Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合熵權(quán)法優(yōu)化千金子二萜醇酯類成分的閃式提取工藝

王佩華，張桂梅，王慧楠，楊子燁，陳夢雨，姜明瑞，岳珠珠，王志成，張婧秋，王英姿

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京102488)

千金子為大戟科植物續(xù)隨子(EuphorbialathyrisL.)的干燥成熟種子[1]，含有脂肪油、二萜、甾醇、黃酮、香豆素、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[2]。二萜醇酯類化合物是其主要活性成分，具有瀉下逐水、祛斑美白、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種藥理作用，其中千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3是含量相對較高且具有顯著藥理活性的二萜醇酯類成分[3-4]。千金子二萜醇酯類成分的傳統(tǒng)提取方法主要有回流提取法、冷浸提取法和超聲提取法等，這些方法存在有效成分富集效率低、試劑用量大、耗時繁瑣等缺點(diǎn)[5-7]。而閃式提取法具有提取快速、無需加熱、有效成分損失少等優(yōu)點(diǎn)，廣泛適用于中藥根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等的提取[8-9]，目前未見閃式提取千金子二萜醇酯類成分的報(bào)道。

響應(yīng)面法是一種綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，將因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多元二次回歸多項(xiàng)式方程近似擬合，可有效指導(dǎo)工藝參數(shù)的優(yōu)化[10-11]。熵權(quán)法是一種確定指標(biāo)權(quán)重的客觀賦權(quán)法，可用于確定多指標(biāo)評價系統(tǒng)中各指標(biāo)權(quán)重[12-13]。2020版《中華人民共和國藥典》對千金子中千金子甾醇(即千金子素L1)的含量進(jìn)行了規(guī)定[1]，因此，作者選用千金子中主要的二萜醇酯類成分千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3為指標(biāo)成分，以料液比(g∶mL，下同)、提取時間、提取電壓為考察因素，通過Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合熵權(quán)法對千金子二萜醇酯類成分的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為千金子二萜醇酯類成分的提取提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

千金子藥材，購自安徽亳州，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為大戟科植物續(xù)隨子(EuphorbialathyrisL.)的干燥成熟種子。

千金子素L1對照品(批號111789-200901)、千金子素L2對照品(批號111790-200901)、千金子素L3對照品(批號111791-200901)，純度均大于98%，中國藥品生物制品檢定所；甲醇，質(zhì)譜純，F(xiàn)isher公司；乙醇，化學(xué)純，北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司。

閃式提取器，北京金鼎科技發(fā)展有限公司；高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；BSI10型萬分之一電子天平，德國Sartorius。

1.2 千金子二萜醇酯類成分的提取

精密稱取一定量的千金子加入閃式提取器中，在一定條件下提取，減壓抽濾，收集濾液，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中定容至刻度，即得提取液。

1.3 千金子二萜醇酯類成分含量的測定

1.3.1 對照溶液的配制

分別精密稱取千金子素L1對照品5.13 mg、千金子素L2對照品5.12 mg、千金子素L3對照品5.08 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得1.026 mg·mL-1千金子素L1、1.024 mg·mL-1千金子素L2、1.016 mg·mL-1千金子素L3的對照儲備液，臨用前用甲醇稀釋成相應(yīng)濃度的對照溶液。

1.3.2 供試溶液的配制

精密量取提取液0.5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液作為供試溶液。

1.3.3 色譜條件

ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫程序：0～5 min，75%A；5～35 min，75%～70%A；35～45 min，70%～85%A；45～60 min，85%～90%A；60～65 min，90%～75%A；檢測波長275 nm；流速1 mL·min-1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

各對照溶液及供試溶液的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 千金子素L1對照溶液(a)、千金子素L2對照溶液(b)、千金子素L3對照溶液(c)及供試溶液(d)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of standard solution of euphorbia factor L1(a),euphorbia factor L2(b) and euphorbia factor L3(c)，and test solution(d)

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，以料液比、提取時間、提取電壓為考察因素，以提取液中千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3通過熵權(quán)法計(jì)算的綜合評分(Y)為響應(yīng)值。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.5 綜合評分的計(jì)算

采用熵權(quán)法計(jì)算指標(biāo)的權(quán)重，先將各指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，根據(jù)公式(1)計(jì)算第j個指標(biāo)的信息熵Ej，根據(jù)公式(2)計(jì)算j指標(biāo)的權(quán)重Wj，再根據(jù)公式(3)計(jì)算j指標(biāo)的綜合評分Y。

(1)

(2)

Y=千金子素L1的提取率×千金子素L1的權(quán)重+千金子素L2的提取率×千金子素L2的權(quán)重+千金子素L3的提取率×千金子素L3的權(quán)重

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系

分別精密移取適量各對照儲備液，加甲醇稀釋成6個濃度的對照溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析。以對照溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合結(jié)果如表2所示。

表2 千金子素L1、千金子素L2 、千金子素L3的線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of euphorbia factor L1,euphorbia factor L2，and euphorbia factor L3

由表2可知，各成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度

精密移取千金子素L1對照儲備液1.500 mL、千金子素L2對照儲備液0.625 mL、千金子素L3對照儲備液1.250 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得0.308 mg·mL-1千金子素L1、0.128 mg·mL-1千金子素L2、0.254 mg·mL-1千金子素L3的混合對照溶液，按1.3.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3峰面積的RSD值分別為0.26%、1.20%、1.08%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性

取同一供試溶液6份，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析，測得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3的平均提取率分別為0.49%、0.19%、0.43%，RSD值分別為1.90%、2.55%、1.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性

取同一供試溶液，分別室溫放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析，測得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3峰面積的RSD值分別為0.30%、0.29%、0.20%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率

取已知含量的供試溶液6份各0.25 mL，按千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3含量的100%水平精密加入混合對照溶液0.25 mL，按1.3.2方法制備供試溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析，測得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3的平均加標(biāo)回收率分別為103.22%、98.33%、97.76%，RSD值分別為1.22%、0.75%、1.14%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(表3)

表3 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Design and results of Box-Behnken response surface methodologies

2.2.2 回歸模型方程與方差分析

通過Design-Expert 10.0軟件對表3中的綜合評分進(jìn)行多元二次回歸擬合，得回歸模型方程：Y=-5.36757+0.20140A+0.027576B+0.066837C+0.00741401AB-0.000814960AC-0.000461503BC-0.00409654A2-0.013082B2-0.000210412C2。對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 回歸模型的方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

利用Design-Expert 10.0軟件根據(jù)模型繪制各因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)面圖與等高線圖，如圖2所示。

響應(yīng)面和等高線可以直觀形象地反映各因素的交互作用，響應(yīng)面越陡峭，說明兩因素的交互作用越顯著[15]；等高線的形狀越趨于橢圓說明交互作用越顯著，越趨于圓形說明交互作用越不顯著[16]。由圖2可知，料液比與提取電壓的響應(yīng)面最陡峭，且等高線呈橢圓形，表明料液比與提取電壓的交互作用對千金子二萜醇酯類成分提取率的影響最顯著；其次是料液比與提取時間的響應(yīng)面較陡峭，表明料液比與提取時間的交互作用對千金子二萜醇酯類成分提取率有一定程度的影響；而提取時間與提取電壓的響應(yīng)面最平緩，表明提取時間與提取電壓的交互作用對千金子二萜醇酯類成分提取率的影響不顯著。

圖2 各因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between each factor on comprehensive score

根據(jù)Design-Expert 10.0軟件優(yōu)化分析得到千金子二萜醇酯類成分的最佳閃式提取工藝為：料液比1∶14.021(g∶mL)、提取時間2.5 min、提取電壓128.932 V，此條件下，3種二萜醇酯類成分提取率綜合評分的預(yù)測值為0.396。

2.2.4 最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于儀器精度等條件的限制，將最佳閃式提取工藝調(diào)整為：料液比1∶14(g∶mL)、提取時間2.5 min、提取電壓130 V，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到3種二萜醇酯類成分提取率綜合評分的平均值為0.370(RSD=0.412%)，證明該模型選擇合理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想。

3 結(jié)論

采用Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合熵權(quán)法對千金子二萜醇酯類成分的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為：料液比1∶14(g∶mL)、提取時間2.5 min、提取電壓130 V，在此條件下，3種二萜醇酯類成分提取率的綜合評分為0.370，與模擬預(yù)測值(0.396)接近。閃式提取方法簡便、節(jié)能、省時，可應(yīng)用于千金子主要二萜醇酯類成分的快速提取，對二萜醇酯類成分的深入研究及千金子的開發(fā)利用具有十分重要的意義。