有研究對比恒河猴精子冷凍保存前在4℃中預冷與不預冷時精子解凍后的活率，結果預冷組有小幅度提高［16］。從精子對降溫的適應來說，建議加入預冷這一步驟。

目前，獼猴屬動物的精子冷凍程序基本上與T.L.Tollner等［22］的報道相似，即采用緩慢的冷卻和快速冷凍相結合，先用稀釋液將精子第一次稀釋，然后置于4℃冷卻室中預冷2～4 h［68］；再添加含冷凍保護劑的稀釋液進行第2次稀釋，裝入塑料細管，平衡后置于液氮蒸氣上熏蒸10 min，最后放入液氮中保存。由于熏蒸時距液氮面的高度及液氮容器大小等均影響冷凍效果、實驗人員的操作誤差，難于標準化制作冷凍精子，優(yōu)先考慮用程序降溫儀冷凍精子［52］。

3 人工輸精

獼猴屬動物子宮頸管的結構較為復雜，屬內(nèi)不同種間的結構也存在差異，如恒河猴子宮頸管呈“S”形，食蟹猴子宮頸管雖沒有恒河猴那么彎曲，但子宮頸管處具有較深的隱窩等［69-70］，使得獼猴屬動物的人工輸精比較困難，無法直接使輸精器達到宮腔內(nèi)。一般精子是從雌性生殖道探入宮腔內(nèi)［71-73］，也可以在B超引導下通過腹壁穿刺將精子直接注射到子宮腔內(nèi)［74-75］，但該腹壁穿刺輸精對實驗人員的操作要求較高。

食蟹猴月經(jīng)周期與人類相似，也可分為月經(jīng)期、卵泡期、排卵期和黃體期，但因為個體差異，周期長短不同［76］。輸精時間應選擇在排卵前，一般在月經(jīng)周期的8～15 d［77］。其具體排卵期還應結合生殖激素測定，如雌二醇、促黃體生成素、孕酮等［68，73］或B超觀察卵泡發(fā)育情況判斷。另外，一些研究人員通過陰道涂片法［78］和基礎體溫／體重［79］判斷排卵日期，但這兩種方法收集數(shù)據(jù)較困難，準確性較差，不宜作為常規(guī)判斷排卵期的方法使用。

4 小結及展望

隨著疾病治療藥物開發(fā)需求的增加，對獼猴屬實驗動物的需求量隨之增加。通過人工授精技術增加種群數(shù)量，有助于減少實驗猴供應的壓力。目前人工授精的難點在于精子冷凍保存，包括精子冷凍保存稀釋液成分的選擇和冷凍程序。使用冷凍精子有助于提高實驗動物的利用率，改善雄性動物的福利，并保護瀕危的物種。目前獼猴屬動物精子冷凍保存研究取得了一定的進展，但是研究還不深入。精子冷凍后活率低、受孕率低，還需繼續(xù)改良獼猴屬動物精子冷凍保存液配方，如不同糖對精子的保護作用、動物源蛋白對精子的具體保護機制、植物源蛋白是否可以替代動物源蛋白和冷凍保存液中抗氧化劑的添加等；嘗試開發(fā)適用于獼猴屬動物的商業(yè)化精子冷凍保存劑；繼續(xù)優(yōu)化冷凍保存程序，如甘油的添加方式和時間、精子預冷及復蘇時間等，從而最大程度地利用好優(yōu)秀的種質(zhì)資源。