β-乳球蛋白對VE熱穩(wěn)定性的影響

李 萌，康佳欣，寧雪楠，魏子凱，廖敏和，巨歡歡，辛秋艷，劉 寧,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江辰鷹乳業(yè)有限公司，黑龍江 嫩江 161499）

VE是一種脂溶性的微量營養(yǎng)素，包括α-、β-、γ-和δ-生育酚和相應三烯生育酚，具有抗氧化[1]、抗衰老[2]、促進細胞代謝[3]、促進脂肪吸收[4]、預防心血管疾病[5]、預防老年阿爾茲海默癥[6]等作用。VE攝入不足會導致人體免疫力下降，代謝失常[7]。牛乳作為一種富含多種微量營養(yǎng)素和生物活性成分的營養(yǎng)食品，是提供VE的良好來源[8-9]，將VE添加到牛乳中制備營養(yǎng)強化乳，能夠提高牛乳的營養(yǎng)價值，滿足人體對VE的需求。許多乳制品在生產(chǎn)過程中需要經(jīng)過超高溫滅菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）等熱處理，這導致乳中的VE發(fā)生熱降解[10-12]，因此，需要尋找一種載體保護乳中的VE免受熱處理的影響。

已有研究表明β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）可作為維生素的載體。Futterman等[13]在1972年首次提出β-LG可與VA結合，結合位點位于β-LG花萼形狀的疏水孔內，當VA近于疏水孔底部時，通過氫鍵和疏水相互作用形成復合物[14]。Mensi等[15]也證實了VA在β-LG疏水孔內結合，與類胡蘿卜素的結合位點不同。β-LG可以與其他的脂溶性維生素結合，如VD3[16]和VK[17]；也可與一些水溶性的維生素結合，如VB12[18]、葉酸和抗壞血酸[17]，β-LG與葉酸結合后可延緩葉酸的光降解[19]。以上研究表明β-LG作為維生素的載體可靠，因此可以用β-LG作為VE的保護載體。

生物膜干涉技術是一種分析分子之間是否存在結合以及結合程度的技術，具有分辨率高、速度快、結果精準等優(yōu)點[19-21]。它將生物分子固定在光纖生物傳感器的底端形成一層生物膜，當一束可見光穿過生物膜時，在傳感器底端光學膜層的兩個界面會形成兩束反射光譜，疊加形成一束干涉光譜，分析物與生物分子通過相互作用結合后會導致傳感器底端生物膜厚度發(fā)生變化，干涉光譜發(fā)生相對位移，若兩個分子之間發(fā)生相對位移則證明兩者之間存在結合[22]。生物膜干涉技術通過傳感器的連續(xù)上機檢測聯(lián)合結合速率Ka與解離速率Kd計算得到親和力常數(shù)KD，KD值越小則說明分子之間結合程度越高，由此直接判斷分子之間的結合程度[23]。目前，生物膜干涉技術廣泛用于分析蛋白與蛋白、蛋白與核酸、蛋白與脂質之間的相互作用[24]，但在β-LG與維生素之間相互作用的研究鮮見報道。

本研究以β-LG和VE為材料制備復合物。采用濁度、粒徑、Zeta電位、掃描電子顯微鏡、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、紅外光譜和熒光光譜分析β-LG與VE結合情況；利用生物膜干涉技術獲得β-LG與VE之間的親和力常數(shù)，以確定兩者之間的結合程度；使用高效液相色譜法分析普通強化乳（添加VE）和復合物強化乳（添加β-LG/VE復合物）中VE的熱損失率，探究β-LG對VE熱穩(wěn)定性的影響，以期為用于維生素強化乳制品中提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

VE（純度＞97%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-LG（純度90%） 上海源葉生物科技有限公司；生牛乳樣品 哈爾濱市宏有牧業(yè)有限責任公司。

氫氧化鈉、鹽酸、氫氧化鉀、2,6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、抗壞血酸、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4）、無水乙醇、乙醚、無水硫酸鈉、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（均為分析純） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 德國CNW公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；生物素化試劑EN-Link NHSPEG12-Biotin（21312）、Zeba脫鹽離心柱（89889）美國Thermo Fisher公司；SA鏈霉親和素傳感器 美國ForteBio公司；吐溫-20 廣州賽國生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

BSA124S-CW分析天平、pH計 德國Sartorius公司；恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；SCIENTZ-18ND冷凍干燥機 寧波新芝凍干設備股份有限公司；U3000高效液相色譜儀、Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；UV-2600/2700紫外分光光度計 日本島津公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；TM 3000掃描電子顯微鏡 日本日立公司；DYY-10C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；RF-5301PC熒光分光光度計 日本Island Ferry公司；Octet RED96分子互作分析系統(tǒng) 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1β-LG/VE復合物的制備

用蒸餾水制備0.5 mg/mL的β-LG溶液，室溫攪拌2 h，4 ℃過夜保存直至完全溶解，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至7.0，待用。將VE溶于無水乙醇中，制備4 種不同質量濃度的VE溶液（5、10、20、40 mg/mL）。將β-LG溶液與VE溶液按質量比95∶5均勻混合，制備4 種VE質量濃度的復合物，室溫攪拌2 h，直至反應完全。用冷凍干燥機（－50 ℃、10 Pa）進行凍干，4 ℃密閉容器保存。

1.3.2β-LG/VE復合物中VE含量的測定

參照GB 5009.82—2016 《食品中維生素A、D、E的測定》中反相高效液相色譜法測定VE的含量[25]。稱取0.001 0 g樣品于150 mL錐形瓶中加20 mL水混勻，再加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻后加入30 mL無水乙醇和15 mL氫氧化鉀溶液（質量分數(shù)50%），邊加邊振搖，于80 ℃恒溫水浴振蕩皂化30 min，皂化后立即冷卻至室溫。將皂化液轉移至分液漏斗中，用石油醚-乙醚混合液（1∶1，V/V）振蕩萃取。將醚層經(jīng)無水硫酸鈉濾入250 mL旋轉蒸發(fā)瓶中，于40 ℃水浴中蒸餾，待醚液剩約2 mL時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹干。用甲醇溶解瓶中殘留物并轉移至10 mL容量瓶中，定容。溶液過0.22 μm有機系濾膜，待測。

高效液相色譜條件：色譜柱為C30柱（250 mm×4.6 mm，3 μm）；柱溫20 ℃；流動相：A為水，B為甲醇，洗脫梯度見表1；流速0.8 mL/min；波長294 nm；進樣量10 μL。

表1 洗脫梯度條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3 濁度的測定

準確稱取一定量的VE和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物，分別溶解在10 mL PBS中，用來制備VE溶液和β-LG/VE復合物溶液，具體添加量見表2。每列中VE添加量與對應復合物所含VE的量相同（復合物所含VE的量為1.3.2節(jié)中的測定含量），以保證VE溶液與復合物溶液中的VE含量相同。使用紫外分光光度計在500 nm波長處測定4 種VE溶液和4 種復合物溶液的吸光度，用PBS作為空白，測定溫度為25 ℃，每個樣本測量3 次。濁度計算公式如下：

式中：T為濁度；A為吸光度。

表2 濁度測定液中VE及其復合物的添加量Table 2 Concentrations of VE and its complex in turbidity measurement solution

1.3.4 粒徑和Zeta電位的測定

VE溶液和β-LG/VE復合物溶液的制備方法同1.3.3節(jié)。使用Mastersizer 2000激光粒度儀測定4 種VE溶液和4 種復合物溶液的平均粒徑和Zeta電位，折光率為1.33，在25 ℃條件下，每個樣品測量3 次。

1.3.5 掃描電子顯微鏡

使用掃描電子顯微鏡觀察β-LG和40 mg/mL VE質量濃度制備的復合物微觀結構。將樣品噴一層20 nm厚的金粉，在電壓5 kV和放大倍數(shù)500 倍條件下觀察樣品。

1.3.6 SDS-PAGE分析

使用SDS-PAGE法檢測β-LG和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的分子質量。制備蛋白質量濃度為1 mg/mL的β-LG和4 種β-LG/VE復合物溶液，與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，待用。按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒的方法制備15%分離膠和5%濃縮膠。上樣體積為10 μL，電壓為80 V，待樣品進入分離濃縮膠后，將電壓調整為120 V。

1.3.7 紅外光譜分析

使用傅里葉變換紅外光譜儀對β-LG和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物進行測定。將1 mg樣品與150 mg溴化鉀粉末混合后壓片，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.8 熒光光譜分析

用PBS制備蛋白質量濃度為0.2 mg/mL的β-LG和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物溶液。使用熒光分光光度計測β-LG和4 種β-LG/VE復合物的熒光強度，狹縫寬度為10 nm，掃描波長在300～500 nm之間，激發(fā)波長為280 nm。

1.3.9 生物膜干涉技術

1.3.9.1 固化物和分析物的制備

將1 mg EN-Link NHS-PEG12生物素化試劑溶于0.106 mL DMSO中，制備濃度為10 mmol/L的生物素化試劑母液。將500 μL 500 μg/mL的β-LG原液（0.01 mol/L PBS）與10 μL生物素化試劑母液混合。在25 ℃條件下，反應混合物孵育30 min后，使用Zeba脫鹽離心柱將進行離心脫鹽處理以去除未反應的生物素（1 000×g離心2 min），收集離心后的蛋白作為固化物，待用。樣品PBST（0.01 mol/L PBS＋0.02%吐溫-20）作為分析物稀釋液。將40 mg VE溶于1 mL PBST中制備分析物（40 mg/mL），隨后進行梯度稀釋為5、10、20、40 mg/mL，待用。

1.3.9.2 上機實驗

將SA鏈霉親和素傳感器在PBS中預濕至少10 min。第1步，傳感器在PBS中平衡60 s；第2步，傳感器與固化物結合300 s；第3步，傳感器在PBST中平衡120 s；第4步，傳感器轉入分析物中，使固化物與分析物結合60 s；第5步，傳感器轉入PBST中解離60 s。根據(jù)上機測量出的結合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)計算親和力常數(shù)，計算公式如下：

式中：KD為親和力常數(shù)/（mol/L）；Ka為結合速率常數(shù)/（L/（mol·s））；Kd為解離速率常數(shù)/s-1。

1.3.10 普通強化乳和復合物強化乳的制備

根據(jù)中國居民膳食營養(yǎng)素每日參考攝入量，制備的普通強化乳中加入VE（8 mg/100 g），制備的復合物強化乳中加入40 mg/mL VE質量濃度下β-LG/VE復合物，使得復合物強化乳中VE含量為8 mg/100 g。UHT處理條件為138 ℃、5 s，經(jīng)過無菌灌裝加工后，室溫保存。

1.3.11 VE損失率計算

普通強化乳和復合物強化乳中VE含量的參照1.3.2節(jié)中VE的測定方法，并計算VE在UHT前后的損失率，計算公式如下：

式中：C1為UHT處理前VE含量/（mg/100 g）；C2為UHT處理后VE含量/（mg/100 g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 25軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA差異顯著性分析，所有數(shù)據(jù)以表示。使用Origin 2018軟件作圖。在生物膜干涉實驗中，原始數(shù)據(jù)采用Octet數(shù)據(jù)分析軟件（Version 6.4, ForteBio）分析。

2 結果與分析

2.1 β-LG/VE復合物中VE含量的測定

通過高效液相色譜法測定4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物中VE含量，見表3。當VE質量濃度為5、10、20 mg/mL和40 mg/mL時，對應復合物中VE含量分別為（29.54±1.03）、（42.93±2.14）、（59.02±2.85）mg/100 mg和（72.18±4.07）mg/100 mg。當VE質量濃度為40 mg/mL時，對應復合物中VE的含量最高，因此將40 mg/mL VE質量濃度的復合物添加到復合物強化乳中。

表3 4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物中VE含量Table 3 VE contents in β-LG/VE complexes prepared with four concentrations of VE

2.2 濁度的測定

濁度是評價脂溶性物質溶解度的重要指標，樣品的濁度越高，溶解度越低。如圖1所示，隨著VE質量濃度的增加，4 種質量濃度下VE和β-LG/VE復合物的濁度逐漸升高。在同一質量濃度水平，β-LG/VE復合物的濁度低于VE的濁度。這是由于VE是脂溶性的，在水環(huán)境中會發(fā)生聚集導致濁度增加[26]。當β-LG與VE結合后，可以減少暴露在水溶液中VE的數(shù)量，減少VE的自我聚集，形成更多親水性的復合物，使?jié)岫冉档蚚16,27]。因此，可以證明β-LG與VE存在結合，結合后增加了VE在水溶液中的溶解度。

圖1 4 種質量濃度下VE和β-LG/VE復合物的濁度Fig. 1 Turbidity of free VE and β-LG/VE complexes prepared with four concentrations of VE

2.3 粒徑和Zeta電位的測定

4 種質量濃度下VE和β-LG/VE復合物的粒徑測定見圖2A，隨著VE質量濃度增加，VE和β-LG/VE復合物的粒徑逐漸升高，這說明VE質量濃度越高，VE在水中聚集程度越高，粒徑越大[16]。在同一質量濃度下，β-LG/VE復合物的粒徑高于β-LG的粒徑，說明β-LG與VE存在相互作用，使復合物尺寸變大；β-LG/VE復合物的粒徑低于VE的粒徑，進一步證明β-LG與VE之間存在結合，結合后使暴露在水中的VE數(shù)量減少，VE聚集程度降低，粒徑減小。Haham等[26]測定VD3和酪蛋白膠束/VD3納米復合物的粒徑，結果表明納米復合物的粒徑低于VD3的粒徑，與本研究結果一致。

4 種質量濃度下VE和β-LG/VE復合物的Zeta電位，如圖2B所示。隨著VE質量濃度增加，VE和β-LG/VE復合物的Zeta電位幾乎保持不變。在同一VE質量濃度時，β-LG的電位高于VE和β-LG/VE復合物的電位，這三者的電位都是負值。據(jù)報道，VE不帶電荷，VE的負電位可能是由于脂溶性維生素在水溶液中形成較大的納米聚集體，聚集體表面會迅速吸收水中的羥基離子，呈現(xiàn)負電位[16]。

圖2 4 種質量濃度下VE和β-LG/VE復合物的粒徑（A）和Zeta電位（B）Fig. 2 Particle sizes (A) and zeta potentials (B) of free VE and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

2.4 掃描電子顯微鏡結構表征

由圖3可見，β-LG和β-LG/VE復合物的表面結構呈片狀，這是由于在冷凍干燥過程中，水從溶液中蒸發(fā)，分子之間的作用力更容易導致溶質聚集[28]。β-LG呈現(xiàn)光滑的片狀結構，而β-LG/VE的微觀結構呈微突起的片狀結構，這可能是由于VE附著在β-LG表面形成了VE聚集物[29]。

圖3 β-LG（A）和40 mg/mL VE質量濃度下β-LG/VE復合物（B）的微觀結構Fig. 3 Microstructure of β-LG (A) and β-LG/VE complex prepared with 40 mg/mL VE (B）

2.5 SDS-PAGE分析結果

圖4 β-LG和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的SDS-PAGE結果Fig. 4 Electrophoresis patterns of β-LG and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

通過SDS-PAGE分析β-LG與VE發(fā)生共價結合情況[30]。從圖4可以看出，β-LG的分子質量約為18.3 kDa，4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的分子遷移率與β-LG遷移率基本一致，這說明β-LG與VE結合后，β-LG的分子質量沒有變化，結合過程中沒有破壞β-LG的二硫鍵，屬于非共價結合。

2.6 紅外光譜分析

用紅外光譜分析與VE結合后的β-LG的二級結構變化，如圖5所示。在β-LG光譜中，氫鍵的峰值在3 292.38 cm－1，是氫鍵的—OH基團的伸縮振動吸收峰[31]。添加VE后，4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的氫鍵峰向左移動，分別為3 292.82、3 293.34、3 294.30 cm－1和3 295.26 cm－1，說明氫鍵是β-LG與VE之間的重要作用力之一。在β-LG/VE復合物光譜中，酰胺I帶（1 650～1 600 cm－1）和酰胺II帶（1 550～1 500 cm－1）峰的位置也發(fā)生移動，表明β-LG通過疏水相互作用與VE結合[32]。與VE結合后，β-LG的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲的相對含量均未發(fā)生顯著變化（表4），說明與VE結合后，β-LG的二級結構未受影響。Swain等[12]研究與VB12結合后β-LG的蛋白二級結構變化，結果表明β-LG的蛋白二級結構沒有改變，與本研究結果一致。總的來說，β-LG可通過氫鍵和疏水作用與VE結合形成復合物，但蛋白二級結構不受影響。

圖5 β-LG和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的紅外光譜Fig. 5 Infrared spectra of β-LG and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

表4 β-LG和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的二級結構相對含量Table 4 Secondary structure contents of β-LG and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

2.7 熒光光譜分析結果

使用熒光光譜分析與VE結合后的β-LG的三級結構變化。如圖6所示，蛋白的內在熒光是由280 nm波長處的酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）殘基激發(fā)引起的[16]。通過對β-LG和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，在332 nm波長處，β-LG的熒光強度最大，依次為5、10、20、40 mg/mL VE質量濃度下的復合物，這說明與VE結合增加了β-LG的熒光猝滅程度。熒光強度降低的主要原因是VE作為猝滅劑使得β-LG中Tyr和Trp的熒光猝滅。4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的最大熒光強度始終保持在332 nm波長處，說明VE是與β-LG相互作用的小分子猝滅劑，與VE結合只是減少β-LG中熒光基團的數(shù)量，對β-LG的三級結構沒有影響。Swain等[12]通過熒光光譜分析與VB12結合后β-LG的三級結構變化，結果表明β-LG的三級結構不受VB12的影響，與本研究結果一致。

圖6 β-LG和4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的熒光光譜Fig. 6 Fluorescence spectra of β-LG and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

2.8 生物膜干涉技術檢測結果

生物膜干涉技術包括5 個步驟：平衡1（PBS）、固化（β-LG）、平衡2（PBST）、結合（VE）和解離（PBST）。在固化步驟，SA傳感器捕捉蛋白中的生物素標簽使得蛋白固定在傳感器上。隨后將帶有蛋白的SA傳感器與4 種不同質量濃度的VE結合，在PBST中解離結合在β-LG上的VE完成解離過程。圖7為β-LG和VE的結合解離擬合曲線（R2=0.99），可以觀察到明顯的結合信號，隨著VE質量濃度的升高，結合信號逐漸增強，最高達到0.065 nm；在解離過程中，結合信號降低。通過數(shù)據(jù)分析軟件得到結合速率常數(shù)為1.17 L/（mol?s），解離速率常數(shù)8.766×10－2s－1，計算的β-LG和VE的親和力常數(shù)為7.493×10－2mol/L。已有研究表明在生物膜干涉技術中能夠得到親和力常數(shù)就可以證明兩個分子之間存在結合，張英等[23]采用生物膜干涉技術研究花生蛋白與花生蛋白過敏患者血清IgE的相互作用，結果表明這兩者之間親和力常數(shù)為5.5×10－5mol/L，可以證明兩者之間存在結合；Shang Jiaqi等[33]通過生物膜干涉技術研究乳清分離蛋白與金針菇多糖之間的相互作用，結果表明這兩者之間親和力常數(shù)為1.736×10－4mol/L，可以證明兩者之間存在結合。由此得出β-LG和VE之間存在結合。

圖7 4 種VE質量濃度下β-LG/VE復合物的結合解離擬合曲線Fig. 7 Fitting curves of association and dissociation of β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

2.9 VE損失率計算

表5為普通強化乳和復合物強化乳中VE含量，可以看出熱處理后VE含量均顯著降低（P＜0.05），這是由于高溫條件下VE對熱不穩(wěn)定，導致VE降解，還可以觀察到復合物強化乳中VE損失率（4.01±0.18）%顯著低于普通強化乳中VE損失率（10.90±0.17）%（P＜0.05），這說明β-LG與VE結合后可以保護VE免受熱降解。因此，β-LG可有效改善VE的熱穩(wěn)定性。Saiz-Abajo等[34]研究在食品加工過程中酪蛋白對β-胡蘿卜素的保護情況，結果表明酪蛋白可以降低β-胡蘿卜素的降解程度。Gupta等[35]研究表明酪蛋白可有效提高VA的穩(wěn)定性。Relkin等[36]研究，結果表明在儲存過程中乳清蛋白具有保護α-生育酚的作用。綜上所述，之前的研究已經(jīng)表明乳蛋白可以作為維生素的保護載體，這與本研究的結果一致。

表5 普通強化乳和復合物強化乳中VE含量和損失率Table 5 VE contents and loss rates in common fortified milk and complex fortified milk

3 結 論

本研究以β-LG和VE為材料制備β-LG/VE復合物，通過濁度、粒徑、Zeta電位、掃描電子顯微鏡、SDS-PAGE、紅外光譜和熒光光譜分析證明β-LG與VE之間通過氫鍵和疏水相互作用結合，結合后提高VE在水溶液中的溶解性，不改變蛋白的結構。生物膜干涉技術進一步證明β-LG與VE之間存在結合，親和力常數(shù)為7.493×10－2mol/L，因此，生物膜干涉技術可用于分析β-LG和VE之間的結合程度。將β-LG/VE復合物添加到乳中制備復合物強化乳可有效的降低VE在加工過程中的損失，為維生素的綜合利用提供理論基礎。