煙草青枯病菌對4種殺菌劑的敏感性及復配藥劑聯(lián)合毒力評價

牟文君，馬曉靜，胡利偉，郭建華，薛超群，奚家勤，宋紀真

中國煙草總公司鄭州煙草研究院 煙草行業(yè)生態(tài)環(huán)境與煙葉質(zhì)量重點實驗室，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

植物青枯?。˙acterial wilt）是由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的毀滅性土傳病害，病原菌分布范圍廣，可侵染煙草、番茄和馬鈴薯等50余科的數(shù)百種作物［1-2］。青枯病菌從植株根部或傷口侵染，侵入植物木質(zhì)部維管束并快速通過維管系統(tǒng)進入植物地上部分，對茄科作物危害尤為嚴重。煙草是我國重要經(jīng)濟作物，近年來隨著連作年限的增加，煙草青枯病流行和蔓延的速度加快，發(fā)病嚴重田塊發(fā)病率達100%，已成為煙草生產(chǎn)上的主要病害之一［3］。

煙草青枯病菌具有較高的遺傳變異性和環(huán)境適應(yīng)能力，菌系復雜，危害嚴重且難以防治，成為煙草生產(chǎn)的重要限制因素之一。目前，生產(chǎn)上對煙草青枯病的防治主要采取農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學防治相結(jié)合的綜合措施［4-7］。由于不同的防治方法均存在局限性，且細菌性青枯病與其他真菌、卵菌病害?；旌习l(fā)生，因此對青枯病的防治尚無十分有效的措施?；瘜W藥劑以其高效、速效的特點在病害防治中發(fā)揮著重要作用，目前市場上用于煙草青枯病防治的藥劑主要有有機氯、有機銅、有機硫、無機銅、無機硫及其復配藥劑等［8］。馮永新等［9］測定了7 種殺菌劑對煙草青枯病菌的毒力，其EC50介于101.02～212.70 mg/L 之間，按照毒力大小依次為三氯異氰尿酸、氯尿·硫酸銅、噻菌銅、溴菌·壬菌銅、甲霜·福美雙、噻唑鋅和中生菌素。黃小琴等［10］研究表明，硫酸鏈霉素、氫氧化銅、春雷霉素和噻唑鋅等7種殺菌劑對煙草青枯病的EC50在170.07～318.57 mg/L 之間，且硫酸鏈霉素的毒力最大。畢濤等［11］從13 種藥劑中篩選出可有效抑制煙草青枯病菌生長的6種藥劑，其中3%四霉素水劑的抑菌效果最好。林天然等［4］檢測了5 種常用殺菌劑對煙草青枯病盆栽的防治效果，表明50%青枯靈和72%農(nóng)用硫酸鏈霉素對青枯病的防效達88.6%和79.6%，而1.8%辛菌胺醋酸鹽、80%乙蒜素和3%克菌康的防效分別為75.6%、56.7%和52.3%。鄭旭川等［12］研究提出，25%溴菌·壬菌銅微乳劑、20%噻菌銅懸浮劑對煙草青枯病的防效在50%左右。盡管化學防治已成為防控青枯病的主要方法，但目前還沒有特效藥劑。因此，挖掘作用機制獨特、防治效果優(yōu)異的化學藥劑對煙草青枯病的防治尤為重要。氧化磷酸化解偶聯(lián)抑制劑是將呼吸鏈中電子傳遞和ATP 生成解偶聯(lián)的一類藥劑，由于該類藥劑無特異性靶標，因此其抑菌譜更為廣泛，也不易產(chǎn)生抗藥性［13-15］。氟啶胺是氧化磷酸化解偶聯(lián)抑制劑中的代表性藥劑，屬于吡啶胺類［9］，對煙草黑脛病菌和根腫菌等大部分真菌及螨類均有良好的抑菌活性和防效［14-16］。有研究表明，植物病原真菌對氟啶胺的抗藥性發(fā)展緩慢，且氟啶胺與非氧化磷酸化解偶聯(lián)作用機制的殺菌劑無交互抗藥性，可以用來治理已有的抗藥性風險［17-19］。

單一藥劑的長期、多頻次不合理使用可造成病原菌的抗藥性［4］，如2016 年農(nóng)用鏈霉素因抗藥性問題最終退出了農(nóng)藥市場［20］。納米抗菌材料較大的比表面積能夠增加其與病原菌接觸，提高抑菌活性，同時在化學滲透壓和物理損傷細胞結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用下，使病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，因此在植物病害防控方面具有廣闊應(yīng)用前景［21-22］。蒲麗等［23］研究表明，納米二氧化鈦在陽光或汞燈下照射4 h 后對煙草青枯菌的殺菌率達90%以上。蔡璘［24］研究發(fā)現(xiàn)，納米氧化鎂對煙草青枯病菌的抑制活性顯著高于普通氧化鎂，納米氧化鎂處理后煙草青枯病田間發(fā)病率可減少38.83%。金屬元素抗菌劑銅納米粒子在極低劑量下（0.22 μg/mL）也能夠抑制地毯草黃單胞桿菌的生長，從而高效控制石榴葉片枯萎病的發(fā)生［25］。銀納米粒子與氟康唑聯(lián)用對白色念珠菌具有高效抑菌作用［26］。但目前氟啶胺尚未應(yīng)用于細菌病害的防治。為篩選出高效防治煙草青枯病的藥劑，測定了煙草青枯菌對殺菌劑氟啶胺、雙苯菌胺、噻霉酮、鏈霉素和春雷霉素的敏感性，并將氟啶胺分別與納米硫、納米銀和納米銅進行二元復配，評價其協(xié)同增效作用，旨在為篩選防治煙草青枯病的新型高效藥劑和實現(xiàn)農(nóng)藥減量增效奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 煙草青枯病菌的分離鑒定

采集江西省撫州市宜黃、黎川、樂安、廣昌、資溪、南豐和崇仁發(fā)病煙田的青枯病發(fā)病煙株，將發(fā)病煙稈橫切成5 cm 的小段，并將溢出的白色菌膿劃線挑入盛有1 mL無菌水的離心管中制成菌懸液。靜置片刻后，用移菌環(huán)在牛肉膏蛋白胨（NA）選擇性培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)（NA 培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min，在溫度50～60 ℃時加入終濃度為 50 μg/mL 放線菌酮、10 μg/mL 氯霉素和10 μg/mL 多黏菌素）。煙草青枯病菌分子鑒定PCR體系包括12.5 μL DNA mix［生工生物工程（上海）股份有限公司］，0.2 pmol/L 特異性引物 759/760（5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′，5′-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3′），25 ng DNA模板，最后加入ddH2O補充至25 μL，陰性對照為ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.2 供試藥劑

98%氟啶胺購自上海弼眾商貿(mào)有限公司，98%雙苯菌胺購自沈陽化工研究院。99%噻霉酮購自天津阿爾塔科技有限公司。98%鏈霉素購自成都艾科達化學試劑有限公司。90%春雷霉素購自天津阿爾塔科技有限公司。以上藥劑用二甲基亞砜配制成1×105μg/mL的母液，置于4 ℃條件下保存。納米銅、納米銀和納米硫藥液濃度均為1×103μg/mL，均購自威晶納米新材料公司。

1.3 煙草青枯病菌生長曲線測定

將煙草青枯病菌接種至培養(yǎng)液中，于30 ℃、120 r/min 避光條件下進行恒溫振蕩培養(yǎng)65 h，獲得細菌懸浮液。加樣板每孔加入營養(yǎng)肉湯250 μL和預培養(yǎng)的煙草青枯病菌菌液50 μL，每個菌株重復3次。將加樣板置入Bioscreen C 生長曲線測定儀（芬蘭Oy Growth Curves Ab公司），溫度設(shè)置為28～30 ℃、每隔30 min測定菌液在波長600 nm處的吸光值（OD600），并繪制煙草青枯病菌的生長曲線。

1.4 煙草青枯病菌對不同藥劑的敏感性測定

采用生長曲線測定儀測定煙草青枯病菌對氟啶胺、雙苯菌胺、噻霉酮、鏈霉素和春雷霉素的藥劑敏感性。從煙草青枯病菌劃線平板上挑取單菌落加入NA 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)19 h，備用。將藥劑按照體積比1∶100加NA液體培養(yǎng)基中，藥劑濃度見表1。氟啶胺、雙苯菌胺和噻霉酮以只加二甲基亞砜的NA培養(yǎng)液為對照，鏈霉素和春雷霉素以只加無菌水的NA 培養(yǎng)液為對照。加樣板每孔加入不同濃度藥液3 μL、營養(yǎng)肉湯250 μL、青枯菌菌液50 μL，每個濃度重復3次。加樣板置入生長曲線測定儀上，于28～30 ℃、每隔30 min測定1次OD值。藥劑對青枯病菌的生長抑制率計算公式：

表1 不同殺菌劑單劑及復配藥劑的濃度Tab.1 Concentrations of different single and combinatory fungicides

以藥劑濃度的對數(shù)為x軸，抑制率的機率值為y軸，根據(jù)兩者間的線性關(guān)系，建立毒力回歸曲線方程y=ax+b，并計算相關(guān)系數(shù)r和藥劑對病原菌的有效抑制中濃度EC50。根據(jù)煙草青枯病菌敏感性的分布情況，建立青枯病菌對5種藥劑的敏感基線。

1.5 復配藥劑的聯(lián)合毒力測定

在單劑毒力測定的基礎(chǔ)上，按氟啶胺分別與3種納米農(nóng)藥按體積比 80 ∶1、40 ∶1、20 ∶1、4 ∶1、1 ∶1、1 ∶4、1 ∶20、1 ∶40 和 1 ∶80 共 9 個配比測定其對煙草青枯病菌的抑制率，復配藥劑的終濃度見表1。采用Wadley方法對復配制劑進行聯(lián)合作用評價，計算公式：

式中：a、b 分別為氟啶胺與納米農(nóng)藥的復配比例，%；EC50（a）為氟啶胺的有效抑制中濃度，μg/mL；EC50（b）為納米農(nóng)藥的有效抑制中濃度，μg/mL。

式中：EC50（th）為混劑的理論有效抑制中濃度，μg/mL；EC50（ob）為混劑的實測有效抑制中濃度，μg/mL。

SR≤0.5，表明兩種藥劑復配具有拮抗作用；SR在0.5～1.5 時，表明兩種藥劑復配具有相加作用；SR≥1.5，表明兩種藥劑復配具有增效作用［16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙草青枯病菌的分離鑒定

從江西省宜黃、黎川、樂安、廣昌、資溪和南豐等地區(qū)采集了煙草青枯病病樣，分離培養(yǎng)后青枯病菌在NA 培養(yǎng)基上生長的菌落表面光滑，呈不規(guī)則圓形，不透明、黏稠狀且有流動性，見圖1。將分離到的菌株采用煙草青枯病菌特異引物759/760 進行PCR 鑒定。結(jié)果（圖2）表明，共有40 株菌株基因組DNA 的PCR 擴增產(chǎn)物出現(xiàn)在預期位置（281 bp）。經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫BLASTN 比對，確認分離菌株為煙草青枯病菌。分離的煙草青枯病菌地理來源為崇仁縣相山鎮(zhèn)2 株；黎川縣4 株，來自德勝鄉(xiāng)、湖坊鄉(xiāng)和潭溪鄉(xiāng)；宜黃縣5 株，分別來自黃陂鎮(zhèn)和二都鎮(zhèn)；廣昌縣9 株，來自頭陂鎮(zhèn)、旴江鎮(zhèn)和長橋鄉(xiāng)；南豐縣10 株，來自傅坊鄉(xiāng)、太和鎮(zhèn)和太源鄉(xiāng)；資溪縣2 株，來自高阜鎮(zhèn)；樂安縣8 株，來自招攜鎮(zhèn)和增田鎮(zhèn)，見表2。

圖1 煙草青枯病菌在NA平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of R. solanacearum on NA plate

圖2 煙草青枯病菌的PCR鑒定電泳圖Fig.2 PCR electrophoretogram of R. solanacearum DNA samples

表2 煙草青枯病菌菌株信息Tab.2 Information of R. solanacearum strains

表2（續(xù)）

2.2 煙草青枯病菌生長曲線

選取4株煙草青枯病菌，在生長曲線測定儀上連續(xù)培養(yǎng)65 h，監(jiān)測煙草青枯病菌的生長動態(tài)，并繪制煙草青枯菌的生長曲線。由圖3 可知，培養(yǎng)4～19 h時煙草青枯菌快速生長，處于對數(shù)生長期，19～38 h煙草青枯病菌的生長相對平穩(wěn)，38 h 后煙草青枯病菌開始逐漸衰亡。因此，在藥劑毒力試驗中，選定培養(yǎng)19 h 左右的菌液，此時菌株生長活力較高，菌液OD600值代表煙草青枯病菌的生長量，可通過OD 值來比較藥劑處理對煙草青枯病菌生長的影響。

圖3 煙草青枯病菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of R. solanacearum strains

2.3 煙草青枯病菌對氟啶胺的藥劑敏感性

氟啶胺和雙苯菌胺的作用機制為氧化磷酸化解偶聯(lián)［9］。煙草青枯病菌對氟啶胺的藥劑敏感性（表3）表明，氟啶胺對供試菌株的EC50為0.147 1～0.890 4 μg/mL，最大與最小的 EC50之間相差 6.05 倍，平均EC50為0.305 0 μg/mL，表明來自不同取樣地的煙草青枯病菌株對氟啶胺的敏感性差異不大。其中，EC50最低和最高的菌株均來自樂安，來自其他地區(qū)菌株的EC50居于兩者之間。煙草青枯病菌菌株對氟啶胺的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線（圖4A），表明供試菌株對氟啶胺較敏感，可用于青枯病的防治。

表3 煙草青枯病菌對不同藥劑的敏感性Tab.3 Sensitivity of R. solanacearum to different fungicides （μg·mL-1）

表3（續(xù)）

2.4 煙草青枯病菌對雙苯菌胺的藥劑敏感性

從表3 可以看出，煙草青枯病菌對雙苯菌胺的敏感性較高，平均EC50為0.037 8 μg/mL，且敏感性分布范圍相對較窄，最大和最小EC50分別為0.018 7 μg/mL和0.053 4 μg/mL，兩者僅相差2.86 倍，分別來自黎川縣和廣昌縣。從敏感基線（圖4B）可以看出，煙草青枯病菌對雙苯菌胺的敏感性呈單峰曲線分布，表明供試菌株對雙苯菌胺敏感，未出現(xiàn)抗藥性菌株。

2.5 煙草青枯病菌對噻霉酮的敏感性

噻霉酮對煙草青枯病菌的EC50分布范圍為0.099 5～4.825 3 μg/mL，平均EC50為2.429 9 μg/mL。從表3 可見，南豐縣10 株青枯病菌對噻霉酮的敏感性差異相對較大，宜黃縣5 株青枯病菌對噻霉酮的敏感性分布相對較窄?？傮w來看，煙草青枯病菌菌株對噻霉酮的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線（圖4C），EC50分布在2～3 μg/mL 的菌株頻率相對較高。

2.6 煙草青枯病菌對春雷霉素的敏感性

煙草青枯病菌對春雷霉素的敏感性分布范圍相對較寬，EC50為4.157 7～37.628 2 μg/mL，最大EC50與最小EC50之間相差9.05倍，平均EC50為9.927 3 μg/mL（表3）。其中，EC50最大值和最低值的菌株分別來自南豐縣和黎川縣，其他地區(qū)菌株的EC50介于兩者之間。煙草青枯病菌菌株對春雷霉素的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線（圖4E），春雷霉素對大部分供試菌株的EC50分布在4～10 μg/mL之間。

圖4 煙草青枯病菌對不同藥劑的敏感基線Fig.4 Sensitivity baselines of R. solanacearum to different fungicides

2.7 煙草青枯病菌對鏈霉素的敏感性

圖4 結(jié)果表明，煙草青枯病菌對鏈霉素表現(xiàn)敏感，敏感性頻率呈正態(tài)分布，為連續(xù)的單峰曲線，未出現(xiàn)抗藥性亞群體（圖4D）。鏈霉素對煙草青枯病菌的平均EC50為0.546 3 μg/mL，最大值為來自樂安縣的菌株，EC50為1.407 3 μg/mL，最小值來自黎川縣，EC50為0.187 6 μg/mL，大部分菌株的EC50分布在0.3～0.7 μg/mL 范圍內(nèi)（表 3）。與畢濤等［11］和汪瑩［27］的研究相比，他們使用的72%鏈霉素可溶性粉劑均為商品化制劑，且使用的檢測方法為紙碟片法和牛津杯法，與本研究中的檢測方法不同。雖然試驗結(jié)果不具有可比性，但3個試驗結(jié)果均表明鏈霉素對煙草青枯病菌具有較好的抑制活性。

2.8 氟啶胺與納米硫復配對煙草青枯病菌的聯(lián)合毒力

氟啶胺單劑、納米硫溶液單劑、氟啶胺與納米硫按不同比例復配后的組合物對煙草青枯病菌的毒力作用結(jié)果見表4。氟啶胺與納米硫的9 個復配配比對煙草青枯病菌均有抑制作用，EC50分布在0.281 2～6.040 6 μg/mL之間，大于氟啶胺單劑的EC50（0.207 3 μg/mL），但小于納米硫單劑的EC5（017.399 8 μg/mL）。隨著納米硫比例的增加，EC50增大，藥劑敏感性降低。根據(jù)以上單劑和復配組合物對煙草青枯病菌的抑制率，用Wadley 法評價氟啶胺與納米硫復配的聯(lián)合毒力。從表4可見，大部分復配組合物均具有相加作用；當氟啶胺與納米硫按照體積比1∶1復配時，兩者具有拮抗作用，增效系數(shù)為0.270 6，在生產(chǎn)應(yīng)用時不宜采用此復配比例；當氟啶胺與納米硫按體積比1∶40復配時，增效系數(shù)最大，為1.595 5，表明兩者具有增效作用。

表4 氟啶胺與納米硫復配對煙草青枯病菌的聯(lián)合毒力Tab.4 Synergistic toxicity of fluazinam and nano sulfur against R. solanacearum

2.9 氟啶胺與納米銅復配對煙草青枯病菌的聯(lián)合毒力

氟啶胺與納米銅按9個比例進行復配，不同殺菌劑組合物對煙草青枯病菌的EC50分布范圍為0.142 2～7.203 3 μg/mL，均小于納米銅單劑對青枯病菌的EC5（021.479 7 μg/mL），見表5。當氟啶胺與納米銅按體積比1∶1和1∶4復配時，增效系數(shù)小于0.5，說明在此復配比例下，氟啶胺與納米銅表現(xiàn)為拮抗作用；而其余7個復配比例，氟啶胺與納米銅的增效系數(shù)在0.721 4～1.186 7之間，具有相加作用。

表5 氟啶胺與納米銅復配對煙草青枯病菌的聯(lián)合毒力Tab.5 Synergistic toxicity of fluazinam and nano copper against R. solanacearum

2.10 氟啶胺與納米銀復配對煙草青枯病菌的聯(lián)合毒力

從表6 可以看出，氟啶胺與納米銀在不同復配比例下對青枯病菌均有抑制作用，9 種復配殺菌劑組合物對煙草青枯病菌的EC50分布在0.387 3～9.459 6 μg/mL 之間，均小于納米銀單劑對青枯病菌的EC5（015.420 4 μg/mL），大于氟啶胺單劑對青枯病菌的EC50。采用Wadley 方法評價氟啶胺與納米銀的聯(lián)合毒力，當氟啶胺與納米銀按 20 ∶1、4 ∶1、1 ∶1、1 ∶4 比例復配時，具有拮抗作用；當氟啶胺與納米銀按80∶1、40∶1、1∶20、1∶40、1∶80比例復配時，具有相加作用，且當氟啶胺與納米銀1 ∶20 復配時，增效系數(shù)最高，為1.406 7。

表6 氟啶胺與納米銀復配對煙草青枯病菌的聯(lián)合毒力Tab.6 Synergistic toxicity of fluazinam and nano silver against R. solanacearum

3 結(jié)論

①煙草青枯病菌對殺真菌藥劑氟啶胺、雙苯菌胺具有敏感性，平均EC50分別為0.305 0 μg/mL和0.037 8 μg/mL，優(yōu)于對照藥劑鏈霉素（EC500.546 3 μg/mL）。噻霉酮和春雷霉素對煙草青枯病菌的平均EC50分別為2.429 9 μg/mL 和9.927 3 μg/mL，均對煙草青枯病菌具有較好的抑制作用。②氟啶胺與納米硫、納米銅和納米銀在9 種復配比例下的聯(lián)合毒力作用評價結(jié)果表明，最佳復配比例（體積比）分別為1∶40、80∶1和1∶20時具有增效或相加作用。