MicroRNA-590和microRNA-196b在兒童IgA腎病診斷中的價值

沈銀紅，沈紅

（青海省婦女兒童醫(yī)院 腎病科，青海 西寧810007）

IgA 腎病是腎小球系膜區(qū)以IgA 或IgA 沉積為主，伴或不伴有其他免疫蛋白在腎小球系膜區(qū)沉積的原發(fā)性腎小球疾病，包括局灶節(jié)段性病變、毛細血管內(nèi)增生病變等。臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性血尿，伴有不同程度的尿蛋白，部分患兒可出現(xiàn)腎功能不全，易發(fā)展為終末期腎病，嚴重危害患兒生命健康[1-3]。臨床主要通過腎活檢病理診斷，光鏡下常見彌漫性系膜細胞增生或局灶階段增生性腎小球腎炎，但腎活檢術(shù)屬創(chuàng)傷性技術(shù)，兒童接受度差，且少數(shù)患兒有腎活檢并發(fā)癥需手術(shù)止血或腎切除[4]，因此有必要尋求IgA 腎病的無創(chuàng)性檢查的生物學(xué)標志物。研究[5-6]認為，IgA 腎病的發(fā)生與免疫功能低下及氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。microRNA 在免疫學(xué)中的研究日益增多，研究表明，microRNA-590（miR-590）異常低表達可誘發(fā)口舌鱗癌中細胞的免疫逃逸[7]。miR-590 可有效減輕急性腎損傷小鼠腎損傷程度[8]， microRNA-196b（miR-196b） 也參與小鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷[9]。miR-590 和miR-196b 在IgA 腎病中的研究較少，因此本研究重點探討miR-590、miR-196b 在IgA 腎病中的表達及作用，為臨床IgA 腎病檢查提供新的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2019年5月青海省婦女兒童醫(yī)院經(jīng)腎活檢病理診斷為原發(fā)性IgA 腎病患兒83 例。其中，男性42 例，女性41 例；年齡3～16 歲，平均（8.52±1.23）歲；病程1 個月～1.5年，平均（0.72±0.16）年。納入標準：符合IgA 腎病診斷標準[10]；腎活檢前3 個月未進行糖皮質(zhì)激素及（或）免疫抑制劑治療。排除標準：合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性紫癜、血液病等系統(tǒng)性疾病引起的繼發(fā)性IgA 腎??；腎活檢光鏡下腎小球數(shù)目＜8；eGFR＜10 mL/（min·1.73 m2）。選取非IgA 腎病患兒35 例，包括腎微小病變5 例、局灶節(jié)段性腎小球腎炎8 例、膜性腎病15 例、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥7 例。其中，男性19 例，女性16 例；年齡3～16 歲，平均（8.47±1.45）歲。另選取同期該院體檢健康兒童42例作為對照組。其中，男性18 例，女性24 例；年齡3～16 歲，平均（8.95±1.35）歲。3 組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有受試者均采集肘靜脈血2 mL，3 000 r/min，20 min 離心，取上清液，置入-20℃冰箱冷凍保存待測。

1.2.2 臨床指標 受試者年齡、性別、24 h 蛋白尿、血清白蛋白、血肌酐（Scr）。患兒血清IgA 水平采用免疫比濁法檢測。

1.2.3 病理分級 根據(jù)Lee 氏分級[11]分為Ⅰ級7 例，Ⅱ級8 例，Ⅲ級25 例，Ⅳ級16 例，Ⅴ級27 例。Ⅰ級：腎小球絕大多數(shù)正常，偶見輕度系膜增寬，伴和（或）不伴細胞增生，腎小管和腎間質(zhì)無改變。Ⅱ級：腎小球有局灶系膜增殖和硬化（＜50%），有小新月體，腎小管和腎間質(zhì)無損害。Ⅲ級：腎小球呈彌漫性系膜增值和增寬（偶爾局灶節(jié)段），偶見小新月體；腎小管和腎間質(zhì)改變則呈現(xiàn)出局灶性腎間質(zhì)水腫，偶見細胞浸潤，罕見腎小管萎縮；Ⅳ級：腎小球病變呈重度彌漫性系膜增生和硬化，部分或全部腎小球硬化，可見新月體（＜45%）。腎小管萎縮，腎間質(zhì)浸潤，偶見腎間質(zhì)泡沫細胞；V級：腎小球新月體形成＞45%；腎小管和腎間質(zhì)病變類似于Ⅳ級，但較Ⅳ級嚴重。

1.2.4 qRT-PCR 法檢測血清miR-590、miR-196b相對表達量 按照Trizol 試劑盒操作說明書提取血清總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將2 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Green RCR Master Mix 試劑說明書配制反應(yīng)體系并加樣。完成后將其放入熒光定量PCR 儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，共40 個循環(huán)。miR-590、miR-196b 以U6為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt算法計算miR-590、miR-196b 相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較

3 組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3組肌酐、白蛋白、24 h蛋白尿、血清IgA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IgA腎病組肌酐、24 h蛋白尿、血清IgA水平較對照組、非IgA腎病組升高（P＜0.05），IgA腎病組白蛋白水平較對照組、非IgA腎病組下降（P＜0.05）。見表2。

表2 3組一般資料比較

2.2 3 組受試者血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相對表達量的比較

3 組miR-590 mRNA、miR-196b mRNA 相 對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IgA 腎病組miR-590 mRNA 相對表達量較對照組、非IgA 腎病組下降（P＜0.05），IgA 腎病組miR-196b mRNA 相對表達量較對照組、非IgA 腎病組升高（P＜0.05）。見表3。

表3 3組受試者血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相對表達量比較

2.3 不同程度IgA 腎病患兒血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相對表達量比較

不同程度IgA腎病患兒miR-590 mRNA、miR-196b mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IgA 腎病組患兒miR-590 表達水平隨病情加重依次下降（P＜0.05），miR-196b 表達水平隨病情加重依次升高（P＜0.05）。見表4。

表4 不同程度IgA腎病患兒血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相對表達量的比較

2.4 miR-590、miR-196b 單獨及兩者聯(lián)合對IgA腎病的診斷作用

miR-590 對IgA 腎病診斷 的AUC 為0.873（95% CI：0.809，0.920），最佳截斷值為0.737，敏感性為84.1%（95% CI：0.748，0.910）、特異性為82.6%（95% CI：0.716，0.907）；miR-196b 對IgA 腎病診斷的AUC 為0.785（95% CI：0.713，0.847），最佳截斷值為1.927，敏感性為90.7%（95% CI：0.838，0.945）、特異性為64.8%（95% CI：0.513，0.750）；兩者聯(lián)合檢測對IgA 腎病診斷的AUC 為0.914（95% CI：0.858，0.952），敏感性為88.6%（95% CI：0.801，0.944）、特異性為87.0%（95%CI：0.767，0.939）。見圖1。

圖1 miR-590、miR-196b及兩者聯(lián)合檢測對IgA腎病診斷的ROC曲線

3 討論

研究[12]表明，糖基化異常的IgA 分子與抗聚糖IgG 自身抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物在血液循環(huán)中逃脫正常清除機制，在腎小球系膜區(qū)沉積，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)與系膜細胞的增殖導(dǎo)致腎小球損傷，是造成IgA 腎病的原因之一。林佳如等[13]研究表明，Th17 細胞免疫失衡在調(diào)控IgA 糖基化過程中發(fā)揮重要作用。研究[7]顯示，miR-590 mimics 可增強免疫效應(yīng)細胞的生存率，阻斷舌癌的免疫逃逸，進而減少免疫活性細胞凋亡。ZHOU 等[14]研究表明，miR-590 通過控制IL-2 表達對T 細胞免疫應(yīng)答，抑制結(jié)直腸癌血管生成和轉(zhuǎn)移。BROGAARD 等[15]研究顯示，miR-590 是豬對甲型H1N2 流感肺部免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。研究[8]顯示，miR-590 可抑制膿毒癥小鼠腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 表達從而減輕小鼠急性腎損傷程度。miR-590 通過靶向tob1 促進致病性th17 細胞分化，與多發(fā)性肝硬化有關(guān)[16]。以上研究均顯示，miR-590 可能與機體免疫活性密切相關(guān)。本研究IgA 腎病患兒血清miR-590 mRNA 相對表達量低于非IgA 腎病患兒及健康兒童，且隨IgA 腎病患兒病情加重而依次降低，提示miR-590 與IgA 腎病的發(fā)病、發(fā)展可能有一定聯(lián)系，猜測可能通過影響免疫系統(tǒng)平衡參與IgA 腎病發(fā)生，具體機制有待進一步研究。本研究ROC 結(jié)果顯示，血清miR-590 水平對診斷IgA 腎病的曲線下面積為0.873，特異性和敏感性均在80%左右，提示miR-590 可能作為診斷IgA 腎病的生物學(xué)指標，截斷值為0.737，表明miR-590 水平低于0.737 者發(fā)生IgA 腎病的風(fēng)險高，為基礎(chǔ)研究者和臨床診治者進行IgA 腎病研究及治療提供了miRNA 靶點。

研究表明，異常糖基化IgA 不足以致病，機體在氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生大量活性氧，ROS 堆積導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)遭到破壞，脂質(zhì)過氧化物造成細胞膜轉(zhuǎn)運功能障礙，酶活力、亞細胞器功能改變，自由基可經(jīng)離子通道進入細胞內(nèi)破壞細胞器成份，造成組織細胞損傷導(dǎo)致IgA 腎病的發(fā)生[17]。miR-196b 是miR-196 家族成員之一，位于人7p15.2 的進化高度保守區(qū)域[18]。孟嬌等[19]從IgA腎病患者活檢標本繪制出miRNA 表達圖譜，發(fā)現(xiàn)IgA 腎病患者中miR-196b等65 種miRNA 分子表達下調(diào)，且降低程度與病情嚴重程度密切相關(guān)，提示miR-196b 在早期IgA 腎病的病理發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究IgA 腎病患兒血清miR-196b 表達水平高于非IgA 腎病患兒及健康兒童，提示miR-196b 與IgA 腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。李慧聰?shù)萚20]研究表明，miR-196 高表達通過抑制二硫化物異構(gòu)酶A3 表達，進而抗氧化應(yīng)激能力減弱參與小鼠腎臟損傷。猜測miR-196 可能通過氧化應(yīng)激損傷途徑參與IgA 腎病的發(fā)生。進一步研究顯示，血清miR-196b 水平診斷IgA 腎病發(fā)病的曲線下面積為0.785，敏感性高，但特異性為64.8%，提示miR-196b 僅能作為輔助指標判別患兒是否發(fā)生IgA 腎病。本研究發(fā)現(xiàn)miR-590、miR-196b兩者聯(lián)合檢測診斷IgA 腎病曲線下面積、敏感性、特異性大或高于miR-590、miR-196b 對IgA 腎病的診斷效果。提示聯(lián)合檢測效果優(yōu)于單一檢測，可能作為臨床診斷IgA 腎病的輔助檢測指標，有利于先篩查出高危IgA 腎病患兒，再進一步進行腎活檢，從而優(yōu)化疑似IgA 腎病的診斷流程。

綜上所述，IgA 腎病患兒血清miR-590 低表達、血清miR-196b 高表達，兩者聯(lián)合檢測對IgA 腎病具有較高診斷價值。但本研究存在一定不足，由于樣本量較少，可能對本結(jié)果造成一定偏倚，此外對于miR-590、miR-196b 參與IgA 腎病的發(fā)病機制有待進一步研究。