李愛陽，黃建華

（1.湖南工學(xué)院材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 衡陽 421002；2.湖南中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所，湖南 長沙 410013）

大米為世界上一半人口的主食，特別是亞洲和非洲發(fā)展中國家，所提供能量占日常食物攝入量的70%[1]。大米的基質(zhì)組成復(fù)雜，主要由碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素以及礦物營養(yǎng)成分組成[2]。然而，大米中還含有毒理性微量元素，其中砷是研究最多的元素[3-5]。砷的毒性取決于其化學(xué)形態(tài)或物種，而不僅取決于總量，無機(jī)砷（inorganic arsenic，iAs）以亞砷酸鹽（As（III））、砷酸鹽（As（V））和氧化物（As（III、V））的形式存在，主要來源于巖石和土壤改變和侵蝕的自然釋放，或來源于采礦、冶金活動、使用殺蟲劑和燃燒不同的材料等[6-8]。iAs是已知的致癌物，被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的砷物種之一，而有機(jī)砷（oAs）主要以一甲基胂酸（monomethyl arsonic acid，MMA）和二甲基胂酸（dimethyl arsonic acid，DMA）的形式存在，通常被認(rèn)為毒性較小[9-11]。水稻很容易從其生長的土壤和水中吸收砷積累到谷粒中，從而導(dǎo)致大米中iAs濃度相對較高[12]。我國作為大米攝入量高的國家，對大米中iAs含量制定嚴(yán)格的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2762—2017《食品中污染物限量》），規(guī)定大米中iAs不大于0.2 mg/kg[13]。因此，建立簡單、快速、靈敏、可靠檢測大米中iAs含量的分析方法具有重要意義。

大米中砷含量通常很低，在測定前需從樣品中提取和分離出不同形態(tài)的砷，固相萃取、濁點萃取、分散液液微萃取、氫化物發(fā)生（hydride generation，HG）等技術(shù)通常被用于提取不同形態(tài)的砷[14-17]，而離子色譜、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）以及毛細(xì)管電泳是分離不同形態(tài)砷最常用方法[18-20]。其中，HG技術(shù)使用硼氫化鈉在酸性介質(zhì)中將水溶液中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性氫化物。由于不同形態(tài)砷與硼氫化鈉反應(yīng)的原理不同，并不是所有形態(tài)砷均可形成氫化物，但可以通過控制轉(zhuǎn)化條件選擇性地形成單個形態(tài)砷或具有相同性質(zhì)多個形態(tài)砷的氫化物，從而無需使用色譜分離技術(shù)即可進(jìn)行提取和分離出不同形態(tài)的砷。

目前，測定大米樣品中不同形態(tài)的砷含量已有大量文獻(xiàn)報道，通常采用原子光譜檢測技術(shù)，主要包括原子熒光光譜法[21]、原子吸收光譜法[22]、電感耦合等離子發(fā)射光譜法[23]和電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法[24]。與其他檢測技術(shù)相比，ICP-MS具有檢出限低、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點[25]，但來自ICP工作氣與樣品基質(zhì)所形成的質(zhì)譜干擾仍然影響痕量砷元素的準(zhǔn)確測定，尤其是基于四極桿ICP-MS缺少消除質(zhì)譜干擾的通用方法。電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜（inductively coupled plasmatandem mass spectrometry，ICP-MS/MS）利用雙重四極桿精準(zhǔn)控制碰撞反應(yīng)池（collision reaction cell，CRC）內(nèi)的反應(yīng)過程和反應(yīng)產(chǎn)物，通過選擇合適的反應(yīng)氣，幾乎可以消除所有質(zhì)譜干擾[26]。本實驗利用多模式進(jìn)樣系統(tǒng)（multimode sample introduction system，MSIS）在HG模式下，通過控制HG條件將大米中iAs選擇性生成氣態(tài)氫化物（AsH3），導(dǎo)入ICP-MS/MS進(jìn)行測定，在MS/MS模式采用O2為反應(yīng)氣消除質(zhì)譜干擾，旨在無需使用色譜分離準(zhǔn)確測定大米中iAs的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米樣品湖南秈米（產(chǎn)地湖南）、湖南粳米（產(chǎn)地湖南）、湖南糯米（產(chǎn)地湖南）、江西秈米（產(chǎn)地江西）、重慶秈米（產(chǎn)地重慶）、重慶粳米（產(chǎn)地重慶）、東北粳米（產(chǎn)地黑龍江）、泰國茉莉香米（產(chǎn)地泰國）、日本米（產(chǎn)地日本）、柬埔寨茉莉香米（產(chǎn)地柬埔寨），購于大型超市。

砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L）、銠單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L）、氫氧化鈉（分析純）、硼氫化鈉（分析純）、磷酸二氫銨（分析純）、氨水（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%硝酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%鹽酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%雙氧水 德國Merck公司；MMA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08668）、DMA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08669）、砷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08667）、亞砷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08666） 中國計量科學(xué)研究院；國家標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)大米粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW(E)100348a，GBW(E)100349a） 鋼研納克檢測技術(shù)股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)大米粉（NIST SRM1568b） 美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

8800 ICP-MS/MS儀（配備MSIS附件、玻璃同心霧化器、石英雙通道Scott霧化室）、1260 HPLC儀（配備手動進(jìn)樣器、單元泵） 美國Agilent公司；PRP-X100陰離子交換分析和、保護(hù)柱 瑞士Hamilton公司；Sorvall ST16R臺式高速離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司；MARS微波消解儀 美國CEM公司；FZ102微型植物粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；HWS28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q超純水儀美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 工作條件

ICP-MS/MS條件：射頻功率1.55 kW；等離子氣流速18.0 L/min；輔助氣流速1.8 L/min；載氣流速1.09 L/min；采樣深度8.0 mm；反應(yīng)氣O2流速0.30 mL/min；積分時間3 s；第一質(zhì)量過濾器（Q1）m/z75；第二質(zhì)量過濾器（Q2）m/z91。

HPLC條件：流動相20 mmol/L磷酸二氫銨；流動相流速1 mL/min；進(jìn)樣量50 μL；柱溫室溫；pH 8.0；采集時間650 s。

MSIS條件：樣品提取溶液流速0.5 mL/min；鹽酸流速2.0 mL/min；硼氫化鈉流速0.5 mL/min；內(nèi)標(biāo)溶液流速0.8 L/min；Ar流速0.5 L/min。

1.3.2 樣品中砷的提取

酸提取法：準(zhǔn)確稱取0.5 g經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后的大米樣品于離心管中，依次加入0.15 mol/L硝酸9.0 mL，30%的雙氧水1.0 mL，混合均勻靜置過夜后放入恒溫水浴鍋內(nèi)50 ℃提取5 min，75 ℃提取5 min，95 ℃提取10 min。冷卻至室溫，經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用超純水定容至100 mL，用于不同形態(tài)砷的測定。

微波消解法：準(zhǔn)確稱取0.5 g經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后的大米樣品于微波消解罐內(nèi)，依次加入65%硝酸4.0 mL，30%雙氧水6.0 mL，經(jīng)微波消解后用超純水定容至100 mL，用于總砷的測定。

1.3.3 樣品中iAs的分離

在MSIS的HG模式下（圖1）。將大米樣品的酸提取溶液與預(yù)還原劑5 mol/L鹽酸進(jìn)入MSIS前經(jīng)三通毛細(xì)管線圈混合均勻，與還原劑2 g/100 mL硼氫化鈉溶液在MSIS中發(fā)生反應(yīng)，在Ar的推動下，利用測定非氫化物元素的樣品引入通道加入25 μg/L銠內(nèi)標(biāo)溶液，將生成的氫化物氣體和內(nèi)標(biāo)霧化溶液導(dǎo)入ICP-MS/MS，測定大米中的iAs。

圖1 ICP-MS/MS的MSIS原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the MSIS for ICP-MS/MS

1.3.4 HG-ICP-MS/MS分析

配制質(zhì)量濃度分別為0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/L的系列砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的MSIS和ICP-MS/MS條件下進(jìn)行測定，同時對樣品酸提取溶液和空白溶液（酸提取法）進(jìn)行測定，根據(jù)砷信號強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)元素銠信號強(qiáng)度的比值所對應(yīng)的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度建立校準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，計算樣品提取溶液中總砷和iAs的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

ICP-MS/MS實驗數(shù)據(jù)采用MassHunter軟件進(jìn)行評估和統(tǒng)計，實驗圖標(biāo)采用Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形態(tài)砷發(fā)生氫化物反應(yīng)條件

高價砷不易發(fā)生氫化物反應(yīng)，需還原為低價砷，鹽酸既能將As（V）還原為As（III），又能對樣品進(jìn)行酸化，是HG最常用載流介質(zhì)。分別配制1 μg/L的As（III）、MMA、DMA標(biāo)準(zhǔn)溶液，固定硼氫化鈉質(zhì)量濃度為2 g/100 mL，考察鹽酸濃度變化對不同形態(tài)砷信號強(qiáng)度的影響。As（III）、MMA、DMA的氫化物反應(yīng)方程式如下：

從圖2a可以看出，隨著鹽酸濃度的增大，As（V）在鹽酸介質(zhì)中還原為As（III），經(jīng)反應(yīng)（1）As（III）的信號強(qiáng)度，當(dāng)鹽酸的濃度達(dá)到1 mol/L時，As（III）的信號強(qiáng)度達(dá)到最大值，隨后處于平穩(wěn)狀態(tài)，表明在As（III）通過氫化物反應(yīng)已完全形成AsH3，當(dāng)鹽酸濃度增大至4 mol/L后，As（III）的信號強(qiáng)度開始小幅度下降；MMA經(jīng)氫化物反應(yīng)（2）可生成揮發(fā)性甲基胂（CH3AsH2），但隨著鹽酸濃度的增大，MMA的信號強(qiáng)度逐漸減小，表明高濃度鹽酸介質(zhì)抑制MMA生成甲基胂的氫化物反應(yīng)，雖然MMA的信號強(qiáng)度一直持續(xù)下降，但由于大米中MMA的含量極低[18]，所形成的氫化物甲基胂不影響iAs的測定；DMA經(jīng)氫化物反應(yīng)（3）可生成弱揮發(fā)性二甲胂（(CH3)2AsH，沸點35 ℃），相比As（III）和MMA，其信號強(qiáng)度較低，隨著鹽酸濃度的增大，DMA的信號強(qiáng)度逐漸減小，當(dāng)鹽酸達(dá)到4 mol/L，DMA的信號強(qiáng)度保持在最低水平，表明DMA氫化物反應(yīng)在高濃度鹽酸介質(zhì)中被抑制。因此，本實驗選擇5 mol/L鹽酸作為HG的載流介質(zhì)，確保了iAs處于高信號強(qiáng)度而DMA處于低信號強(qiáng)度。

固定鹽酸濃度為5 mol/L，考察硼氫化鈉質(zhì)量濃度變化對不同形態(tài)砷信號強(qiáng)度的影響。從圖2b可以看出，As（III）和MMA的信號強(qiáng)度均隨硼氫化鈉溶液質(zhì)量濃度的增大而增大，而DMA的信號強(qiáng)度很低且基本無變化，表明增大硼氫化鈉溶液質(zhì)量濃度有利于As（III）和MMA的氫化物反應(yīng)，但對DMA的氫化物反應(yīng)無影響。當(dāng)硼氫化鈉溶液質(zhì)量濃度達(dá)到2 g/100 mL后，As（III）的信號強(qiáng)度不再增大，DMA的信號強(qiáng)度仍然保持低水平，MMA的信號強(qiáng)度仍然繼續(xù)增大。由于大米中MMA的含量極低，僅需關(guān)注As（III）和DMA信號強(qiáng)度的變化。本實驗選擇硼氫化鈉溶液質(zhì)量濃度為2 g/100 mL，確保As（III）保持高信號強(qiáng)度而DMA的信號強(qiáng)度處于極低水平。

圖2 鹽酸濃度（a）和硼氫化鈉質(zhì)量濃度（b）對不同形態(tài)砷信號的影響Fig. 2 Effect of HCl concentration (a) and NaBH4 concentration (b) on the signal intensity of different arsenic species

2.2 質(zhì)譜干擾及消除

在鹽酸介質(zhì)中，砷的唯一同位素75As會受到40Ar35Cl和40Ca35Cl的嚴(yán)重干擾[27]，當(dāng)樣品中稀土元素Sm和Nd含量較高時，還會受到Sm和Nd所形成的雙電荷離子（150Sm＋＋和150Nd＋＋）干擾[28]。He碰撞模式是基于四極桿ICP-MS最通用的消除質(zhì)譜干擾方式，能消除大量多原子離子所形成的干擾，不能消除雙電荷離子干擾，當(dāng)樣品中Sm和Nd含量較低，所形成的雙電荷離子150Sm＋＋和150Nd＋＋對75As＋的干擾可以忽略不計時，采用He碰撞模式可以消除40Ar35Cl和40Ca35Cl的干擾，但在碰撞過程中75As＋不可避免地發(fā)生能量損失，影響75As的分析靈敏度，尤其是分析樣品中超痕量As會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。在ICP-MS/MS的MS/MS模式，設(shè)置Q1的m/z為75，僅允許m/z為75的離子（75As＋、40Ar35Cl＋、40Ca35Cl＋、150Sm＋＋、150Nd＋＋）進(jìn)入CRC，將來自ICP的其他大量離子阻止在CRC外，向CRC內(nèi)通入O2為反應(yīng)氣，75As＋與O2發(fā)生質(zhì)量轉(zhuǎn)移反應(yīng)（75As＋＋O2→75As16O＋＋O，反應(yīng)焓（ΔHr）=－0.63 eV），而40Ar35Cl＋、40Ca35Cl＋、150Sm＋＋、150Nd＋＋均不與O2反應(yīng)，設(shè)置Q2的m/z為91，將75As＋通過質(zhì)量轉(zhuǎn)移為75As16O＋進(jìn)行測定[29]。本實驗在MS/MS模式下，選擇O2為反應(yīng)氣，利用75As＋與O2發(fā)生質(zhì)量轉(zhuǎn)移反應(yīng)消除干擾，考察了不同O2流速下75As16O＋背景等效濃度（background equivalent concentration，BEC）的變化情況，當(dāng)O2流速達(dá)到0.30 mL/min時，75As16O＋的BEC最小，本實驗選擇O2反應(yīng)氣的最佳流速為0.30 mL/min。

2.3 方法的線性與檢出限

采用ICP-MS/MS對系列砷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以砷信號強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)元素銠信號強(qiáng)度的比值（y，相對信號強(qiáng)度）與對應(yīng)的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x，μg/L）進(jìn)行線性回歸，得到砷的校準(zhǔn)曲線為y=1.1×10－3x＋9.3×10－5，線性相關(guān)系數(shù)R=0.999 9，表明方法的線性良好；分別以空白溶液（酸提取法）連續(xù)測定10 次的3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)質(zhì)量濃度為儀器的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ），砷的LOD為0.004 μg/L，LOQ為0.013 μg/L，將LOD乘以200（稀釋因子）換算得到方法的檢出限為0.8 μg/kg。

2.4 HG-ICP-MS/MS與HPLC-ICP-MS/MS的對比分析

采用HG-ICP-MS/MS對標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)GBW(E)100348a（大米粉）、GBW(E)100349a（大米粉）、NIST SRM1568b（米粉）中的iAs進(jìn)行測定，并采用ICP-MS/MS和HPLC-ICP-MS/MS分別對標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)中的總砷和不同形態(tài)的砷進(jìn)行測定，每個標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)平行測定6 次，結(jié)果見表1。通過HPLC-ICP-MS/MS的測定結(jié)果可以看出，大米中砷的主要存在形態(tài)為iAs和DMA，而MMA的含量極低，與文獻(xiàn)[18]報道結(jié)果一致。采用HG-ICP-MS/MS測定標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)中iAs的含量與HPLC-ICP-MS/MS的測定結(jié)果基本一致，并與標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的認(rèn)定值吻合，表明通過控制HG條件（5 mol/L鹽酸和2 g/100 mL硼氫化鈉溶液）能選擇性將iAs完全轉(zhuǎn)化為AsH3，抑制DMA形成二甲胂，雖然大米中低含量的MMA能發(fā)生氫化物反應(yīng)，但由于所形成的甲基胂含量太低不影響AsH3的測定，從而實現(xiàn)了大米中iAs含量的準(zhǔn)確測定。HG-ICP-MS/MS在4 min內(nèi)可重復(fù)測定樣品溶液5 次，而HPLC-ICP-MS/MS在10 min內(nèi)僅能重復(fù)測定樣品溶液1 次，由于HPLC-ICP-MS/MS數(shù)據(jù)處理更為復(fù)雜，因此，HG-ICP-MS/MS特別適合大批量樣品的高通量分析。

表1 標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)中砷的分析結(jié)果（n=6）Table 1 Analytical results of arsenic in standard reference materials (n = 6) μg/kg

2.5 樣品分析

采用HG-ICP-MS/MS分別測定10 種大米（湖南秈米、湖南粳米、湖南糯米、江西秈米、重慶秈米、重慶粳米、東北粳米、泰國茉莉香米、日本米、柬埔寨茉莉香米）中iAs含量，同時采用國標(biāo)法（GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機(jī)砷的測定》）進(jìn)行對比分析[30]，每個樣品重復(fù)測定6 次。從表2可以看出，10 種大米中iAs含量在58.7～122 μg/kg之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在1.9%～4.5%之間，其中湖南粳米iAs含量最高，重慶秈米iAs含量最低。采用HG-ICPMS/MS分析結(jié)果與國標(biāo)法基本一致，表明無需使用色譜技術(shù)對大米中砷進(jìn)行形態(tài)分離，僅利用HG技術(shù)即可選擇性分離大米中的iAs，從而實現(xiàn)大米中iAs的準(zhǔn)確測定。參照GB 2762—2017規(guī)定大米中iAs含量限量200 μg/kg的指標(biāo)，10 種大米中iAs含量均低于國家標(biāo)準(zhǔn)限量值。

表2 10 種大米樣品中iAs的分析結(jié)果（n=6）Table 2 Analytical results of inorganic arsenic contents in rice samples (n = 6)

3 結(jié) 論

基于大米中砷的主要存在形態(tài)為iAs和DMA，通過優(yōu)化HG條件，選擇性地將iAs轉(zhuǎn)化為AsH3， 而DMA未發(fā)生氫化物反應(yīng)或發(fā)生反應(yīng)形成了揮發(fā)性較弱的二甲胂，從而實現(xiàn)大米中iAs與oAs的分離；利用ICP-MS/MS的O2反應(yīng)模式，使砷發(fā)生質(zhì)譜轉(zhuǎn)移消除干擾。通過與HPLCICP-MS/MS分析結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的認(rèn)定值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該方法具有操作簡單、分析速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、精密度高的特點，其最大的優(yōu)勢是無需使用色譜技術(shù)進(jìn)行砷的形態(tài)分離也能單獨測定大米中iAs的含量。對10 種大米樣品中的分析結(jié)果表明，所有樣品中iAs含量均沒超標(biāo)，該方法分析能力可滿足大米中iAs的限定標(biāo)準(zhǔn)要求。