賈惠靜，薛金梅

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科 山西省氣道炎性疾病神經(jīng)免疫研究省級重點培育實驗室，山西 太原 030001)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是機體接觸變應(yīng)原后主要由IgE介導(dǎo)的炎癥因子釋放、多種免疫細胞共同參與的鼻黏膜非感染的炎癥性疾病。同時，AR患者在發(fā)作期有不同程度的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，增加哮喘發(fā)生的風(fēng)險[1]，已成為一個全球性健康問題，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。目前學(xué)界在闡明變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生和機制方面取得了顯著成果，發(fā)現(xiàn)AR與炎性介質(zhì)、免疫功能失衡有關(guān)。天然免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，在病原體識別和保護性免疫應(yīng)答啟動中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。而Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為天然免疫系統(tǒng)的重要PRRs，是針對細菌和病毒病原體提供保護的第一反應(yīng)者，對入侵的病原體提供防御性炎癥反應(yīng)，其在鼻黏膜屏障中的作用逐漸得到了廣大學(xué)者的一致認可。近年來，TLRs激動劑作為治療靶點治療變態(tài)反應(yīng)性疾病正處于不同發(fā)展階段，目前研究主要集中在TLRs激動劑2、3、4、7、8、9亞型，本文重點將以上亞型在AR治療中的研究進行闡述，為臨床治療AR提供新的治療方向。

1 TLRs結(jié)構(gòu)和功能

TLRs是一種可識別高度保守病原相關(guān)分子模式的I型跨膜受體，其基本結(jié)構(gòu)由3部分組成：富含亮氨酸的胞外段、跨膜段、胞內(nèi)段。富含19 ～ 25個亮氨酸堿基重復(fù)序列構(gòu)成的胞外段的主要作用是識別TLRs相應(yīng)配體，胞內(nèi)段主要參與TLRs的信號傳遞，完成整個信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[3]。人體內(nèi)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的TLRs有10種，即TLR1～TLR10，其中TLR1、2、4、5、6 和 10 表達于細胞表面，與其相應(yīng)的配體相結(jié)合；而 TLR3、7、8 和 9 通常位于細胞內(nèi)，它們的天然配體可能僅存在于細胞內(nèi)[4]。不同的TLRs與其特定的配體結(jié)合介導(dǎo)各種細胞信號的傳導(dǎo)。

天然免疫系統(tǒng)是機體抗感染過程中的第一道防線，TLRs作為最早一類被發(fā)現(xiàn)的PRRs，在天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)中都發(fā)揮重要作用。TLRs激活后通過識別不同PAMPs促使樹突狀細胞( dendritic cells，DCs)成熟，活化T細胞、B細胞啟動獲得性免疫，是介導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫耐受的關(guān)鍵分子；TLRs 還可以誘導(dǎo)機體抗微生物防御系統(tǒng)，產(chǎn)生各種趨化因子和炎性介質(zhì)，調(diào)節(jié)機體輔助性T細胞( T helper cell，Th) 1 和 Th2 的平衡[5]。TLRs激動劑可作為免疫治療的靶點，通過誘導(dǎo)免疫耐受或氣道免疫反應(yīng)向Th1分化阻止變應(yīng)性氣道疾病進展。

2 TLRs激動劑在AR治療中的作用

2.1 細胞外TLRs激動劑

2.1.1 TLR2激動劑 TLR2 位于細胞膜上，主要識別細菌、真菌等結(jié)構(gòu)序列，可與TLR1或TLR6形成異二聚體識別不同的配體。當TLR2/TLR1形成異二聚體時，該復(fù)合物可對來自革蘭氏陽性細菌和支原體的三?；漠a(chǎn)生反應(yīng)；而當形成TLR2/TLR6異二聚體時，它反而識別來自革蘭氏陰性細菌和支原體的二酰化脂肽[6]，形成不同異二聚體可以識別不同的配體，激活不同的信號反應(yīng)。

有研究發(fā)現(xiàn)，霧化吸入TLR2/1激動劑Pam3Cys使卵清蛋白致敏小鼠先出現(xiàn)短暫性的哮喘，但隨后其氣道高反應(yīng)會減輕或消失，嗜酸性粒細胞顯著減少[7]。Pam3Cys，是一種生物合成的三?；鞍祝勺鳛榭惯^敏劑或免疫佐劑。Pam3Cys 還可以增加腫瘤表面標志物 CD80和 CD86 的表達，促進DCs的激活，進而增加氣道黏膜中干擾素-γ的產(chǎn)生[8]，而干擾素-γ能有效抑制 Th2 反應(yīng)，抑制嗜酸性粒細胞的活化、分化和募集，從而減輕氣道變應(yīng)性炎癥。另一種TLR2/1激動劑Pam3CSK4可降低鼻呼氣中一氧化氮(nNO)水平，可以抑制 CD4+T細胞增殖和 Th2 細胞因子的產(chǎn)生[9-10]，經(jīng)鼻給藥后可以明顯改善鼻部過敏癥狀。從以上體外模型和小鼠體內(nèi)模型研究說明TLR2/1激動劑有成為免疫佐劑治療AR的潛力。TLR2/6激動劑—巨噬細胞活化脂肽-2，在哮喘小鼠模型中，經(jīng)霧化后可使氣道高反應(yīng)、嗜酸性粒細胞和Th2細胞因子顯著降低，從而改善鼻過敏癥狀[11]。巨噬細胞活化脂肽-2還可誘導(dǎo)B細胞和DCs中 CD80、CD86、CD40 以及主要組織相容性復(fù)合體I和II的表達，也可增加DCs釋放干擾素-γ的能力[12]。

目前用于治療癌癥的OK-432，作為一種TLR2激動劑，有望成為治療AR和哮喘的可行藥物[13]。在過去的研究中，TLR2在呼吸系統(tǒng)的研究僅限于體外和小鼠體內(nèi)模型，TLR2的激動劑可以有效地抑制Th2反應(yīng)，減輕過敏癥狀，在未來的工作中需進一步深入探討和研發(fā)，用于臨床治療AR。

2.1.2 TLR4激動劑 TLR4是第一個通過遺傳學(xué)方法鑒別出來的TLR，表達于細胞膜上，主要是形成同源二聚體發(fā)揮識別配體的作用，其主要配體是細菌脂多糖(bacterial lipopolysaccharide，LPS)。TLR4與LPS結(jié)合后導(dǎo)致細胞內(nèi)接頭激活，進一步啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)[14]。有研究分析LPS在人類DCs中作用時發(fā)現(xiàn)，LPS可促進白介素-12p70的產(chǎn)生，提供向Th1分化的刺激[15]。在樺樹花粉過敏的體外模型中，使用白樺花粉和LPS聯(lián)合刺激人臍血細胞，發(fā)現(xiàn)Th2反應(yīng)下調(diào)，白介素-13生成減少[16]。Rodriguez等[17]證明LPS還可通過NO合成酶活性抑制Th2介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，這表明LPS在抗過敏中發(fā)揮重要作用。在季節(jié)性AR患者中，可以看到鼻腔灌洗細胞中TLR4表達升高，當使用變應(yīng)原和LPS同時刺激鼻腔時，可觀察到鼻腔中Th1和Th2細胞因子的都增加，而在變應(yīng)原刺激之前先使用LPS，則沒有觀察到這一現(xiàn)象[18]，變應(yīng)原和LPS刺激的時間順序似乎是一個重要因素，表明LSP刺激可能減輕Th2反應(yīng)。

TLR4激動劑單磷酰脂質(zhì) A，是LPS經(jīng)水解和色譜分析法后得到的，保留了LPS的免疫調(diào)節(jié)特性，是LPS的無毒衍生物[19]，是美國食品藥品管理局唯一批準用于特異性免疫治療的第二代佐劑[20]，是第一個用于疫苗佐劑的TLR激動劑[21]。以單磷酰脂質(zhì)A為佐劑研發(fā)的疫苗已用于過敏患者的臨床治療，但因其工業(yè)上生產(chǎn)步驟復(fù)雜、成本高及質(zhì)量控制難[22-23]，可能是目前還未應(yīng)用于臨床治療AR的重要原因。單磷酰脂質(zhì)A激活TRIF信號通路，誘導(dǎo)核因子κB、細胞因子產(chǎn)生和抗原特異性T細胞活化直接激活抗原提成細胞(antigen-presenting cells，APC)[24-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，單磷酰脂質(zhì) A刺激TLR4后，可促使DCs成熟并產(chǎn)生細胞因子，尤其是白介素-12，進而促使T細胞向Th1分化[26]；在一項體外研究，將單磷酰脂質(zhì)A與花粉變應(yīng)原結(jié)合刺激APC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白介素-5的表達下調(diào)而干擾素-γ的產(chǎn)生增多[27]，這種抑制Th2因子釋放的作用，不僅在于白介素-12分泌增加，還依賴于APC的激活。在AR小鼠模型中，在卵清蛋白致敏期間加入單磷酰脂質(zhì)A，可導(dǎo)致IgG抗體表達上調(diào)，并誘導(dǎo)Th1反應(yīng)；而不加入單磷酰脂質(zhì)A時，僅會引起IgE表達增加[28]。CRX-675是一種水性單磷酰脂質(zhì)A化合物，目前已被用作是抗過敏治療的獨立鼻內(nèi)制劑，其小劑量鼻內(nèi)用藥即可改善鼻部癥狀，有數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CRX-675能降低小鼠哮喘模型中血清總IgE 水平、氣道高反應(yīng)、氣道嗜酸性粒細胞和 IL-13[20]。

另外，最近一項新的研究利用TLR4激動劑吡喃葡萄糖基脂質(zhì)A，作為誘導(dǎo)AR小鼠模型中佐劑，可以抑制嗜酸性粒細胞增多及白介素-5的分泌[29]，但具體機制并未闡明，在未來的研究中需進一步探索。以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4激動劑可以抑制Th2反應(yīng)，誘導(dǎo)Th1分化，進而改善過敏癥狀。

2.2 細胞內(nèi)TLRs激動劑

2.2.1 TLR3激動劑 TLR3廣泛表達于除漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)和中性粒細胞之外的其他先天免疫細胞，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)合成后通過跨膜蛋白轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)體中[30]。TLR3與TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白直接相互作用，可激活核因子κB信號通路和促炎細胞因子的生成，并且嗜酸性粒細胞可能通過TLR3激活加重AR炎癥反應(yīng)[31]。一項研究發(fā)現(xiàn)，AR患者間充質(zhì)干細胞表達的TLR3量較其他TLRs多[32]，間充質(zhì)干細胞在調(diào)節(jié)人體內(nèi)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，AR患者間充質(zhì)干細胞TLR3表達增加，表明其可能參與AR的發(fā)生；并且dsRNA/TLR3相互作用與胸腺基質(zhì)淋巴生成素的產(chǎn)生和激活密切相關(guān)[33]，胸腺基質(zhì)淋巴生成素是啟動Th2炎癥的報警因子，在變應(yīng)性炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,靶向胸腺基質(zhì)淋巴生成素的生物制劑可用于變應(yīng)性氣道疾病的治療[34]。TLR3可識別病毒的dsRNA、人工合成的dsRNA類似物聚肌苷酸-聚胞苷酸和宿主的mRNA[35]。Fransson等[36]研究發(fā)現(xiàn)AR患者鼻黏膜中TLR3 mRNA和蛋白表達水平上調(diào)，但白介素-4和白介素-5存在時可使TLR3的表達下調(diào)，結(jié)果證實在花粉季節(jié)和Th2細胞因子環(huán)境的存在下，TLR3表達水平會下降[31]，這可能與Th2細胞因子啟動的自動調(diào)節(jié)反饋回路有關(guān)。

有學(xué)者使用聚肌苷酸-聚胞苷酸刺激卵清蛋白致敏的小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR小鼠的過敏癥狀并沒有減輕，表明聚肌苷酸-聚胞苷酸可能通過產(chǎn)生IgE增強變態(tài)反應(yīng)[8,37]。聚腺苷酸：聚尿苷酸，是一種毒性較低的聚肌苷酸-聚胞苷酸，其可在體外或體內(nèi)通過激活嗜堿粒細胞加重了卵清蛋白誘導(dǎo)的變應(yīng)性哮喘[38]，聚腺苷酸：聚尿苷酸可誘導(dǎo)DCs分泌白介素-12p40[39]，白介素-12p40可與促進Th1反應(yīng)的白介素-12p70競爭，有利于促進Th2炎癥。以上研究結(jié)果表明，TLR3激活或表達增加，可促進變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，可能是AR發(fā)病的危險因素，因此后期可進一步探討TLR3拮抗劑的作用，可能成為治療AR的免疫治療方法。

2.2.2 TLR7/TLR8激動劑 TLR7、TLR8位于細胞膜內(nèi)，有研究發(fā)現(xiàn)單鏈RNA能夠同時激活TLR7和TLR8[40]，比如皰疹病毒、免疫缺陷病毒等。TLR7和TLR8在結(jié)構(gòu)上有高度序列同源性，并且功能也相當接近的胞內(nèi)免疫受體，TLR7/8受體與配體相互作用可導(dǎo)致MyD88信號通路激活，可促進Th1型細胞因子產(chǎn)生，抑制Th2反應(yīng)，從而改善過敏癥狀[41]。 TLR7/TLR8激動劑作為研發(fā)疫苗佐劑具有炎癥調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等性能[42]，其在新型冠狀病毒疫苗的研發(fā)中也發(fā)揮了積極的佐劑作用[43]。近年來一項針對季節(jié)性AR患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，使用TLR7 激動劑 AZD8848噴鼻治療后，AR患者的過敏癥狀可以得到有效緩解，并且血清中Th1型細胞因子表達上調(diào)[44]、通過鼻內(nèi)用藥可有效降低肥大細胞類胰蛋白酶和α2-巨球蛋白的表達，肥大細胞的活性降低[45]，表明TLR7激動劑對AR有顯著的療效。瑞喹莫德(R848)是小分子三環(huán)有機化合物，是一種TLR7/TLR8受體激動劑。在胸腺基質(zhì)淋巴生成素刺激的人DCs的體外模型中，R848能有效抑制Th2介導(dǎo)的反應(yīng)[46]；Boghdadi 等[47]也發(fā)現(xiàn)，使用R848刺激AR患者的外周血單核細胞，其抗炎介質(zhì) 白介素-4、白介素-10、白介素-13、干擾素-γ表達顯著增加，這些研究結(jié)果提示了R848 既可以介導(dǎo)抗炎效應(yīng)，還可抑制Th2反應(yīng)，改善過敏癥狀。在卵清蛋白誘導(dǎo)的AR小鼠模型中，R848誘導(dǎo)TLR7激活后可上調(diào)白介素-12和干擾素-γ水平，降低Th2細胞因子表達水平，同時減少嗜酸性粒細胞的浸潤和杯狀細胞的增生，增加Th1和Treg細胞的比例[48-49]，有效改善AR小鼠鼻部癥狀。R848在治療氣道炎癥性疾病方面也是具有前景的免疫佐劑。比如，rBet v1疫苗、Der f1疫苗分別是針對樺樹花粉和螨蟲過敏引發(fā)的哮喘的疫苗，rBet v1疫苗聯(lián)合 R848 的皮下免疫可刺激特異性 Th1 反應(yīng)，有效抑制了樺樹花粉誘導(dǎo)的哮喘[50]；Der f1 疫苗聯(lián)合 R848可以顯著控制變應(yīng)性哮喘的癥狀[51]。

VTX-1463是一種TLR8激動劑，作為目前用于AR的臨床治療藥物，可誘導(dǎo)TLR8信號通路，激活A(yù)PC細胞因子的應(yīng)答，從而誘導(dǎo)Th1應(yīng)答，旨在轉(zhuǎn)變Th1/Th2平衡率，從而降低變態(tài)反應(yīng)[52]，AR患者對其耐受性良好，目前未見相關(guān)不良反應(yīng)的報道。從以上研究可以看到，TLR7/TLR8激動劑成為AR的治療性藥物或佐劑具有很大的潛力。

2.2.3 TLR9激動劑 TLR9位于細胞膜內(nèi)，可識別細菌和病毒基因組中存在但在哺乳動物細胞中很少見到的未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸基序，介導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)。胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸 寡核苷酸作為一種變態(tài)反應(yīng)抑制劑，可以有效地抑制Th2細胞因子釋放，降低氣道嗜酸粒細胞、IgE水平，防止氣管重構(gòu)[53]，改善AR鼻黏膜的病理炎癥。胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸是一種合成的TLR9激動劑，可刺激B細胞、NK細胞和特異性APC增殖，并分泌多種細胞因子、趨化因子和免疫球蛋白[54]。在AR小鼠模型中，在卵清蛋白致敏期間使用胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸，可通過減少白介素-4、白介素-5、白介素-13、IgE嗜酸性炎癥和促進干擾素-γ的增多，抑制Th2反應(yīng)[55]；另有研究發(fā)現(xiàn)，胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸可降低小鼠哮喘模型支氣管肺泡中嗜酸性粒細胞、白介素-4、白介素-5和IgE的產(chǎn)生，并提高白介素-10水平[56]。噬菌體Qbeta衍生的病毒樣顆粒QbG10，屬于A型 胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸，也是一種TLR9激動劑，目前已被包裝成CYT003-QbG10的病毒樣納米顆粒制劑，在IIb期臨床研究中用于治療屋塵螨致敏的AR患者，對該制劑表現(xiàn)出良好的耐受性，可有效降低AR患者的癥狀評分，提高患者的生存質(zhì)量[57]；另外，持續(xù)性過敏性患者在停用類固醇藥物后，皮下注射QbG10也可使過敏癥狀得到良好的控制[58]，這項研究提示，QbG10可能成為未來治療變應(yīng)性疾病的新治療方向。

一種新型TLR9激動劑AZD1419，具有較強的藥理活性，能誘導(dǎo)干擾素信號傳導(dǎo)，這可能直接導(dǎo)致 Th2 反應(yīng)的失調(diào)并影響氣道炎癥進展，在動物模型中誘導(dǎo)對氣道變態(tài)反應(yīng)的持久抑制，在臨床試驗中安全且耐受性良好[59]，可有望用于臨床上治療AR。變應(yīng)原原-TLR9免疫刺激DNA序列結(jié)合物，在季節(jié)性花粉暴露時，使用DNA序列結(jié)合物短期治療可減輕Th2反應(yīng)，但在后續(xù)的臨床試驗中，DNA序列結(jié)合物的治療效果并不理想[60]，因此DNA序列結(jié)合物的起效時間和作用還存在較大爭議。以上研究表明，部分TLR9激動劑在治療AR的作用存在分歧，需要更深入的研究和探討，用于臨床治療需要更多的數(shù)據(jù)驗證。

3 總結(jié)與展望

TLRs在氣道炎癥中發(fā)揮重要作用，TLRs激動劑作為治療變應(yīng)性疾病的新穎靶點，具有抗原性的TLRs激動劑可作為免疫疫苗的佐劑，而有些TLRs激動劑則可直接用于治療AR。TLRs激動劑是一個不斷發(fā)展的領(lǐng)域，作為免疫調(diào)節(jié)劑，具有很強的治療潛力。盡管TLRs作為靶點在治療AR有良好的應(yīng)用前景，但仍有很多問題需要解決。目前大多數(shù)TLRs激動劑的研究限于體外或小鼠體內(nèi)，需要完成大量臨床研究，觀察其療效；部分臨床試驗因缺乏對給藥時間、劑量等的研究，可能會導(dǎo)致過度免疫反應(yīng)。因此，這就需要我們進一步深入研究TLRs激動劑在AR 中的作用，為臨床治療 AR 探索新的途徑。