棘球蚴通過mTOR途徑抑制糖酵解的研究

劉穎穎，孟娟娟，常 瑗，藺 珂，廖 原，許軍英，侯 雋，陳雪玲，王 仙

棘球蚴病(又稱囊型包蟲病)是細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲寄生而引發(fā)的一種人獸共患病[1]。感染后，患者體內(nèi)T細(xì)胞的分化出現(xiàn)偏移，表現(xiàn)出以Treg細(xì)胞為主的免疫抑制，但其機(jī)制尚不清楚[2]。代謝免疫學(xué)研究[3]表明，T細(xì)胞的分化與代謝選擇有密切關(guān)系，效應(yīng)T細(xì)胞采用有氧糖酵解 。調(diào)控糖酵解，可以影響T細(xì)胞的分化方向，上調(diào)糖酵解可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，抑制Treg細(xì)胞的生成[4-5]。mTOR通路是調(diào)控糖酵解代謝中經(jīng)典的能量代謝通路[6]。該研究通過構(gòu)建棘球蚴感染小鼠的疾病模型，初步探討mTOR途徑是否參與調(diào)控T細(xì)胞的糖酵解代謝，為進(jìn)一步研究在包蟲病中糖酵解對宿主T細(xì)胞的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1小鼠與感染棘球蚴的羊肝來源 30只6～8周齡，體質(zhì)量約為20 g的Balb/c小鼠，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；感染棘球蚴的羊肝來自新疆昌吉自治州屠宰場。

1.1.2主要試劑與儀器 RPMI-1640購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自以色列BI公司，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶公司，流式抗體、Fixation/Permeabilization Buffer、Brefeldin A(BFA)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Western blot抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，PMA/Ionomycin購自中國聯(lián)科生物有限公司，總RNA提取試劑盒購自美國 Omega Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1提取原頭蚴 清水多次沖洗感染棘球蚴的羊肝后，用75%乙醇噴洗消毒，以50 ml注射器抽取棘球蚴囊液，靜置后留取沙粒樣沉淀，用含有1%青-鏈霉素混合液的PBS沖洗10次，以除去殘留囊皮和活性不好的原頭蚴。將原頭蚴吹打混勻后，吸取50 μl混合液滴加于載玻片上，然后加入5 μl伊紅染液，混勻靜置30 s，顯微鏡下觀察計數(shù)，原頭蚴活性>95%。

1.2.2構(gòu)建棘球蚴感染小鼠模型 將30只健康Balb/c小鼠，隨機(jī)分為對照組、感染組和抑制劑組，每組10只。感染組和抑制劑組肝被膜下接種5 000個原頭蚴，對照組則接種同等體積的PBS。同時，抑制劑組從第2天起每日腹腔注射雷帕霉素(1.25 mg/kg)。

1.2.3采集外周血 摘除小鼠眼球收集血液，待血液凝固后，8 000 r/min，離心10 min，分裝上層血清，-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液 摘除小鼠脾臟，刮取脾臟細(xì)胞，將淋巴細(xì)胞分離液分離得到的細(xì)胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基制備成1×107/ml的細(xì)胞懸液，備用。

1.2.5Western blot檢測mTOR途徑的蛋白表達(dá) 提取蛋白樣本，按照說明書配制一抗和二抗緩沖液，制備SDS-PAGE凝膠，4 ℃過夜，取出制膠梳，按照分組向孔內(nèi)加入蛋白Marker(8 μl)或樣本蛋白(20 μl)進(jìn)行電泳，剪取適當(dāng)大小的PVDF放入甲醇激活5 min，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，加入一抗緩沖液4 ℃慢搖過夜，1×TBST洗膜3次，每次計時10 min，孵育二抗1 h，1×TBST洗膜3次，每次計時10 min，將ECL發(fā)光試劑盒中的A液和B液，按照1 ∶1比例配制顯色液，然后滴加在PVDF膜上，使顯色液與膜上蛋白充分結(jié)合后，曝光，拍照及初步處理圖像，Image J掃描條帶蛋白灰度值。

1.2.6qRT-PCR檢測糖酵解相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá) 用試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA后采用Nanodrop 2000測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按SYBR Green兩步法操作進(jìn)行qRT-PCR檢測糖酵解代謝中酶以及乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：己糖激酶3 (hexokinase 3, HK3)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2, PKM2)、乳酸脫氫酶A(lactic dehydrogenase A, LDHA)和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(mnocarboxylate transporter 4, MCT4)的mRNA表達(dá)。引物序列見表1，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 相關(guān)引物序列

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17和Treg細(xì)胞 每組取1×106個脾臟淋巴細(xì)胞至各標(biāo)記管中，按照標(biāo)記分別加入 CD4-PE、CD25-Percpcy 5.5，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌1次，洗去未結(jié)合的抗體，固定、破膜后再按照標(biāo)記分別加入IL-17A-FITC、FoxP3-FITC，各自4 ℃避光孵育30 min和40 min后，破膜液洗滌1次，加500 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)，F(xiàn)lowjo 10軟件處理數(shù)據(jù)繪制圖。

2 結(jié)果

2.1 原頭蚴活性的測定在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到伊紅染色后的原頭蚴，著色為深紅色的是已經(jīng)凋亡的，未著色的為活性好的。見圖1。

圖1 不同視野下原頭蚴伊紅染色 ×40

2.2 棘球蚴感染小鼠肝臟的大體形態(tài)感染后，小鼠肝臟在15 d可見有乳白色囊泡形成，在30 d可見乳白色囊泡體積增大并凸起，70 d可見囊泡不僅體積增大，也向周圍擴(kuò)散，囊泡的數(shù)量增多，囊泡透明度增加并有囊液的形成。見圖2。

圖2 棘球蚴感染小鼠不同時間的肝臟

2.3 棘球蚴感染后糖酵解變化與mTOR途徑的蛋白表達(dá)通過 qRT-PCR檢測HK3、PKM2、LDHA和MCT4的mRNA表達(dá)反映糖酵解代謝的變化，如圖3A所示，與對照組比較，棘球蚴感染后，感染組中糖酵解相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)水平降低，且均在感染后70 d達(dá)到最低，其中HK3(F=50.63，P<0.001)、PKM2(F=26.52，P<0.05)、LDHA(F=22.16，P<0.05)和MCT4(F=18.84，P<0.05)；感染后15、30和70 d各組mTOR下游分子的蛋白表達(dá)由Western blot檢測，如圖3B～E所示，各指標(biāo)蛋白相對表達(dá)量分別為[HIF-1α (0.42±0.034)、 (0.11±0.006)、(0.18±0.006) 和 (0.01±0.003)，F(xiàn)=196.4，P<0.000 1；P-p70S6 (0.57±0.055)、(0.08±0.026)、(0.12±0.025)和(0.06±0.028)，F(xiàn)=87.76，P<0.000 1；P-4EBP-1 (0.58±0.071)、(0.19±0.056)、(0.28±0.028)和(0.15±0.058)，F(xiàn)=24.73，P<0.01]。與對照組比較，感染后HIF-1α、P-p70S6和P-4EBP-1的蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。

圖3 棘球蚴感染后糖酵解變化與mTOR途徑的蛋白表達(dá)

2.4 抑制mTOR途徑對糖酵解的影響

2.4.1雷帕霉素抑制mTOR途徑 對照組、感染組和抑制劑組中mTOR下游分子的蛋白表達(dá)由Western blot檢測，各指標(biāo)蛋白相對表達(dá)量分別為[HIF-1α (0.37±0.035)、(0.15±0.040) 和 (0.06±0.018)，F(xiàn)=59.24，P<0.05；P-p70S6 (0.86±0.007)、(0.26±0.024)和 (0.18±0.014)，F(xiàn)=649.30，P<0.01；P-4EBP-1 (0.73±0.020)、(0.31±0.021) 和 (0.19±0.008)，F(xiàn)=535.80，P<0.001]。與對照組比較，感染組和抑制劑組中淋巴細(xì)胞內(nèi)mTOR下游分子的蛋白表達(dá)明顯降低 (均P<0.05)。見圖4。

圖4 雷帕霉素抑制mTOR途徑

2.4.2抑制mTOR途徑對糖酵解代謝變化的影響 qRT-PCR檢測HK3、PKM2、LDHA和MCT4的mRNA表達(dá)，與對照組和感染組比較，抑制劑組淋巴細(xì)胞內(nèi)的糖酵解相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)水平明顯降低，其中HK3(F=65.39，P<0.01)、PKM2(F=13.43，P<0.01)、LDHA(F=26.81，P<0.05)和MCT4(F=28.44，P<0.05)，見圖5A。PMA/Inomycin和BFA刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞5 h后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟淋巴細(xì)胞中Th17和Treg細(xì)胞的比例，在對照組、感染組和抑制劑組中CD4+IL-17A+(Th17)細(xì)胞的百分比分別是(5.60±0.49)%、(2.78±0.38)%和(1.26±0.06)%(F=67.79，P<0.01)；CD4+CD25+Foxp3+(Treg)細(xì)胞的百分比分別為(4.98±1.30)%、(10.96±0.45)%和(14.30±1.07)%(F=92.12，P<0.001)。與對照組和感染組比較，抑制劑組Th17細(xì)胞比例降低，Treg細(xì)胞比例升高(P<0.05)，見圖5B～D。

圖5 阻斷mTOR對糖酵解代謝變化的影響

3 討論

犬類作為終宿主排出含有蟲卵的糞便，污染土壤、水流和食物，通過糞-口傳播進(jìn)入中間宿主體內(nèi)，棘球蚴常寄生于肝臟和肺臟，形成一個囊狀體，并隨著寄生時間延長不斷長大，壓迫和破壞器官[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，棘球蚴感染早期，機(jī)體的免疫應(yīng)答以Th1和Th17細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，有利于抗包蟲的保護(hù)作用；感染晚期，機(jī)體的免疫應(yīng)答向Th2細(xì)胞方向偏移，甚至出現(xiàn)Treg細(xì)胞負(fù)調(diào)控，免疫應(yīng)答受到抑制，不利于蟲體的清除。據(jù)報道[11-12]，有氧糖酵解在T細(xì)胞的增殖、分化和應(yīng)答中有著至關(guān)重要的作用，當(dāng)初始T細(xì)胞在抗原刺激后會廣泛的活化，表現(xiàn)出糖酵解代謝加強(qiáng)，以及葡萄糖和氨基酸攝取的增加。即使在氧氣充足的情況下，仍然是依靠糖酵解來生成ATP，從而快速有效地產(chǎn)生更多生物合成中間體，滿足細(xì)胞迅速增殖的需求[13]。mTOR途徑在細(xì)胞生長和增殖中發(fā)揮重要作用[14]，mTOR通過激活下游的HIF-1α，能夠調(diào)控多種糖酵解基因的表達(dá)如：GLUT1、PKM2、LDHA 等[15]。但在棘球蚴感染中，糖酵解的作用以及mTOR途徑和糖酵解之間的關(guān)系尚不清楚。通過本研究發(fā)現(xiàn)，棘球蚴感染后，T細(xì)胞內(nèi)mTOR的下游分子蛋白表達(dá)降低，糖酵解相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)降低，運(yùn)用雷帕霉素阻斷mTOR途徑后，觀察糖酵解的變化，結(jié)果顯示糖酵解代謝明顯抑制，提示棘球蚴感染可能通過mTOR途徑抑制了T細(xì)胞內(nèi)糖酵解代謝。因此，在棘球蚴感染中棘球蚴對宿主免疫的免疫抑制，可能與mTOR途徑抑制糖酵解有關(guān)。

此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測了脾臟組織CD4+T細(xì)胞中Th17和Treg細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)當(dāng)阻斷mTOR引起糖酵解代謝減弱時，Th17/Treg細(xì)胞平衡偏移，但具體糖酵解在棘球蚴感染中如何影響T細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響宿主免疫反應(yīng)，還需要進(jìn)一步研究。