郭夢雅 湯吉偉 張芙蕊 李和平

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

鹿肉作為高蛋白、低脂肪、高礦物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)肉類代表受到眾多消費(fèi)者追捧[1]，我國有關(guān)鹿的研究大都集中在鹿茸角的再生與生長發(fā)育方面，而對鹿肉性能、肉質(zhì)方面的基礎(chǔ)理論研究較為缺乏。目前，許多影響肉質(zhì)性狀的主效基因和候選基因已經(jīng)成功地在肉用畜禽中發(fā)現(xiàn)，并在選種選育、優(yōu)良品種培育的實(shí)踐應(yīng)用中取得了良好效果[2]。開發(fā)鹿肉制品已然成為養(yǎng)鹿產(chǎn)業(yè)新形勢下的新發(fā)展戰(zhàn)略。

脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白(iLBP)家族中的一類同源性較高且可與長鏈脂肪酸特異性結(jié)合的可溶性蛋白質(zhì)，對動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸起到關(guān)鍵作用[3]。其在脂質(zhì)代謝活躍的組織中表達(dá)，廣泛分布于動(dòng)物的心肌、肝、肺、皮下脂肪、骨骼肌等多種組織細(xì)胞內(nèi)，對動(dòng)物肌內(nèi)脂肪沉積和體內(nèi)脂肪代謝有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。H-FABP和E-FABP基因是脂肪酸結(jié)合蛋白基因家族的重要成員，是評價(jià)肉質(zhì)的重要參考基因。H-FABP，即脂肪酸結(jié)合蛋白3，最早發(fā)現(xiàn)于小腸黏膜、肝和心臟等組織細(xì)胞漿中，能夠通過調(diào)控脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和沉積，進(jìn)而增加機(jī)內(nèi)脂肪含量，改善肌肉嫩度[5]。Shang et al.[6]研究發(fā)現(xiàn)，藏豬體內(nèi)肌內(nèi)脂肪含量高于大白豬，H-FABP基因在藏豬背最長肌、肝臟等組織中的表達(dá)量顯著高于大白豬；E-FABP，即脂肪酸結(jié)合蛋白5，最初是從牛皮癬相關(guān)蛋白中鑒定出，所以也被稱為牛皮癬蛋白基因[7]，研究表明E-FABP蛋白在對抗脂質(zhì)氧化損傷過程中發(fā)揮重要作用，能凈化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，具有類似于消炎藥的特性[8]。H-FABP和E-FABP基因被認(rèn)為是影響肌內(nèi)脂肪沉積的重要候選基因。

為探索脂肪酸結(jié)合蛋白基因在鹿機(jī)體不同組織中的表達(dá)及其差異，本研究欲以雄、雌性梅花鹿和雌性馬鹿為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以鹿的心、肝、肺、背最長肌、肋間肌、臀大肌、股四頭肌和皮下脂肪8種組織樣品為試驗(yàn)材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測H-FABP、E-FABP基因編碼蛋白在各組織中的表達(dá)量并分析其差異，在分子水平闡明脂肪酸結(jié)合蛋白基因在鹿機(jī)體不同組織中的表達(dá)及其差異，得出鹿不同組織脂肪沉積與代謝規(guī)律，并結(jié)合前人在牛、羊、豬等家禽家畜中的研究結(jié)果予以對比分析，為鹿肉品質(zhì)研究與鹿肉開發(fā)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019年5月在吉林省世鹿鹿業(yè)采集4～5歲成年雄性梅花鹿4頭、雌性梅花鹿4頭、雌性馬鹿3頭，共11頭鹿88份組織樣品。按照屠宰規(guī)程，鹿只屠宰過程中采集背最長肌、肋間肌、股四頭肌、臀大肌、心(乳頭肌)、肝(左葉)、肺(右肺上葉)和皮下脂肪8個(gè)部位組織，裝于凍存管中，置于液氮中-196 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

按OMEGA公司總RNA提取試劑盒Total RNA Kit II說明書提取樣品總RNA。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果、RNA濃度以及OD值來綜合分析所提取RNA的質(zhì)量和完整性，將提取的總RNA置于冰箱-80 ℃保存。按照PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(TaKaRa)對樣品總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，總反應(yīng)體系20.0 μL，反應(yīng)條件為：42 ℃ 2 min、37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于冰箱-20 ℃保存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中白尾鹿的H-FABP、E-FABP和β-actin內(nèi)參團(tuán)基因的序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)梅花鹿、馬鹿的H-FABP、E-FABP基因熒光定量引物，引物信息如表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

以上述cDNA為模板，β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測H-FABP、E-FABP基因在4頭雄性梅花鹿、4頭雌性梅花鹿和3頭雌性馬鹿的背最長肌、肋間肌、股四頭肌、臀大肌、心、肝、肺和皮下脂肪組織中的表達(dá)量變化。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye or Dye II 0.4 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性階段95 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)階段95 ℃ 5 s和60 ℃ 34 s；熔解曲線階段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，之后以每0.5 ℃ 10 s的速率從60 ℃上升到95 ℃。每個(gè)組織每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因?qū)-FABP、E-FABP基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量，均以雄性梅花鹿肺組織表達(dá)量為1做參照，得出在各組織中的相對表達(dá)量，并以此比較其差異。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用ABI 7 500 software軟件計(jì)算定量所有目的基因和β-actin基因的平均拷貝數(shù)，然后用2-ΔΔCt法計(jì)算不同基因在不同組織中mRNA的相對表達(dá)量。使用SPSS Statistics 24.0軟件對熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取

總RNA提取電泳圖的28 S、18 S、5.8 S條帶清晰無拖帶，且28 S條帶亮度接近18 S的2倍。且用移液器吸取1 μL總RNA在超微量分光光度計(jì)檢測顯示，OD260與OD280比值均在1.9～2.0，質(zhì)量濃度均在800 mg·L-1左右?？傊鹘M織中的總RNA完整且濃度和純度合格，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 擴(kuò)增曲線與溶解曲線

H-FABP、E-FABP基因和內(nèi)參基因β-actin擴(kuò)增曲線基線平整，拐點(diǎn)清晰，呈S型且指數(shù)期明顯，符合試驗(yàn)要求；溶解曲線峰值單一且重合性較好，表明引物沒有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的引物二聚體，引物特異性良好。綜上分析，熒光擴(kuò)增效率良好，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)可靠，能正確表示3種基因的mRNA表達(dá)情況。

H-FABP基因在鹿不同組織中的mRNA相對表達(dá)量見表2。H-FABP基因在雄、雌性梅花鹿和雌性馬鹿的不同組織中均有表達(dá)，不同組織中的表達(dá)量存在差異。

表2 H-FABP基因在鹿不同組織中mRNA的相對表達(dá)量

雄性梅花鹿H-FABP基因mRNA的表達(dá)量由高到低的順序?yàn)椋盒摹⒐伤念^肌、背最長肌、臀大肌、肋間肌、皮下脂肪、肺、肝。其中，H-FABP基因在心的mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)；在肺、肝的表達(dá)量顯著低于其他組織(P<0.05)，肺、肝之間差異不顯著；股四頭肌、臀大肌、背最長肌之間差異不顯著；背最長肌、肋間肌、臀大肌、皮下脂肪之間差異不顯著。雌性梅花鹿H-FABP基因mRNA的表達(dá)量由高到低的順序?yàn)椋盒摹⑼未蠹?、肋間肌、股四頭肌、背最長肌、皮下脂肪、肺、肝。其中，H-FABP基因在心的mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)；在肺、肝、皮下脂肪中的表達(dá)量顯著低于其他組織(P<0.05)，肺、肝、皮下脂肪之間差異不顯著(P>0.05)；臀大肌、肋間肌之間差異不顯著；肋間肌、背最長肌、股四頭肌之間差異不顯著。雌性馬鹿H-FABP基因mRNA的表達(dá)量由高到低的順序?yàn)椋盒?、臀大肌、皮下脂肪、背最長肌、股四頭肌、肋間肌、肺、肝。其中，H-FABP基因在心的mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)；在肝的表達(dá)量顯著低于其他組織(P<0.05)；臀大肌、皮下脂肪、背最長肌、股四頭肌之間差異不顯著(P<0.05)；皮下脂肪、背最長肌、股四頭肌、肋間肌、肝之間差異不顯著；肺、肝之間差異不顯著?？傮w來看，H-FABP基因在心中mRNA表達(dá)量最高，其次為肌肉組織，然后為脂肪組織，在肺和肝中表達(dá)量最低。

在肺、肝、背最長肌、臀大肌4種組織中，H-FABP基因在雄、雌性梅花鹿、雌性馬鹿mRNA的表達(dá)量無顯著差異；在心中，雄性梅花鹿和雌性梅花鹿的表達(dá)量顯著高于雌性馬鹿(P<0.05)；在肋間肌中，雄性梅花鹿和雌性梅花鹿的表達(dá)量顯著高于雌性馬鹿(P<0.05)；在股四頭肌中，雄性梅花鹿的表達(dá)量顯著高于雌性梅花鹿和雌性馬鹿(P<0.05)；在皮下脂肪中，雌性馬鹿的表達(dá)量顯著高于雌性梅花鹿(P<0.05)。

E-FABP基因在鹿不同組織中的mRNA相對表達(dá)量見表3。E-FABP基因在雄、雌性梅花鹿和雌性馬鹿的不同組織中均有表達(dá)，不同組織中的表達(dá)量存在差異。

表3 E-FABP基因在鹿不同組織中mRNA的相對表達(dá)量

雄性梅花鹿E-FABP基因mRNA的相對表達(dá)量由高到低的順序?yàn)椋浩は轮尽⒐伤念^肌、背最長肌、肺、臀大肌、肋間肌、心、肝。其中，E-FABP基因在皮下脂肪、股四頭肌、背最長肌、肺中mRNA表達(dá)量較高且差異顯著(P<0.05)；心、肝之間的表達(dá)量差異不顯著，且心和肝的表達(dá)量顯著低于其他組織(P<0.05)；臀大肌、肋間肌之間的差異不顯著。雌性梅花鹿E-FABP基因mRNA的相對表達(dá)量由高到低的順序?yàn)椋浩は轮尽⒈匙铋L肌、肺、肋間肌、股四頭肌、心、臀大肌、肝。其中，E-FABP基因在皮下脂肪中mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)；在肝、臀大肌的表達(dá)量顯著低于其他組織(P<0.05)；心、背最長肌之間差異不顯著；肺、肋間肌、股四頭肌之間差異不顯著。雌性馬鹿E-FABP基因mRNA的相對表達(dá)量由高到低的順序?yàn)椋浩は轮尽⒎?、股四頭肌、背最長肌、肋間肌、心、肝、臀大肌。其中，E-FABP基因在脂肪組織中mRNA的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)；肝、臀大肌表達(dá)量顯著低于其他組織(P<0.05)；肺、股四頭肌之間差異不顯著；肋間肌、心之間差異不顯著；心、肝、臀大肌之間差異不顯著?？傮w來看，E-FABP基因在鹿的皮下脂肪組織中mRNA表達(dá)量最高，其次為肺、背最長肌、肋間肌、股四頭肌和心，在肝和臀大肌中表達(dá)量最低。

在肋間肌中，E-FABP基因在雄、雌性梅花鹿、雌性馬鹿mRNA的表達(dá)量無顯著差異；在肺中，雌性馬鹿的表達(dá)量顯著高于雄性梅花鹿、雌性梅花鹿(P<0.05)，雄性梅花鹿的表達(dá)量顯著高于雌性梅花鹿；在心中，雌性馬鹿的表達(dá)量顯著高于雄、雌性梅花鹿(P<0.05)；在肝中，雌性馬鹿的表達(dá)量顯著高于雄、雌性梅花鹿(P<0.05)；在背最長肌中，雄性梅花鹿的表達(dá)量顯著高于雌性梅花鹿和雌性馬鹿(P<0.05)；雌性馬鹿的表達(dá)量顯著高于雌性梅花鹿；在臀大肌中，雄性梅花鹿的表達(dá)量顯著高于雌性梅花鹿、雌性馬鹿(P<0.05)；在股四頭肌中，雄性梅花鹿、雌性馬鹿的表達(dá)量顯著高于雌性梅花鹿；在皮下脂肪中，雄性梅花鹿、雌性馬鹿的表達(dá)量顯著高于雌性梅花鹿。

3 結(jié)論與討論

本研究選取梅花鹿和馬鹿的不同組織為試驗(yàn)材料，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)來檢測H-FABP、E-FABP基因在鹿不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示：H-FABP、E-FABP基因在鹿不同組織中均有表達(dá)，且存在顯著性差異。H-FABP基因主要分布的組織為心、背最長肌、肋間肌臀大肌和股四頭肌。E-FABP基因主要分布的組織為皮下脂肪、肺、背最長肌、肋間肌和股四頭肌。H-FABP、E-FABP基因的表達(dá)量高低與鹿的性別、種類有關(guān)。

H-FABP基因在組織器官的能量供應(yīng)、脂肪合成過程中作用顯著，是影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因之一。文力正和喬海云、康康等[9-11]在研究中均發(fā)現(xiàn)H-FABP基因的多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量有顯著的相關(guān)性。郝稱莉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，不同月齡H-FABP基因在湖羊不同部位表達(dá)量有明顯差異，且該基因?qū)?nèi)脂肪沉積有積極作用。由此表明H-FABP基因可以作為選種選育的候選基因。錢成[13]對貴州白山羊H-FABP基因在9個(gè)組織中表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，H-FABP基因在心和股二頭肌表達(dá)較高，肝臟中表達(dá)量最低。喬云海等[10]研究發(fā)現(xiàn)H-FABP基因在不同組中均有表達(dá)，其中心臟和骨骼肌中表達(dá)量較高，其次為肝臟、脾、腎，在肺中表達(dá)量最低。本研究結(jié)果與上述前人研究結(jié)果一致。

李平等[14]研究發(fā)現(xiàn)H-FABP基因在放養(yǎng)型宗地花豬背最長肌的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，在圈養(yǎng)型宗地花豬腰大肌表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)。本研究結(jié)果與該結(jié)果不同，分析可能是由于宗地花豬與雌、雄梅花鹿和雌性馬鹿的飼養(yǎng)水平、飼養(yǎng)模式不同。趙雪[15]研究H-FABP基因在杜泊羊與小尾寒羊的雜交羊不同組織中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，該基因在雜交羊腿部肌肉表達(dá)量最高，其次為半腱肌和心，在脾、腎、十二指腸等組織表達(dá)量低。本研究結(jié)果與該結(jié)果不同，分析可能是由于物種差異導(dǎo)致，雜交羊旨在選育優(yōu)良物種，小尾寒羊高腿，杜泊羊產(chǎn)肉繁殖性能良好，所以二者雜交羊股四頭肌的H-FABP基因的表達(dá)量高，使肌內(nèi)脂肪含量變高，肉質(zhì)更加美味，由此推測H-FABP基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)，具體情況還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

E-FABP基因在國內(nèi)的研究大多集中于醫(yī)學(xué)方面，如代謝綜合征、細(xì)胞癌變、糖尿病等。Ma[16]在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)A-FABP基因敲除時(shí)，E-FABP基因表達(dá)上調(diào)，對其產(chǎn)生補(bǔ)償效應(yīng)，從而使脂肪組織正常發(fā)育，保持脂類代謝的穩(wěn)定，如果缺乏E-FABP基因，在軸突外生長時(shí)期，磷脂膜將無法合成必須的脂肪酸基質(zhì)。由此可見E-FABP基因與動(dòng)物的生長和脂肪代謝有密切關(guān)系。

分析豬轉(zhuǎn)錄組[17]的研究發(fā)現(xiàn)，E-FABP基因在豬脂肪組織的表達(dá)量最高，在肝臟組織中的表達(dá)量最低。李寶鈞等[18]對綿羊不同組織E-FABP基因的mRNA表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)E-FABP基因在綿羊脂肪組織中表達(dá)量最高，在肝臟中表達(dá)量最低，顯著低于心臟、肌肉組織(P<0.05)。本研究結(jié)果與以上結(jié)果基本一致，可推斷皮下脂肪組織是E-FABP基因的主要表達(dá)組織。另一方面E-FABP基因在人、豬、小鼠、綿羊的脂肪組織中均有較高的mRNA表達(dá)，由此推測E-FABP基因可能在不同物種的皮下脂肪組織功能一致，具有保守性。

肌內(nèi)脂肪含量是評價(jià)肉質(zhì)高低的重要指標(biāo)，H-FABP基因是影響肌內(nèi)脂肪含量的重要參考基因之一，而E-FABP基因作為一種補(bǔ)償基因存在，作用同樣不可忽視。Gui et al.[19]對409頭中國牦牛進(jìn)行H-FABP基因SNP位點(diǎn)檢測研究中發(fā)現(xiàn)，H-FABP基因多態(tài)性與牦牛體重、體長存在顯著相關(guān)性。于佳慧[20]采用PCR-SSCP和測序的方法檢測京海黃雞E-FABP基因不同片段的多態(tài)性，結(jié)果表明P1突變位點(diǎn)基因型對京海黃雞脛圍有極顯著影響，P74突變位點(diǎn)基因型對京海黃雞的腹脂率有極顯著影響，對胸肌重有顯著影響。以上兩人研究結(jié)果表明，H-FABP、E-FABP基因的多態(tài)性與家畜家禽肉質(zhì)性狀存在相關(guān)性。迄今為止，H-FABP基因已被證明可以作為肌內(nèi)脂肪含量的候選基因，在基因克隆測序和多態(tài)性分析等方面研究較為深入，但該基因具體功能及其調(diào)控機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步探究；E-FABP基因在家禽家畜上的研究較少，僅在雞、鴨等家禽上有研究證明該基因與腹脂率、胸肌重和體尺性狀等方面有影響。由此推測，在鹿的育種工作中可將H-FABP、E-FABP基因作為作為肌肉間脂肪的候選基因，這對深入了解鹿體內(nèi)脂肪組織的生長發(fā)育機(jī)理、提高鹿肉肌肉間脂肪的含量以及控制多余脂肪沉積有重要意義。通過現(xiàn)代分子檢測手段充分探究二者鹿機(jī)體內(nèi)的表達(dá)情況，可以有效的改善鹿肉的產(chǎn)品品質(zhì)，培育優(yōu)良品種，對改善人們的生活質(zhì)量具有重要意義。