小檗堿納米制劑的制備及表征研究

蔣蕾，孫旭，劉肖瑩，高楚雅，丁勻喬，彭海生

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

黃連作為常用傳統(tǒng)中藥，具有清熱瀉火、燥濕解毒等功效，其主要活性成分為小檗堿，近年來(lái)對(duì)小檗堿的研究不斷地深入，發(fā)現(xiàn)其在治療心血管疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥及抗菌、抗病毒方面有多種藥理作用［1］，常被用于治療人體胃腸道炎癥［2］。臨床上多以小檗堿鹽酸鹽的形式應(yīng)用，但是溶解度較低，并且小檗堿味道苦澀［3］，生物利用度低和潛在的副作用等，都限制了小檗堿更大范圍的應(yīng)用。因此制備小檗堿納米粒以提高生物利用度和延長(zhǎng)療效是非常有必要，并且有意義的［4］。殼聚糖（chitosan，CS）是一種生物大分子，具有無(wú)毒、黏膜黏附等作用，帶有大量的正電荷，能夠與負(fù)電荷相互結(jié)合發(fā)揮作用［5－6］。有報(bào)道稱，由于CS 能夠改善消化系統(tǒng)中小檗堿的細(xì)胞旁途徑，因此能夠通過(guò)細(xì)胞旁途徑增強(qiáng)小檗堿的吸收［7］。

納米制劑能夠有效控制藥物的釋放，相比其他藥物劑型，此法能夠避免藥物的破碎降解，并且具有良好的靶向性［8］。林愛(ài)華等［9］也以殼聚糖為材料，采用離子凝膠法制備了小檗堿殼聚糖納米粒，但為了工業(yè)化生產(chǎn)，筆者采用離子交聯(lián)法進(jìn)行小檗堿納米制劑的制備，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 試劑

小檗堿（純度≥97%，批號(hào)：J1202A，大連美侖公司）；殼聚糖（批號(hào)：C8320，索萊寶公司）；三聚磷酸鈉（批號(hào)：B1926068，Aladdin 公司）；醋酸（分析純，批號(hào)：20171116，遼寧泉瑞試劑）。

1.2 儀器

精密電子天平（賽多利斯有限公司）；粒徑電位儀（Malvern instruments 公司）；磁力攪拌器（歐萊博公司）；紫外－分光光度計(jì)（南京菲勒儀器）；移液槍（德國(guó)Eooendorf公司）。

2 方法

2.1 小檗堿全波長(zhǎng)掃描及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用紫外－可見分光光度計(jì)進(jìn)行鹽酸小檗堿的全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定其吸收最大值在340～430 nm 之間。精密稱取小檗堿10 mg，定容至100 mL 容量瓶中，配制成0.1 mg/mL 的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密量取100、500、800、1 000、1 200、1 500 μL 將其稀釋至質(zhì)量濃度為1.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0 μg/mL，在345 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各濃度下的吸光度值（A），以A 值對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（C）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 小檗堿與殼聚糖的比例對(duì)粒徑的影響

稱取20 mg的CS粉末緩慢溶于1%的醋酸中，配制成1 mg/mL CS－HAC溶液（pH值=5），通過(guò)0.45 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，除去殘余物。稱取適量的鹽酸小檗堿粉末于蒸餾水中，配成0.5 mg/mL 的鹽酸小檗堿水溶液。通過(guò)磁力攪拌器將二者按照小檗堿/殼聚糖為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6 的比例進(jìn)行混合。稱取適量的三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）固體粉末于燒杯中，配制成1.0 mg/mL STPP 溶液，緩慢地向溶液中滴加，攪拌30 min，測(cè)定各自納米粒的粒徑。

2.3 小檗堿納米粒的制備

采用離子交聯(lián)法制備殼聚糖－鹽酸小檗堿納米粒。稱取20 mg的CS粉末緩慢溶于1%的醋酸中，配制成1 mg/mL CS－HAC 溶液（pH 值= 5），通過(guò)0.45 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，除去殘余物。稱取適量的鹽酸小檗堿粉末于蒸餾水中，配成0.5 mg/mL 的鹽酸小檗堿水溶液。通過(guò)磁力攪拌器將二者混合。稱取適量的STPP 固體粉末于燒杯中，配制成1.0 mg/mL STPP 溶液，緩慢地向溶液中滴加，攪拌30 min。通過(guò)Nano ZS90 型納米粒度儀對(duì)小檗堿納米粒進(jìn)行粒徑、PDI 及電位的測(cè)定。

2.4 小檗堿納米粒的載藥量和包封率

取適量制備好的殼聚糖鹽酸小檗堿水分散體系納米粒于EP管中，5 000 r/min超速離心20 min。在345 nm處測(cè)定上清液的吸光度（A）值。小檗堿納米粒的包封率和載藥量公式如下：

計(jì)算其包封率和載藥量分別為90.91%、8.26%。

2.5 小檗堿納米粒的體外釋放

取2 mL 的殼聚糖－小檗堿納米粒溶液于透析袋中，采用轉(zhuǎn)籃法測(cè)定殼聚糖－小檗堿納米粒的體外釋放，其轉(zhuǎn)速為110 rpm/min，溫度為37 ℃，釋放介質(zhì)為含有1%FBS 的PBS（pH 值=7.4）溶液，采取等量原則分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h 收集釋放液2 mL。取出的釋放液分別在波長(zhǎng)345 nm 處測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值。

2.6 小檗堿納米粒穩(wěn)定性的考察

經(jīng)上述操作制備的殼聚糖－鹽酸小檗堿納米粒放在4 ℃冰箱避光保存，分別于第1、3、5、7、10、20、30 天測(cè)定其粒徑，判斷其穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 小檗堿全波長(zhǎng)掃描及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

小檗堿在345 nm吸收值較好，因此，在此波長(zhǎng)下采用線性回歸方程的方法繪制小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定其吸光度（A）值。結(jié)果，小檗堿在1.0～15.0 μg/mL 具有良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 0.016 9X +0.140 6，R2=0.998 5。見圖1。

圖1 小檗堿全波長(zhǎng)掃描及標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 小檗堿與殼聚糖的比例對(duì)粒徑的影響

藥物與載體的比例對(duì)殼聚糖－小檗堿納米粒粒徑的影響如圖2所示，當(dāng)藥物與載體的比例為1∶1、1∶6時(shí)，未完全形成納米粒，部分藥物以溶液狀態(tài)存在；當(dāng)藥物與載體的比例為1∶2、1∶4時(shí)，形成納米粒，其中當(dāng)藥物與載體的比例為1∶4時(shí)，其粒徑、PDI值較小，平均粒 徑為（178.0 ± 11.4）nm，PDI 值為0.18 ± 0.09。見表2。

圖2 小檗堿與殼聚糖的比例對(duì)粒徑的影響

3.3 小檗堿納米粒的粒徑及電位

采用最佳藥物與載體的比例制備鹽酸小檗堿納米粒，其粒徑及Zeta 電位如圖3 所示，其平均粒徑為（184.8 ± 5.8）nm、PDI 值為0.17 ± 0.02、Zeta 電位為+（23.3±1.8）mV。

表1 小檗堿與殼聚糖的比例對(duì)粒徑的影響（±s）

表1 小檗堿與殼聚糖的比例對(duì)粒徑的影響（±s）

藥物/載體1∶1 1∶2 1∶4 1∶6平均粒徑（nm）618.6±10.5 306.8±9.3 178.0±11.4 450.4±6.9 PDI 0.91±0.13 0.32±0.06 0.18±0.09 0.48±0.11

圖3 小檗堿納米粒粒徑及電位

3.4 小檗堿納米粒的光學(xué)現(xiàn)象觀察

由圖4 可知，右側(cè)給予一束光線后，左側(cè)鹽酸小檗堿溶液未看見一條光亮“通路”，未出現(xiàn)丁達(dá)爾現(xiàn)象；右側(cè)殼聚糖－鹽酸小檗堿納米粒溶液具有丁達(dá)爾現(xiàn)象。

圖4 小檗堿水溶液及小檗堿納米粒水溶液的光學(xué)現(xiàn)象觀察

3.5 小檗堿納米粒的體外釋放

通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)的吸光值計(jì)算累積釋放量，并繪制時(shí)間－累積釋放量圖。從圖5 可知，殼聚糖－小檗堿納米粒在最初的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)有一個(gè)快速釋放的現(xiàn)象，其中0.5 h內(nèi)累積釋放量為（28.86±3.28）%，這可能是由于吸附納米粒表面的藥物釋放所引起的，6 h內(nèi)累積釋放量為（70.52±2.91）%，這一現(xiàn)象有利于藥物能夠快速起效。其中8～24 h均速釋放，24 h內(nèi)累積釋放量為（77.92±2.18）%。

圖5 小檗堿納米粒在PBS溶液37 ℃下的體外累積釋放量

3.6 小檗堿納米粒穩(wěn)定性的考察

從圖6 可知，30 d 內(nèi)小檗堿納米粒粒徑波動(dòng)幅度較小，其平均粒徑大小均在200 nm 左右，說(shuō)明小檗堿納米粒分散均勻，沒(méi)有聚集現(xiàn)象出現(xiàn)。

圖6 小檗堿納米粒水溶液在4 ℃下30 d內(nèi)的穩(wěn)定性

4 討論

小檗堿是中藥黃連的主要活性成分，有著廣泛的藥理作用，如抗炎、抗菌、降壓、降血糖等［10］。隨著對(duì)其藥理作用的研究的深入，其在制劑方面的發(fā)展也越來(lái)越快［3］。小檗堿為黃色針狀結(jié)晶，顏色隨著溫度的變化而變化，具有強(qiáng)堿性，溶于熱水，難溶于乙醇等物理特性［11］。由于水溶性較差，口服利用度較低而限制其應(yīng)用。因此本課題主要通過(guò)制備小檗堿納米制劑來(lái)增加它的應(yīng)用范圍。離子交聯(lián)法是納米粒制備中的一種常用方法［12］，殼聚糖分子中的大量活性氨基在酸性介質(zhì)中可以質(zhì)子化形成多聚陽(yáng)離子電解質(zhì)，因此可以利用殼聚糖分子的正電荷和其他負(fù)電性的分子的靜電作用來(lái)制備納米粒［13］。目前離子交聯(lián)法常用的負(fù)電性分子主要有聚谷氨酸、十二烷基硫酸鈉及三聚磷酸鹽（TPP）等。

本研究利用小檗堿帶有負(fù)電荷、殼聚糖帶有正電荷，在交聯(lián)劑（三聚磷酸鈉）的作用下，采用離子交聯(lián)法制備，將其制備成小檗堿納米粒。研究表明，粒徑大小與藥物和載體的比例有關(guān)［14］，因此，有必要考察藥物與載體比例對(duì)納米粒粒徑的影響。當(dāng)藥物與載體的比例為1∶1 時(shí)，由于比例過(guò)小可能會(huì)導(dǎo)致藥物未能完全包裹在載體內(nèi)，會(huì)有大量藥物呈現(xiàn)游離狀態(tài)存在，未形成小檗堿納米粒，導(dǎo)致粒徑過(guò)大，其平均粒徑為（618.6 ±10.5）nm，PDI平均為0.91±0.13；當(dāng)藥物與載體的比例為1∶6 時(shí)，其平均粒徑為（450.4±6.9）nm，PDI 平均為0.48±0.11，由于比例過(guò)大可能會(huì)由于載體自身聚集形成殼聚糖納米粒，從而影響小檗堿與載體的結(jié)合率且造成經(jīng)濟(jì)方面的浪費(fèi)，所以經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，選定藥物與載體的比例為1∶4，其粒徑、PDI 值較小，平均粒徑為（178.0 ± 11.4）nm，PDI 值為0.18 ± 0.09。本研究成功制備了小檗堿納米制劑，并針對(duì)其進(jìn)行表征，最后得出小檗堿納米制劑，改善了小檗堿藥物本身存在的問(wèn)題，但是本研究存在著一定的不足之處，樣本量較少，同時(shí)也希望在之后的臨床方面能夠盡快得到應(yīng)用。