礬冰納米乳對增生性瘢痕VEGF、Ang-1、TGF-β1與MMP-2表達的影響

范洪橋　胡金輝　劉麗芳　吳雨薇

〔摘要〕 目的 觀察礬冰納米乳對增生性瘢痕血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）與基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2， MMP-2）表達的影響。方法 通過燒傷大鼠背部皮膚建立增生性瘢痕模型。144只SPF級SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、曲安奈德組及低、中、高劑量組（礬冰納米乳8.15、16.3、32.6 mg/mL），每組24只。連續(xù)給藥35 d（除空白對照組外）。明顯分別在第14、21、28、35天4個不同時間點采用空氣栓塞法每組隨機處死6只大鼠。采用HE染色法檢測成纖維細胞數(shù)密度;采用Westernblot檢測VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達。結果 與同時間點空白對照組比較，模型組成纖維細胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯升高（P<0.05）。除14 d外，與同時間點模型組比較，曲安奈德組與低、中、高劑量組成纖維細胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。與同時間點曲安奈德組比較，中劑量組成纖維細胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05）;低、高劑量組成纖維細胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均升高，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組中，與前一時間點比較，成纖維細胞密度均明顯升高（P<0.05）。曲安奈德組與低、中、高劑量組中，與前一時間點比較，成纖維細胞密度均明顯降低（P<0.05）?？瞻讓φ战M中，21 d與14 d比較，VEGF、Ang-1、TGF-β1蛋白表達均明顯升高（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1、TGF-β1蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。模型組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達明顯升高（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1蛋白表達均明顯升高（P<0.05）。曲安奈德組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達明顯降低（P<0.05）;35 d與28 d比較，TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。低劑量組中，35 d與28 d比較，TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。中劑量組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達明顯降低（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。結論 礬冰納米乳能降低增生性瘢痕模型大鼠成纖維細胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達，防治增生性瘢痕，以中劑量礬冰納米乳療效最佳。

〔關鍵詞〕 礬冰納米乳;血管內皮生長因子;血管生成素-1;轉化生長因子-β1;基質金屬蛋白酶-2;增生性瘢痕

〔中圖分類號〕R269? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.003

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of alum ice nanoemulsion on expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）， angiopoietin-1 （Ang-1）， transforming growth factor-β1 （TGF-β1） and matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） in hypertrophic scar. Methods Hypertrophic scar model was established by burn rat dorsal skin. 144 SD rats （SPF grade） were divided into blank control group， model group， triamcinolone group， low-dose， medium-dose and high-dose group （alum ice nanoemulsion 8.15， 16.3， 32.6 mg/mL）， with 24 rats in each group. Continuous administration for 35 days （except for blank control group）. Six rats in each group were randomly killed by air embolization at 4 different time points on day 14， 21， 28 and 35， respectively. The number density of fibroblasts was detected by HE staining. The protein expression levels of VEGF， ANG-1， TGF-β1 and MMP-2 were detected by Western blot. Results Compared with blank control group at the same time point， the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 were significantly increased in model group （P<0.05）. Compared with model group at the same time point except the day 14， the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 were decreased in triamcinolone group， low-dose， medium-dose and high-dose group （P<0.05）. Compared with triamcinolone group， the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 were decreased in low-dose group at the same time point; the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 were significantly increased in low-dose and high-dose group， and there was no statistical significance （P>0.05）. In model group， compared with the previous time point， the density of fibroblast was significantly increased （P<0.05）. Compared with the previous time point， the density of fibroblasts in triamcinolone group， low， medium and high dose groups was significantly decreased （P<0.05）. In blank control group， the protein expression levels of VEGF， ANG-1 and TGF-β1 were significantly increased on day 21 compared with day 14 （P<0.05）; compared with day 28， the protein expression leves of VEGF and ANG-1 were significantly decreased on day 35 （P<0.05）. In the model group， the expression of TGF-β1 protein was significantly increased on day 28 compared with day 21 （P<0.05）; the protein expression levels of VEGF and ANG-1 were significantly increased on day 35 compared with day 28 （P<0.05）. In triamcinolone group， the expression of TGF-β1 protein was significantly decreased on day 28 compared with day 21 （P<0.05）; compared with day 28， the protein expression levels of TGF-β1 and MMP-2 were significantly decreased on day 35 （P<0.05）. In the low-dose group， the protein expression levels of TGF-β1 and MMP-2 were significantly decreased on day 35 compared with day 28 （P<0.05）. In the medium-dose group， the expression of TGF-β1 protein was significantly decreased on day 28 compared with day 21 （P<0.05）; compared with day 28， VEGF and ANG-1 protein expression levels were significantly decreased on day 35 （P<0.05）. Conclusion Alum ice nanoemulsion can reduce the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 in hypertrophic scar model rats， and prevent hypertrophic scar formation， with the best effect in medium-dose alum ice nanoemulsion.

〔Keywords〕 alum ice nanoemulsion; vascular endothelial growth factor; angiopoietin-1; transforming growth factor-β1;

matrix metalloproteinase-2; hypertrophic scar

增生性瘢痕作為臨床上最常見的病理性瘢痕，主要是由于燒傷后組織過度再生和細胞外基質過度沉積所導致，伴有疼痛與瘙癢等不適，也伴有不同程度的外觀的損害和功能的障礙，影響患者的生活和工作質量，影響患者的社會交往。糖皮質激素、5-氟尿嘧啶和激光三者聯(lián)合運用，被證實是治療增生性瘢痕的最強搭配[1]，糖皮質激素、5-氟尿嘧啶等長時間使用都存在不同程度的毒副作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕形成過程中有大量的新生血管與較明顯的血管密度增加[2-4]。采用藥物抑制血管新生能夠達到抑制增生性瘢痕形成的效果[5-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，礬冰納米乳能夠激活、促進燒傷創(chuàng)面愈合且具有防止瘢痕形成的作用[9-10]，推測礬冰納米乳防治增生性瘢痕的可能作用機制與抑制血管生成有關。因此，本實驗擬通過建立大鼠增生性瘢痕模型，探討礬冰納米乳抑制增生瘢痕形成的作用機制，為臨床防治瘢痕提供“簡、便、效、廉”的藥物。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

體質量180～220 g的SPF級SD大鼠，鼠齡6～8周，雌雄不限，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗室提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，環(huán)境許可證號：SYXK（湘）2013-0005。

1.2? 藥品及試劑

礬冰納米乳由湖南中醫(yī)藥大學藥學院制備（批號：20190001），采用8.15、16.3、32.6 mg/mL低、中、高3種不同劑量;醋酸曲安奈德乳膏由新和成控股集團有限公司生產(chǎn)（批號：20190311）。小鼠抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）單克隆抗體（批號：19003-1-AP）、山羊抗血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）多克隆抗體（批號：23302-1-AP）、小鼠抗TGF-β1單克隆抗體（批號：21898-1-AP）、小鼠抗MMP-2單克隆抗體（批號：10373-2-AP）均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3? 礬冰納米乳的制備方法

取冰片2.5 g，研細，加入油酸乙酯6 g，攪拌使其溶解，再向其中加入乳化劑16 g，攪拌混勻，然后向其中緩緩加入蒸餾水，邊加邊攪拌，開始時隨水量增加而變得黏稠呈凝膠狀，繼續(xù)加入蒸餾水至一定量時變稀，呈透明至半透明狀，并帶淡藍色乳光。另取白礬13.8 g，氯化鈉9 g，溶于適量蒸餾水中，濾過，濾液緩緩加入到上述含有冰片等的溶液中，并加蒸餾水至1000 mL，攪拌混勻，濾過，灌封，于115.5 ℃滅菌30 min，即得16.3 mg/mL的中劑量礬冰納米乳。同量藥物，同樣制備流程，蒸餾水分別加至2000、500 mL則為低、高劑量礬冰納米乳。

1.4? 主要儀器

病理切片機（型號：RM2016，上海徠卡儀器有限公司）;顯微鏡、數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（型號：BA410、Motic Medical 6.0）均購自麥克奧迪公司;掃描儀（型號：V300，愛普生有限公司）;輪轉石蠟切片機（型號：RM2235，德國萊卡公司）;高速離心機（型號：TDL-5-A，上海安亭科學儀器廠）。

1.5? 造模方法

首先用備皮刀將大鼠背部皮膚剃毛，再用8%Na2S溶液脫毛，然后用清水沖洗干凈，肉眼觀察無局部損傷。畫出待燒面積（待燒面積：根據(jù)體質量計算出大鼠的總表面積乘以待燒面積的百分比）;采用3%戊巴比妥鈉（戊巴比妥鈉用量為30 mg/kg）麻醉大鼠;大鼠體位為俯臥位，將四肢用4號絲線分別固定于手術臺兩側。采用恒溫恒壓電熱燙傷儀，在75 ℃溫度條件下，將一個直徑為2 cm的圓形燙傷頭置于大鼠背部燒傷10 s，形成大鼠深Ⅱ°燒傷模型[7]。自然愈合后（約21～23 d上皮化）。經(jīng)病理證實為深Ⅱ°燒傷與增生性瘢痕。見圖1。

1.6? 分組及干預方法

按照隨機分組方法，將144只SPF級SD大鼠分成6組，即空白對照組、模型組、曲安奈德組、低劑量組（8.15 mg/mL礬冰納米乳）、中劑量組（16.3 mg/mL礬冰納米乳）、高劑量組（32.6 mg/mL礬冰納米乳），每組24只。空白對照組不進行造模處理，其余各組按照造模方法進行造模，經(jīng)病理證實造模成功后24 h，模型組給予0.2 mL生理鹽水，曲安奈德組予以曲安奈德均勻涂抹，直徑約2 cm，厚度約2 mm，低、中、高劑量組分別涂抹相同面積和厚度的低、中、高劑量礬冰納米乳，每天2次，每次0.2 mL，連續(xù)給藥35 d。

1.7? 標本采集

分別在第14、21、28、35天4個不同時間點用空氣栓塞法每組隨機處死6只大鼠，用手術刀在大鼠背部距離瘢痕邊緣0.5 cm處切取圓形的瘢痕組織（空白對照組相同部位取同樣大小的皮膚組織）。取材后，大鼠退出實驗。一部分標本在瘢痕最高點縱行切片，每張切片厚度約5 μm，石蠟包埋后，保存?zhèn)溆?。另一部分標本快速放入凍存管中密封后，放置?80 ℃冰箱中保存，待3個不同時間點的標本全部收集后統(tǒng)一進行Western blot檢測分析。

1.8? 指標檢測

1.8.1? HE染色計算成纖維細胞數(shù)密度? 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;用Weigert氏蘇木素染色約20 min;用蒸餾水洗滌約10 min;用Van Gieson氏染色液染色約1 min;丟棄染液，用95%酒精急速分化約數(shù)秒鐘;無水酒精分化與脫水，透明，封固;生物顯微鏡下攝取圖像，圖片采集分析。

1.8.2? Western blot檢測VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2的蛋白表達? 將瘢痕組織，用干凈的剪刀盡量剪碎，勻漿、離心后提取上清液，采用BCA蛋白濃度測定。按照說明書要求配置濃縮膠及分離膠，進行蛋白電泳后采用半干轉印法將蛋白轉至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉、一抗（1∶500） 4 ℃孵育、二抗（1∶1000）室溫孵育、TBST漂洗后顯影及曝光。用EPSON掃描儀掃描膠片，將圖像輸入計算機，并對目標條帶的蛋白灰度值，利用Image J軟件檢測與分析。同時設置β-actin為內參照。

1.9? 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理與分析。對計量資料采用“x±s”描述，采用頻數(shù)及百分比描述計數(shù)資料。符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用完全隨機設計多樣本單因素方差分析，否則則采用多樣本秩和檢驗。以P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 對成纖維細胞數(shù)密度的影響

與同時間點空白對照組比較，模型組成纖維細胞數(shù)密度均明顯升高（P<0.05）。除14 d外，與同時間點模型組比較，曲安奈德組及低、中、高劑量組成纖維細胞數(shù)密度均明顯降低（P<0.05）。與同時間點曲安奈德組比較，中劑量組成纖維細胞數(shù)密度均明顯降低（P<0.05）?？瞻讓φ战M中，與前一時間點成纖維細胞密度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組中，與前一時間點比較，成纖維細胞密度均明顯升高（P<0.05）。曲安奈德組與低、中、高劑量組中，與前一時間點比較，成纖維細胞密度均明顯降低（P<0.05）。見表1、圖2。

2.2? 對VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達的影響

與同時間點空白對照組比較，模型組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2的蛋白表達均明顯升高（P<0.05）。與同時間點模型組比較，曲安奈德組及低、中、高劑量組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。與同時間點曲安奈德組比較，中劑量組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05）;低、高劑量組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均升高，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）?？瞻讓φ战M中，21 d與14 d比較，VEGF、Ang-1、TGF-β1蛋白表達均明顯升高（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1、TGF-β1蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。模型組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達明顯升高（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1蛋白表達均明顯升高（P<0.05）。曲安奈德組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達明顯降低（P<0.05）;35 d與28 d比較，TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。低劑量組中，35 d與28 d比較，TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。中劑量組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達明顯降低（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。見圖3-10。

3 討論

增生性瘢痕可由深度燒傷、嚴重外傷或感染后皮膚的異常修復引起[11-12]，主要是由于真皮內成纖維細胞異常增生及細胞外間質沉積過多。治療增生性瘢痕有諸多方法與藥物，但多數(shù)治療手段均存在副作用，原因在于增生性瘢痕確切的發(fā)病機制仍不十分清楚，所以闡明增生性瘢痕的發(fā)病機制與尋求治療增生性瘢痕的中藥已成為迫切需要。研究發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕與正常皮膚相比，VEGF與微血管密度明顯升高[13]，說明增生性瘢痕與血管生成關系密切。VEGF參與包括血管內皮細胞增殖、存活與血管新生等血管生成的幾乎所有步驟[14-15]。VEGF在增生期瘢痕中呈高表達，抗VEGF治療可顯著減少血管生成，降低增生性瘢痕的形成的概率[16-18]。繼VEGF后，血管生成素是調節(jié)血管生長和保持血管穩(wěn)定性的另一個重要因子。有研究[19]發(fā)現(xiàn)VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-2的表達在早期瘢痕中顯著升高，表明Ang/Tie-2系統(tǒng)促進創(chuàng)傷的正常愈合和瘢痕形成。TGF-β1具有多種生物學作用，它不僅有助于傷口的正常愈合，而且與多種纖維化疾病和增生性瘢痕有關。研究發(fā)現(xiàn)與正常皮膚組織相比，增生性瘢痕中TGF-β1 mRNA呈高表達，提示TGF-β1可促進增生性瘢痕的形成[20-21]。在增生性瘢痕形成的過程中起關鍵作用的是細胞外基質。MMP-2的活性能夠促進增生性瘢痕成纖維細胞的遷移能力[22]。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯高于空白對照組（P<0.05），與上述研究結果一致。

礬冰納米乳是以本院院內制劑礬冰液為基礎藥物，納米乳為載體，以水相載白礬、油相載冰片制備成的水包油型復合納米乳。它對礬冰液分散不均勻，易結晶等不足進行了改進。前期發(fā)現(xiàn)礬冰納米乳具有良好的促進燒傷創(chuàng)面愈合及防止瘢痕形成的作用[9]，但預防瘢痕的具體作用機制尚不明確。本實驗進一步將礬冰納米乳作用于大鼠增生性瘢痕模型，結果顯示曲安奈德與不同劑量礬冰納米乳都能明顯降低成纖維細胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達（P<0.05）。與曲安奈德組比較，中劑量組成纖維細胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達均明顯降低（P<0.05），表明中劑量組可以明顯抑制增生性瘢痕組織中的血管生成，達到防治增生性瘢痕的目的。

綜上所述，礬冰納米乳可以抑制大鼠增生性瘢痕形成，這種影響可能是礬冰納米乳具有抑制增生性瘢痕血管生成相關因子VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2表達的作用，但具體的作用機制有待于深入研究。

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