甜菜鹽脅迫應(yīng)答基因的鑒定與功能分析(Ⅰ)

李俊良

(哈爾濱工業(yè)大學(xué))

0 前言

植物為適應(yīng)環(huán)境的變化需要不斷地調(diào)整自己的生長及生命進(jìn)程來應(yīng)對這種變化。這種適應(yīng)過程受到基因表達(dá)的動態(tài)調(diào)控，同時相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平通常也會隨著環(huán)境的變化而實時改變。與生理水平的研究進(jìn)展相比，作物在基因水平上對鹽脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制研究可謂是突飛猛進(jìn)[1]。表達(dá)譜測序是一種可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄鑒定和表達(dá)定量的高通量測序方法，廣泛用于研究基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異。本研究使用表達(dá)譜測序技術(shù)并結(jié)合WGCNA方法從轉(zhuǎn)錄水平分析甜菜對鹽脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 生物材料培育

實驗選用了本課題組選育的適應(yīng)性強(qiáng)/品質(zhì)性狀優(yōu)良特別是耐鹽性較強(qiáng)的栽培甜菜“O68”做為實驗材料。將催芽后的甜菜種子定植于定植棉中，定植棉放置在育苗盤上，定期加入適量水，待子葉完全展開后將定植棉插入定植籃后移入培養(yǎng)槽，培養(yǎng)槽內(nèi)裝入以1/2濃度的改良的霍格蘭營養(yǎng)液為培養(yǎng)基質(zhì)，水培法培育甜菜幼苗至三對真葉期。培育條件設(shè)置為光照(16 h；24℃)/黑暗(8 h；18℃)。培養(yǎng)基質(zhì)更換周期為3天。

1.2 鹽脅迫處理與樣品收集

選取長勢一致的3對真葉期幼苗分為5組：(1)使用正常培養(yǎng)基質(zhì)繼續(xù)培育72 h后取樣作為空白對照；(2)使用正常培養(yǎng)基質(zhì)培育60 h后移入添加了300 mM NaCl的培養(yǎng)基質(zhì)中繼續(xù)培育12 h后取樣作為鹽處理12 h組；(3)使用正常培養(yǎng)基質(zhì)培育48 h后移入添加了300 mM NaCl的培養(yǎng)基質(zhì)中繼續(xù)培育24 h后取樣作為鹽處理24 h組；(4)使用正常培養(yǎng)基質(zhì)培育24 h后移入添加了300 mM NaCl的培養(yǎng)基質(zhì)中繼續(xù)培育48 h后取樣作為鹽處理48 h組；(5)直接使用添加了300 mM NaCl的培養(yǎng)基質(zhì)中培育72 h后取樣作為鹽處理72 h組。表達(dá)譜測序使用1-5組的葉片和根共10組樣品。全轉(zhuǎn)錄組測序和small RNA測序使用Ⅰ和Ⅱ的葉片和根作為樣品。將1-5組的葉片和根樣品混合后分別執(zhí)行葉片和根的降解組測序?qū)嶒?。代謝組學(xué)使用1和2 的葉片樣品。

葉片的取樣部位為第3對真葉，根的取樣部位為自根尖向上起約6 cm長的區(qū)域。生理指標(biāo)測定所需樣本經(jīng)PBS漂洗后直接使用；高通量測序所需樣本經(jīng)PBS漂洗后使用鋁箔包裹，置于液氮中冷凍30分鐘后保存于-80℃待用。

1.3 表達(dá)譜測序挖掘甜菜鹽脅迫應(yīng)答基因

1.3.1 RNA的提取

稱取0.5 g葉片或根樣本，利用TRIZOL法(Invitrogen, CA, USA)提取每個樣品的總RNA。使用Bioanalyzer 2100和RNA 6000 Nano LabChip檢測RNA質(zhì)量，以RIN值>7.0作為合格標(biāo)準(zhǔn)。為盡可能排除植株個體差異對結(jié)果的影響，制作高質(zhì)量Total RNA預(yù)混池(分別提取6株相同處理葉片或根的RNA，質(zhì)檢合格后進(jìn)行混合)用于高通量測序文庫的構(gòu)建。

1.3.2 表達(dá)譜測序文庫構(gòu)建與測序

對于RNA-seq，取1 μg總RNA使用Poly-Toligo磁珠(Invitrogen)分離Poly(A)mRNA。純化后，使用二價陽離子(在高溫下)將mRNA裂解成小片段。然后依照mRNA Seq sample preparation kit(Illumina, San Diego，USA)方案，將打碎后的RNA片段進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建最終的cDNA文庫。文庫的平均插入長度為300 bp(±50 bp)。按前述構(gòu)建10組RNA-seq文庫，每組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，總計30個cDNA文庫。然后在聯(lián)川生物的Illumina NovaseqTM6000平臺上進(jìn)行雙端測序。

1.3.3 鹽脅迫應(yīng)答表達(dá)基因的鑒定與表達(dá)模式分析

首先使用Cutadapt[2]去除RNA-Seq數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)中的的引物/適配器污染、低質(zhì)量堿基和未確定堿基。然后利用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對序列質(zhì)量進(jìn)行驗證。使用Bowtie 2[3]和Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts (HISAT)[4]將clean reads映射到甜菜參考基因組RefBeet-1.2上(http://bvseq.boku.ac.at/Genome/Download/RefBeet-1.2/)。使用StringTie[5]計算各樣本的映射讀數(shù)。在最終轉(zhuǎn)錄組生成后利用StringTie和edgeR[6]計算樣本中各轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值被用來來衡量基因的表達(dá)量。使用edgeR進(jìn)行差異表達(dá)分析；使用T-test檢驗評估差異基因的顯著性；差異變動基因(differentially expression gene，DEG)的篩選閾值為p<0.05且|log2(fold change)|大于1。組間基因表達(dá)模式差異使用UpSetR[7]進(jìn)行可視化展示。

1.3.4 差異表達(dá)基因的功能分析

將所有表達(dá)基因與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Nr)進(jìn)行Blastx比對，E值篩選閾值設(shè)置為10-5。使用GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫[8]對所有表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋；計算每個term的基因數(shù)量，根據(jù)超幾何分布檢驗結(jié)果對各term進(jìn)行富集分析。使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)[9]數(shù)據(jù)庫對所有基因進(jìn)行注釋，根據(jù)超幾何分布檢驗結(jié)果對各pathway進(jìn)行富集分析。使用STRING數(shù)據(jù)庫分析DEG編碼蛋白間的互作關(guān)系[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽處理對甜菜表型的影響

在甜菜受到脅迫后通常會出現(xiàn)一段生長滯后，在其適應(yīng)脅迫后生長逐漸恢復(fù)，但是這種恢復(fù)的生長活力往往低于正常條件[11]。甜菜幼苗在300 mM NaCl處理后其表型如圖1所示：鹽處理下葉片首先失水萎蔫(12 h)；而處理時間的延長至(24 h)時幼葉(第三對真葉)逐漸從失水狀態(tài)恢復(fù)正常；當(dāng)處理時間的繼續(xù)延長至(72 h)時，第一對真葉表現(xiàn)出部分失綠(圖1a)。鹽處理下根系隨著處理時間的延長顏色逐漸加深，24 h時可以明顯觀察到根尖變黑，并且黑色區(qū)域隨處理時間的延長而逐步擴(kuò)大(圖1b)。

(a)葉片；(b)根圖1 鹽脅迫對甜菜幼苗表型的影響Fig.1 Effects of salt stress on the phenotype of sugar beet seedlings

2.2 甜菜鹽脅迫應(yīng)答基因的鑒定

2.2.1 甜菜鹽脅迫下的基因表達(dá)圖譜

實驗對28天苗齡的甜菜幼苗進(jìn)行300 mM NaCl處理， 5個取樣時間點分別為0 h、12 h、24 h、48 h和72 h。每個時間點設(shè)計3個生物學(xué)重復(fù)，最終構(gòu)建了30個轉(zhuǎn)錄組測序文庫。RNA-seq測序獲得了超過13.5億的raw reads，平均每個樣本4500萬個reads。經(jīng)過質(zhì)量控制篩選后共獲得13.2億，入選率達(dá)到97.6%的有效數(shù)據(jù)。這些Valid Data在基因組上的平均定位率為92.1%約12.2億，其中66.8%屬于Unique Mapped reads。RNA-seq數(shù)據(jù)信息、有效數(shù)據(jù)、映射比例見表1。

表1 表達(dá)譜數(shù)據(jù)概覽Tab.1 Summary of Expression profile data

本實驗共鑒定出27,677條表達(dá)基因，將基因表達(dá)水平量化成片段，每千堿基轉(zhuǎn)錄本每百萬映射reads(FPKM)。使用小提琴圖展示樣本基因表達(dá)分布統(tǒng)計如圖2。從圖中可以明確看出有樣本的測序質(zhì)量較好，且各生物學(xué)重復(fù)樣本間重復(fù)性較好?；赑earson相關(guān)系數(shù)法對所有樣本間的基因表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行評估見圖3，結(jié)果表明各生物學(xué)重復(fù)樣本間基因表達(dá)相關(guān)性極高(>0.99)；同一組織內(nèi)，不同處理時間點的各樣本間基因表達(dá)相關(guān)性相對較高，且鹽處理組之間的相關(guān)性要明顯高于處理組與對照組(ck)之間的相關(guān)性。但葉片和根不同的組織間的基因表達(dá)相關(guān)性較低。

圖2 RNA-seq所有樣本的基因表達(dá)分布統(tǒng)計Fig.2 Distribution of gene expression among RNA-seq samples

圖3 樣本間相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis among RNA-seq samples

2.2.2 甜菜鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的鑒定

過濾掉所有樣本中低豐度表達(dá)基因(FPKM<1)后，對剩余基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行評估。最終鑒定到11,992條差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)，其中葉片和根中的DEG分別有7,391和8,729條。對不同鹽處理時間下DEG的統(tǒng)計分析表明，葉片和根中分別含有39.4%(2,909條)和37.1%(3,238條)，僅在單一時間點呈現(xiàn)顯著差異的DEG，表明某些基因?qū)}脅迫的應(yīng)答存在時空特異性。葉片和根中DEG數(shù)量最高的處理時間點是12 h，其次是72 h、24 h和48 h(見圖4)。DEG的染色體定位顯示DEG的分布無明顯的染色體偏好(見圖5)。

圖4 葉片(a)和根(b)各樣本間差異基因分布圖Fig.4 Distribution of DEGs among samplesin leaves (a) and roots (b)

2.3 甜菜鹽脅迫應(yīng)答基因的功能分析

對DEG的GO分析獲得了5,847條GO term注釋，其中3,074條為生物過程、719條為細(xì)胞成分和2,054條為分子功能。細(xì)胞組排名前5的分依次是細(xì)胞、細(xì)胞區(qū)域、膜、細(xì)胞器和膜區(qū)域；生物進(jìn)程排名前5的依次是細(xì)胞進(jìn)程、新陳代謝進(jìn)程、刺激應(yīng)答、生物調(diào)控和生物進(jìn)程調(diào)控；分子功能排名前5的依次是結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、分子結(jié)構(gòu)活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(圖6)。

本研究利用RNA-seq技術(shù)，對鹽脅迫后甜菜葉片和根進(jìn)行了基因表達(dá)模式研究，在4個鹽處理時間點鑒定出11,992條DEG。通過對這些DEG功能分類表明，其功能可分為三個大類：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因、功能基因。(Ⅰ)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因：該類基因調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來傳遞脅迫信號并激活下游應(yīng)答途徑，如蛋白激酶、激素信號相關(guān)和ROS信號相關(guān)基因等；(Ⅱ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因：該類基因通過對轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平上的調(diào)控重構(gòu)植物在鹽脅迫下的基因表達(dá)系統(tǒng)，如可變剪接因子、轉(zhuǎn)錄因子和一些核酸內(nèi)切酶等；(Ⅲ)功能基因：它們編碼脅迫應(yīng)答相關(guān)物質(zhì)的合成，直接參與植物脅迫過程中生存和脅迫后恢復(fù)的一些特定過程，如光合酶、滲透調(diào)節(jié)物合成相關(guān)基因、和自由基清除相關(guān)基因等。

從上到下的順序為：紅色：生物進(jìn)程；藍(lán)色：細(xì)胞組分；綠色：分子功能圖6 差異基因的GO注釋Fig.6 GO annotation of DEGs

2.3.1 甜菜鹽脅迫應(yīng)答過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

在植物接觸NaCl的初始反應(yīng)中，刺激在數(shù)秒內(nèi)轉(zhuǎn)化為胞質(zhì)Ca2+濃度變化，構(gòu)成一種特殊的鈣信號[12]；隨后Ca2+信號依次被鈣依賴蛋白激酶(CDPK)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)/ calmodulin-like 蛋白、鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白(CBLs)和膜聯(lián)蛋白傳遞解碼，進(jìn)而觸發(fā)下游的細(xì)胞反應(yīng)[13]。

通過本研究鑒定出了300多條差異蛋白激酶編碼基因，囊括了前述所有類型蛋白激酶：如編碼CDPK 26的Bv9_215750_yqnm、編碼calmodulin-like protein 2的Bv2_035110_kyjk、編碼CBL相作絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的Bv7_157470_urmk、以及編碼膜聯(lián)蛋白RJ4的Bv2_041310_rnso等。Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX)是植物鹽超敏感信號通路(SOS)中的關(guān)鍵組分，它是植物細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)的唯一能夠把胞質(zhì)中Na+排除到細(xì)胞外的蛋白。本研究中發(fā)現(xiàn)了鹽脅迫下顯著上調(diào)的兩個NHX基因：Bv1_006770_xkmw和Bv_07430_jkji，它們可能在鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到重要作用。

胞質(zhì)Ca2+濃度的提高還會刺激ROS和ABA的產(chǎn)生，在細(xì)胞水平上可以激活鹽過度敏感(SOS)通路，并排除多余的Na+來進(jìn)而調(diào)控離子穩(wěn)態(tài)[14]。其中ROS信號的傳播依賴于呼吸爆發(fā)氧化酶同源物的激活，該同源物由乙烯、ABA依賴蛋白激酶和磷脂酸(PA)聯(lián)合控制。本研究中在鹽脅迫過程中編碼呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白A(Bv5_099740_zpio)顯著上調(diào)，可能在葉片ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。細(xì)胞內(nèi)ABA的快速累積依賴于雙加氧酶對類胡蘿卜素前體的裂解，在鹽脅迫下甜菜中的Bv_01350_texx和NCED5(Bv_004050_xzzo)兩個9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因NCED1顯著上調(diào)。我們認(rèn)為鹽脅迫下誘導(dǎo)甜菜ABA合成。Ca2+或ROS均可調(diào)節(jié)ABA的釋放，進(jìn)而引導(dǎo)下游離子通道的打開或閉合、滲透保護(hù)劑的合成以及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)等等。此外，一些ABA和乙烯代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因如編碼PP2C家族成員的PP2C8(Bv3_052290_rcph)、PP2C24(Bv7_173230_chqm)和PP2C56(Bv8_197440_jnqo)；編碼玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶的Bv_003210_fkxn、以及編碼乙烯生物合成途徑關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶基因(ACO)的Bv8_185300_wndh和Bv1_004040_gcto等均在鹽脅迫下顯著上調(diào)。

2.3.2 甜菜鹽脅迫應(yīng)答過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子可以與靶基因5′ORF區(qū)域目標(biāo)序列特異性性結(jié)合，從而調(diào)控靶標(biāo)基因在特定的時間和空間以特定的強(qiáng)度表達(dá)。它通過調(diào)控一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)而改變細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組，從而在植物適應(yīng)環(huán)境過程中發(fā)揮核心作用。本研究鑒定的500多條轉(zhuǎn)錄因子(圖7)包含了來自DEG中的53個家族。排名Top5的家族依次是MYB、AP2-EREBP、bHLH、MYB-related和NAC。其中的39個家已經(jīng)族被植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫Plant Transcription Factor Database 4.0(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Bvu)中的甜菜子數(shù)據(jù)庫收錄。此外，本研究鑒定到14個甜菜中存在的轉(zhuǎn)錄因子家族還未被該數(shù)據(jù)庫收錄如mTERF、ABI3/VP1、LOB、OFP等。

圖7 差異基因中的轉(zhuǎn)錄因子分布Fig.7 Transcription factor distribution in DEGs

DEG對鹽脅迫的應(yīng)答通?？梢苑譃閮煞N類型：ABA依賴/非ABA依賴型。非ABA依賴基因啟動子中通常包含脫水反應(yīng)元件/C-重復(fù)序列(DRE/CRTs)，并受AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。本研究共鑒定出73條AP2-EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子，其中絕大部分在鹽脅迫下差異表達(dá)，對該家族成員的染色體定位分析發(fā)現(xiàn)它們廣泛分布于甜菜的9條染色體上(圖8)，可能與甜菜非ABA依賴型鹽脅迫應(yīng)答基因的激活密切相關(guān)。例如，AP2-EREBP家族的兩個脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白DREB 1(Bv3_066590_ignp)和DREB 2(Bv2_044600_drzk)在鹽脅迫下顯著上調(diào)。另一類依賴于ABA介導(dǎo)的鹽脅迫應(yīng)答基因，通常在其啟動子區(qū)域包含一個保守的ABA應(yīng)答順式作用元件(ABRE)。ABRE可以被含有基礎(chǔ)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basic leucine zipper structure, bZIP)的轉(zhuǎn)錄因子識別。圖7是本研究中發(fā)現(xiàn)的編碼bZIP家族成員的DEG。如：Bv3_050990_kqjn、Bv9_214630_fnpa、Bv1_013750_smoy等。

Dicer-like(DCL)蛋白是雙鏈RNA(dsRNA)特異性的核糖核酸內(nèi)切酶，在雙鏈RNA或帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA(如miRNA前體)切割過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)了7個鹽脅迫下差異表達(dá)的甜菜DCL基因，如Dicer同源蛋白1(Bv1_001950_imjw)。Argonaute蛋白直接與小RNA結(jié)合，并在所有小RNA介導(dǎo)的基因沉默過程中發(fā)揮重要作用，此外有研究表明Argonaute蛋白還與染色質(zhì)修飾和可變剪接相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)了6個鹽脅迫下差異表達(dá)的甜菜Argonaute基因。上述結(jié)果表明，在多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑之間存在相互作用，構(gòu)成了鹽脅迫下復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖8 甜菜差異表達(dá)AP2/ERF家族成員染色體分布Fig.8 Chromosome distribution of DE AP2/ERF family members in sugar beet

2.3.3 甜菜鹽脅迫應(yīng)答過程中的功能基因

植物適應(yīng)鹽脅迫的第一步是解決環(huán)境中高鹽度引起的滲透脅迫，甜菜堿作為細(xì)胞內(nèi)的滲透保護(hù)劑在這一過程中起著至關(guān)重要的作用。編碼甜菜堿合成的兩個關(guān)鍵酶基因膽堿單加氧酶(Bv6_146100_wdro)和甜菜堿醛脫氫酶(Bv5_116230_ntjn)在鹽脅迫下顯著上調(diào)。水通道蛋白也是一種響應(yīng)鹽脅迫的功能蛋白。編碼甜菜水通道蛋白PIP2-1的基因Bv7_162410_cqnr在鹽脅迫下表現(xiàn)為葉片和根中均顯著上調(diào)。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)經(jīng)常用來評估植株的抗逆性，編碼甜菜Gu/Zn-SOD基因Bv_08010_smke、編碼Fe-SOD基因Bv5_097450_sxsu和編碼Mn-SOD 基因Bv2_045060_jxsu在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)。根中編碼POD 66的Hub基因Bv3_066080_qmgn也在鹽脅迫下顯著上調(diào)。硫氧還蛋白(thioredoxin)和谷氧還蛋白(glutaredoxin)在維持植物細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)中也起著重要作用[17]。本研究鑒定了16條編碼硫氧還蛋白的DEG和10條編碼谷氧還蛋白的DEG。包括葉中編碼F型硫氧還蛋白的Hub基因Bv4_075150_andd。另外，本研究發(fā)現(xiàn)了25條鹽脅迫下差異表達(dá)的甜菜GST基因，其中甜菜葉片中的Hub基因Bv4_095830_aore。ASA-GSH循環(huán)是植物清除ROS的一個重要的途徑。谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是該系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。本研究中編碼GPX的基因Bv5u_121470_tcou的表達(dá)受鹽脅迫的顯著誘導(dǎo)。

葉綠體是對鹽脅迫最敏感的細(xì)胞器。參與光系統(tǒng)Ⅰ光合電子傳遞的質(zhì)子梯度調(diào)節(jié)蛋白5編碼基因Bv3_048340_odeme、參與光反應(yīng)調(diào)控的STN7蛋白激酶編碼基因Bv6_155590_ugjw等直接參與光合作用的基因在鹽脅迫下顯著上調(diào)。

2.4 甜菜鹽脅迫應(yīng)答core基因的篩選與功能分析

部分DEG在甜菜葉片或根的表達(dá)明顯不同具有時空特異性，而有部分DEG在葉片和根中的所有鹽處理時間點下均呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)。即這些鹽脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)不具有明顯的時空特異性，這類DEG可能構(gòu)成了甜菜對鹽脅的基礎(chǔ)應(yīng)答，本研究將中將這類DEG歸為core基因。我們通過交叉比較了葉片和根中各處理時間點之間的DEG，最終鑒定出244條core基因，其中206條在葉片和根之間的表達(dá)趨勢相同，38條表達(dá)趨勢相反(圖9)。

圖9 基礎(chǔ)應(yīng)答基因表達(dá)模式分析Fig.9 Expression pattern analysis of core DEGs

對core基因的GO分析顯示：超過90%的core基因都可以注釋到氧化還原進(jìn)程(GO:0055114)；超過80%的core基因都可以注釋到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA-模板(GO:0006355)；此外許多core基因被注釋到與脅迫應(yīng)答直接相關(guān)的生物進(jìn)程如缺水響應(yīng)(GO:0009414)、脫落酸應(yīng)答(GO:0009737)、氧化應(yīng)激響應(yīng)(GO:0006979)、鹽脅迫響應(yīng)(GO:0009651)和滲透脅迫響應(yīng)(GO:0006970)等(圖10a)。分子功能注釋顯示core基因主要執(zhí)行蛋白結(jié)合(GO:0005515)和金屬離子結(jié)合(GO:0046872)等功能。KEGG分析顯示core基因主要富集在淀粉和蔗糖代謝與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中(圖10b)。

圖10 基礎(chǔ)應(yīng)答基因的GO注釋(a)和KEGG分析(b)Fig.10 GO and KEGG analysis of core DEGs

對所有core DEG的功能進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下葉片和根中的蔗糖合成酶(Bv7_163460_jmqz)和β-淀粉酶1(Bv_005770_atmm)顯著上調(diào)。研究顯示許多植物在非生物脅迫下會積累蔗糖合成酶和β-淀粉酶1，糖代謝產(chǎn)物不僅在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而且在光合作用受限時也發(fā)揮著供應(yīng)能量和碳源的作用。植物在感知環(huán)境脅迫后，通常會犧牲生長并激活保護(hù)性脅迫反應(yīng)。ABA在脅迫信號整合和下游反應(yīng)激活過程中發(fā)揮重要作用。3個ABA相關(guān)core DEG(Bv3_052290_rcph、Bv4_087620_atdx和Bv7_173230_chqm)在鹽脅迫下顯著上調(diào)。Bv3_052290_rcph和Bv7_173230_chqm編碼兩個蛋白磷酸酶PP2C(protein phosphatase 2C)家族成員，可以作為負(fù)調(diào)控因子在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[18]；另外一項研究顯示鹽脅迫下擬南芥PP2C也可以與AtHKT1相互作用，調(diào)節(jié)Na+的分布[19]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)苯丙素和黃酮醇相關(guān)core DEG在葉片和根中表達(dá)均上調(diào)。非生物脅迫條件下可能激活苯丙素和黃酮醇生物合成途徑，通過累積各種酚類化合物清除有害ROS[20]?？傊?，這些core DEG通過調(diào)控甜菜的蔗糖-淀粉代謝、調(diào)節(jié)植物激素信號通路、激活苯丙素和黃酮醇代謝通路來響應(yīng)鹽脅迫。我們認(rèn)為對這些代謝途徑的調(diào)控構(gòu)成了甜菜對鹽脅迫的基礎(chǔ)應(yīng)答。

2.5 甜菜響應(yīng)鹽脅迫的hub基因鑒定與生物信息學(xué)分析

關(guān)鍵基因(hub gene)指在某些生物學(xué)進(jìn)程中起至關(guān)重要作用的基因，在一些相關(guān)通路中，其他基因的調(diào)控往往會受到該基因的影響[21]。因此，hub gene 通?？梢宰鳛橹匾淖饔冒悬c。目前可以通過共表達(dá)或蛋白相互作用構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，然后根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)篩選關(guān)鍵基因。

2.5.1 甜菜DEG共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究依據(jù)WGCNA算法分別利用葉片和根中DEG的表達(dá)值(FPKM值)構(gòu)建共表達(dá)模塊。最終分別將葉片和根中的DEG劃歸為11個共表達(dá)模塊。無法劃歸任何模塊的基因均統(tǒng)一劃歸為灰色模塊，本研究中葉片的11個模塊不包含灰色模塊，而根中的11個模塊包含灰色模塊，該模塊擁有28個DEG，占根中DEG的0.32%。繼續(xù)使用WGCNA算法構(gòu)建模塊與處理時間的對應(yīng)關(guān)系(圖11)。

(a)葉片；(b)根圖11 模塊-樣本相關(guān)性分析Fig.11 Module-sample correlation analysis

通常與樣本具有較高Spearman相關(guān)系數(shù)的模塊也是與處理時間最相關(guān)的模塊。依據(jù)P值最終在葉片和根中分別篩選了5個和4個符合標(biāo)準(zhǔn)的模塊作為關(guān)鍵模塊進(jìn)行進(jìn)一步分析。其中葉片中的5個模塊分別是：對應(yīng)0 h的包含2181條DEG的藍(lán)綠色模塊 (Module Turquoise)、對應(yīng)12 h的包含1115條DEG的棕色模塊(Module Brown)、對應(yīng)24 h的包含58條DEG的黃綠色模塊(Module Greenyellow)、對應(yīng)48 h的包含121條DEG的紫色模塊(Module Purple)以及對應(yīng)72 h的包含1638條DEG的藍(lán)色模塊(Module Blue)(圖11a)。根中的4個模塊分別是：對應(yīng)0 h的包含2501條DEG的藍(lán)綠色模塊(Module Turquoise)、對應(yīng)12 h包含1038條DEG的黃色模塊(Module Yellow)、對應(yīng)24 h的包含980條DEG的綠色模塊(Module Green) 以及對應(yīng)于72 h的包含2052條DEG的藍(lán)色模塊(Module Blue)(圖11b)。根中48 h無對應(yīng)的顯著相關(guān)(P<0.1)模塊。

2.5.2 關(guān)鍵模塊基因表達(dá)模式分析

表達(dá)模式分析顯示關(guān)鍵模塊間的基因表達(dá)存在顯著差異，各模塊內(nèi)基因均在模塊關(guān)聯(lián)的時間點處呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)(圖12)。例如葉片Brown模塊內(nèi)基因在鹽處理12 h時呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)(圖12a)，根 Yellow模塊內(nèi)基因在鹽處理12 h時顯著差異表達(dá)(圖12b)?？偟膩砜?，對照組關(guān)聯(lián)模塊(Turquoise)的大部分基因表達(dá)被鹽脅迫抑制，處理組關(guān)聯(lián)模塊的大部分基因表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)。

(a)葉片中的5個關(guān)鍵模塊；(b)根中的4個關(guān)鍵模塊圖12 每個關(guān)鍵模塊的基因表達(dá)模式Fig.12 The expression profiles of genes in each critical module

2.5.3 關(guān)鍵模塊基因功能分析

葉片中關(guān)鍵模塊基因的GO富集分析顯示(圖13)：鹽脅迫下Turquoise模塊內(nèi)富集度較高的生物進(jìn)程是翻譯(GO:0006412)和核糖體大亞基組合(GO:0000027)；富集度較高的的細(xì)胞組分是葉綠體基質(zhì)(GO:0009570)和胞質(zhì)大核糖體亞基(GO:0022625)；富集度較高的分子功能是核糖體的結(jié)構(gòu)組成部分(GO:0003735)。Brown模塊內(nèi)基因富集度較高的生物進(jìn)程是乙烯激活信號通路負(fù)調(diào)控(GO:0010105)；富集度較高的細(xì)胞組分是細(xì)胞核(GO:0005634)；富集度較高的分子功能是鈣離子結(jié)合(GO:0005509)。Greenyellow模塊內(nèi)基因主富集度較高的生物進(jìn)程是RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的調(diào)控(GO:0006357)和磷酸化(GO:0016310)；富集度較高的細(xì)胞組分是核仁(GO:0005730)；富集度較高的分子功能是RNA聚合酶Ⅱ調(diào)控的序列特異性DNA結(jié)合(GO:0000977)。Purple模塊內(nèi)基因富集度較高的細(xì)胞組分是中央葉泡(GO:0042807)；富集度較高的分子功能是蛋白二聚活動(GO:0046983)。Blue模塊內(nèi)基因富集度較高的生物進(jìn)程是蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴的蛋白降解過程(GO:0043161)和蛋白水解相關(guān)細(xì)胞蛋白分解代謝過程(GO:0051603)；富集度較高的細(xì)胞組分是細(xì)胞外空間(GO:0005615)和溶酶體(GO:0005764)；富集度較高的分子功能是半胱氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性(GO:0004197)。

圖13 葉片關(guān)鍵模塊基因的GO富集分析Fig.13 Go enrichment analysis of critical module genes in leaves

根中關(guān)鍵模塊基因的GO富集分析顯示(圖14)：鹽脅迫下Turquoise模塊內(nèi)富集度較高的生物進(jìn)程是草酸代謝過程(GO:0033609)、細(xì)胞表面受體信號通路(GO:0007166)和防御應(yīng)答(GO:0006952)；富集度較高的細(xì)胞組分是膜的整體構(gòu)件(GO:0016021)、細(xì)胞壁(GO:0005618)和液泡膜(GO:0005774)；富集度較高的分子功能是ATP結(jié)合(GO:0005524)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(GO:0004674)和草酸脫羧酶活性(GO:0046564)。Yellow模塊內(nèi)富集度較高的生物進(jìn)程是鹽脅迫應(yīng)答(GO:0009651)和類黃酮生物合成(GO:0009813)；富集度較高的細(xì)胞組分是胞質(zhì)(GO:0005829)；富集度較高的分子功能是槲皮素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0080043)和槲皮素7-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0080044)。Green模塊內(nèi)富集度較高的生物進(jìn)程是植物型次生細(xì)胞壁發(fā)生(GO:0009834)、木質(zhì)素生物合成(GO:0009809)和脂肪酸生物合成(GO:0006633)；富集度較高的細(xì)胞組分是膜的整體構(gòu)件(GO:0016021)和細(xì)胞外區(qū)域(GO:0005576)；富集度較高的分子功能是過氧化物酶活性(GO:0004601)、血紅素結(jié)合(GO:0020037)和作用于酯鍵的水解酶活性(GO:0016788)。Blue模塊內(nèi)富集度較高的生物進(jìn)程是DNA模板轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控(GO:0045892)，DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(GO:0045893)和脫落酸應(yīng)答(GO:0009737)；富集度較高的細(xì)胞組分是細(xì)胞核(GO:0005634)；富集度較高的分子功能是核酸結(jié)合(GO:0003676)。

圖14 根關(guān)鍵模塊基因的GO富集分析Fig.14 Go enrichment analysis of critical module genes in roots

葉片中關(guān)鍵模塊的基因KEGG富集分析顯示(圖15a)：Turquoise模塊基因富集度較高的通路是核糖體(ko03010)和脂肪酸生物合成(ko00061)；Brown模塊基因富集度較高的通路是精氨酸和脯氨酸的代謝(ko00330)和內(nèi)吞作用(ko04144)；Greenyellow模塊基因富集度較高的通路是光合作用生物中的碳固定(ko00710)和植物-病原互作(ko04626)；Blue模塊基因富集度較高的通路是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)和其他類型的鄰聚糖生物合成(ko00514)。根中關(guān)鍵模塊的基因KEGG富集分析顯示(圖15b)：Turquoise模塊基因富集度較高的通路是植物-病原互作(ko04626)和RNA聚合酶(ko03020)；Yellow模塊基因富集度較高的通路是谷胱甘肽代謝(ko00480)和花生四烯酸代謝(ko00590)；Green模塊基因富集度較高的通路是苯丙素的生物合成(ko00940)和丙酮酸代謝(ko00620)；Blue模塊基因富集度較高的通路是RNA運(yùn)輸(ko03013)和mRNA監(jiān)測通路(ko03015)。

總的來看，使用WGCNA法對DEG進(jìn)行歸類后，各關(guān)鍵模塊基因的表達(dá)模式和功能均存在高度的特異性，符合我們的預(yù)期目標(biāo)。有助于從大量DEG之間挖掘關(guān)鍵耐鹽基因，探尋甜菜應(yīng)對鹽脅迫的分子機(jī)理。

2.5.4 鹽脅迫應(yīng)答Hub基因的鑒定

本研究首先利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)計算模塊內(nèi)基因的連通度，通常連通度值越高的基因越可能是潛在的Hub基因。然而當(dāng)連通度值極度相近的情況下(如葉片Turquoise模塊中Bv5_105240_scsk和Bv1_016890_iiqe的連通度值分別為1140.9和1140.7)，以連通度值作為唯一判定標(biāo)準(zhǔn)是不夠科學(xué)的。因此我們選擇模塊內(nèi)連通度值前20 %的基因作為候選Hub基因，利用STRING構(gòu)建這些基因編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)；然后利用CytoHubba中的11種算法分別評估各模塊內(nèi)的top10 Hub基因；最后以候選基因在11種算法top10 Hub基因中的出現(xiàn)頻次聯(lián)合基因的連通度值為每個模塊篩選出6個最可能的Hub基因。

圖15 葉片(a)和根(b)中關(guān)鍵模塊基因的KEGG富集分析Fig.15 KEGG enrichment analysis of critical module genes inleaves (a) and roots (b)

2.5.4.1 Hub基因在葉片中的鑒定與功能分析

葉片中篩選出的Hub基因見表3-2。鹽脅迫下，Turquoise模塊內(nèi)大部分基因的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。Hub基因Bv2_041930_qfdi編碼的膽色素原脫氨酶是植物葉綠素生物合成過程中的關(guān)鍵酶，甜菜葉片遭受鹽脅迫后葉綠素含量顯著降低可能與受到該Hub基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。Hub基因Bv1_000340_ezio編碼葉綠體30S 核糖體蛋白、Hub基因Bv2_036440_xjzx編碼40S核糖體蛋白、Hub基因Bv5_110020_fucg編碼mRNA結(jié)合伴侶ACD11，這些基因參與mRNA的結(jié)合及后續(xù)加工過程，它們的下調(diào)與鹽脅迫后生長發(fā)育受阻相符，這些Hub基網(wǎng)絡(luò)可能參與調(diào)控植株從生長向應(yīng)激狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。Hub基因Bv2_029170_pxtq編碼環(huán)阿屯醇-C-24-甲基轉(zhuǎn)移酶(SMT)，它是植物甾醇代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶，從圖16可以看出，抑制該基因的表達(dá)可以提高植物膽甾醇的累積，阻礙了環(huán)阿屯醇前體流向豆甾醇合成分支，促進(jìn)植物甾體類化合物流向其他合成分支方向(如油菜素甾醇)，對擬南芥SMT基因的早期研究支持了這種推斷[22]。

Brown模塊Hub基因Bv2_023810_guyf編碼DExH-box ATP依賴RNA解旋酶DExH 17，最新研究顯示該基因調(diào)控核酸-蛋白質(zhì)相分離為細(xì)胞提供了各種RNA處理步驟的時空控制，通過引導(dǎo)RNA分子進(jìn)入相分離的區(qū)室，調(diào)節(jié)RNA成熟狀態(tài)、核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)的組成并最終調(diào)節(jié)RNA命運(yùn)[23]。

表2 葉片關(guān)鍵模塊中鑒定的Hub基因Tab.2 The Hub genes detected in critical modules in leaves

本研究中該基因在鹽脅迫后顯著上調(diào)并在12 h時達(dá)到峰值，說明以它為核心的基因網(wǎng)絡(luò)可能通過參與早期鹽脅迫應(yīng)答基因的加工處理為甜菜鹽脅迫應(yīng)激過程做出貢獻(xiàn)。Hub基因Bv6_130450_umcu編碼葉綠體早期脫水響應(yīng)蛋白。Hub基因Bv5_099740_zpio編碼呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白A參與ROS信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Hub基因Bv6_149930_qmfq編碼莽草酸激酶，莽草酸是芳香氨基酸、生物堿和吲哚衍生物等的前體，該酶通過催化莽草酸的磷酸化參與調(diào)控莽草酸代謝，已有研究顯示莽草酸途徑與水稻的鹽脅迫應(yīng)答過程相關(guān)[24]。

綠色：甜菜中存在組件；黃色：DEG；紅色邊框：植物甾醇代謝圖16 鹽脅迫下甜菜類固醇生物合成通路分析Fig.16 Pathway analysis of steroid biosynthesis in sugar beet under salt stress

Greenyellow模塊受樣本總量限制只篩選3個Hub基因。Bv4_074970_andd編碼葉綠體中F型硫氧還蛋白，Bv4_095830_aore編碼GST蛋白，以他們?yōu)楹诵牡腍ub基因網(wǎng)絡(luò)可能為細(xì)胞的抗氧化過程做出巨大貢獻(xiàn)。

葉片Purple模塊Hub基因Bv1_016400_jjoj編碼葉綠體中的伴侶蛋白dnaJ 11；Hub基因Bv4_086990_pgms編碼泛素連接酶E2 26；以它們?yōu)楹诵牡幕蚓W(wǎng)絡(luò)通過調(diào)控蛋白質(zhì)的加工參與鹽脅迫應(yīng)答。兩個Hub基因編碼2種轉(zhuǎn)錄因子bHLH 35和鋅指蛋白22。Hub基因Bv_005490_qmph編碼磷酸代謝蛋白8；Hub基因Bv7_172340_kzsr編碼非特異性磷脂酶C1(NPC)，該酶可以催化磷脂酰膽堿(PC)水解產(chǎn)生甘油二酯(DAG)，DAG再次代謝后生成磷脂酸(PA)，PA是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，可以激活多種脅迫應(yīng)答途徑。以它們?yōu)楹诵牡幕蚓W(wǎng)絡(luò)可能通過PLC-DGK/PA途徑[25]參與鹽脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與應(yīng)答。

葉片Blue模塊Hub基因Bv5_118050_deeh編碼一種E3泛素蛋白U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白52。Hub基因Bv6_139660_wjii編碼亮氨酸拉鏈蛋白ATHB-40；hub基因Bv6_133290_wkjd編碼翻譯起始因子IF-2；以他們?yōu)楹诵牡幕蚓W(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯過程響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)答。Hub基因Bv2_042060_ccft編碼膽堿激酶2，以該基因為核心的網(wǎng)絡(luò)最終也可能通過PLC-DGK/PA途徑參與鹽脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與應(yīng)答。脅迫72 h后的甜菜老葉呈出萎蔫與失綠的性狀，說明長時間的鹽脅迫已經(jīng)對甜菜幼苗的存活造成一定影響，Bv2_033120_umqq編碼液泡加工酶(VPE)；以VPE為核心的基因網(wǎng)絡(luò)可能與細(xì)胞衰老相關(guān)。

2.5.4.2 Hub基因在根中的鑒定與功能分析

根中Hub基因見表3?；腔磻?yīng)是機(jī)體對內(nèi)源性和外源性化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵反應(yīng)。Turquoise模塊Hub基因Bv2_042180_yfwq編碼胞質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶，它可以催化生物體內(nèi)黃酮類化合物轉(zhuǎn)化成硫酸鹽而降低利用率[26]，因此以該基因為核心的網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)控激素和黃酮類化合物的利用來影響甜菜的發(fā)育與抗逆。此外，一些次生代謝相關(guān)的Hub基因如編碼重金屬相關(guān)異戊烯基類黃酮植物蛋白的Bv_016430_xjdf和編碼7-去氧番木鱉酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的Bv4_077620_xkxs也在受到脅迫后顯著下調(diào)。這些結(jié)果說明甜菜根細(xì)胞在遭受鹽脅迫后會調(diào)整次生代謝方向，調(diào)控植株從生長狀態(tài)向應(yīng)激狀態(tài)轉(zhuǎn)換以適應(yīng)環(huán)境改變。另外編碼包含L型凝集素結(jié)構(gòu)的受體激酶、LRR受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和包含重復(fù)的錨蛋白NPR4的3個Hub基因都與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，這些Hub基因網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)控甜菜根系在鹽脅迫下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來參與鹽脅迫應(yīng)答過程。

表3 根中從WGCNA核心模塊中鑒定的Hub基因Tab.3 The Hub genes detected in critical WGCNA modules in roots

Yellow模塊中，Hub基因Bv5_124870_ydpo編碼解毒蛋白 48，以該基因為核心的網(wǎng)絡(luò)可能與金屬離子解毒相關(guān)。此外，以Bv6_129310_ndoa為核心的Hub基因網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)控依賴于ATP的離子運(yùn)輸輔助解毒過程。

以Hub基因Bv1_009510_hfps為核心的網(wǎng)絡(luò)與蛋白泛素化過程相關(guān)。編碼液泡氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Hub基因Bv2_046760_tquf在鹽脅迫12時表達(dá)上調(diào)了80倍，液泡占據(jù)植物細(xì)胞的大部分體積，它參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，控制細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)累積和運(yùn)輸，提高植物適應(yīng)環(huán)境變化和生存的能力，該Hub基因網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)控氨基酸的調(diào)配過程在鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用。Hub基因Bv3_067190_wskz編碼過氧化物酶體中脂肪酸β氧化多功能蛋白MFP 2，以該基因為核心的網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)控能量代謝為甜菜根細(xì)胞鹽脅迫應(yīng)答供能。編碼谷氨酸脫羧酶4的Hub基因Bv6_131780_uxzh在鹽脅迫12時表達(dá)上調(diào)了7倍，該酶催化谷氨酸鹽生成γ-氨基丁酸(GABA)，許多研究顯示植物在逆境脅迫下會大量累積GABA，首先GABA的合成過程會消耗大量氫離子從而維護(hù)細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境；其次生成的GABA可以作為小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；過量的GABA會抑制植物的生長，GABA含量的升高可以提高植物對氧化脅迫的耐受性；此外，迅速累積的GABA可能是一種內(nèi)源性逆境信號分子[27-28]。因此該Hub基因網(wǎng)絡(luò)通過調(diào)控GABA相關(guān)代謝參與甜菜根細(xì)胞對鹽脅迫的應(yīng)答。

Green模塊Hub基因Bv2_044780_rzxx編碼3-酮脂酰-CoA合酶，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的脂肪酸鏈的伸長相關(guān)，該Hub基因網(wǎng)絡(luò)可能影響膜脂的不飽和度以及非雙分子層脂質(zhì)的比例，從而改變細(xì)胞膜的流動性來調(diào)控甜菜根系對鹽脅迫的應(yīng)答。Hub基因Bv1_016480_prnw編碼IN2-1同源蛋白，該蛋白屬于GST蛋白，以該Hub基因為核心的網(wǎng)絡(luò)可能在根細(xì)胞非酶促抗氧化防御過程中發(fā)揮重要作用。Hub基因Bv2_043550_pccg編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員32。木質(zhì)素是對植物結(jié)構(gòu)支撐和水分運(yùn)輸十分重要的生物大分子，它也可以提高作物的抗逆性，編碼過氧化物酶66的Hub基因Bv3_066080_qmgn可以催化木質(zhì)素的生物合成。有研究顯示鹽脅迫會抑制根系的生長并誘導(dǎo)根系木質(zhì)化[28-30]。以該基因為核心的網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)控根系木質(zhì)素的合成響應(yīng)鹽脅迫。

總的來看，我們篩選出的Hub基因在生物學(xué)上具有重要意義，有助于解析甜菜鹽脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理。

2.5.5 甜菜轉(zhuǎn)錄水平的鹽脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別為葉片和根構(gòu)建了由core基因、Hub基因和重要鹽脅迫應(yīng)答基因組成的轉(zhuǎn)錄水平鹽脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)。同時利用STRING數(shù)據(jù)庫對這些基因間編碼蛋白間的互作關(guān)系進(jìn)行注釋。在葉片中(圖17)，鹽脅迫造成甜菜葉片生長遲滯，并導(dǎo)致葉綠素合成受阻，因此葉片細(xì)胞下調(diào)了大量核糖體編碼基因的表達(dá)，以削減mRNA后續(xù)加工過程；同時迅速調(diào)整次生代謝物的合成流向于有利于脅迫應(yīng)答的分支。在受到鹽脅迫的早期(12 h和24 h)，ATP依賴RNA解旋酶基因表達(dá)顯著上調(diào)，調(diào)控脅迫應(yīng)答相關(guān)mRNA的緊急加工；同時一些ROS信號和ROS清除相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。在鹽脅迫的中期(48 h)，一些轉(zhuǎn)錄因子如bHLH35和鋅指蛋白22編碼基因顯著上調(diào)，同時NPC等基因的上調(diào)可能激活PLC-DGK/PA途徑調(diào)控鹽脅迫應(yīng)答過程。在鹽脅迫的晚期(72 h)，VPE等基因的上調(diào)可能與葉片細(xì)胞的衰老相關(guān)。值得注意的是，葉片中許多Hub基因均定位于葉綠體，反映出該細(xì)胞器在鹽脅迫應(yīng)答過程中的重要作用。此外，鹽脅迫后多種泛素蛋白編碼基因在各時間點特異性高表達(dá)，說明蛋白修飾過程在鹽脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。

在根中(圖18)，遭受鹽脅迫后根系生長受到抑制，許多受體激酶基因表達(dá)顯著下調(diào)，次生代謝方向迅速發(fā)生改變。在受到鹽脅迫的早期(12 h和24 h)，GABA等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)迅速累積，多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)顯著上調(diào)促進(jìn)根細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的重新調(diào)配，次生代謝流向木質(zhì)素生物合成代謝，誘導(dǎo)根系木質(zhì)化；脂肪酸分解代謝加劇為細(xì)胞提供能量；此外，谷胱甘肽相關(guān)基因也在這一時期顯著上調(diào)，有助于根細(xì)胞的抗氧化防御。在鹽脅迫的晚期(72 h)，一些轉(zhuǎn)錄因子如RAP2-4和ERF54、轉(zhuǎn)錄延伸因子AFF4和鈣調(diào)蛋白編碼基因顯著上調(diào)。這些基因通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程參與鹽脅迫應(yīng)答。

正方形代表與時間點對應(yīng)的葉中關(guān)鍵模塊；大圓點代表hub基因，core基因聚集在中心區(qū)域，紅色：表達(dá)上調(diào)，綠色：表達(dá)下調(diào)；紅線代表STRING數(shù)據(jù)庫注釋的互作關(guān)系圖17 葉片轉(zhuǎn)錄水平鹽脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)Fig.17 Transcriptional network of leaves in responses to salt stress

菱形代表與時間點對應(yīng)的葉中關(guān)鍵模塊；大圓點代表hub基因，core基因聚集在中心區(qū)域，紅色：表達(dá)上調(diào)，綠色：表達(dá)下調(diào)；紅線代表STRING數(shù)據(jù)庫注釋的互作關(guān)系圖18 根轉(zhuǎn)錄水平鹽脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)Fig.18 Transcriptional network of roots in responses to salt stress

2.6 qPCR檢驗Hub基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式

采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法在葉片和根中分別隨機(jī)抽選15條Hub基因進(jìn)行表達(dá)模式驗證。結(jié)果顯示，葉片中有11條Hub基因在兩種檢測方法間的R2值(回歸方程決定系數(shù))大于0.9；有1條Hub基因在兩種檢測方法間的R2值在0.8～0.9之間；有2條Hub基因在兩種檢測方法間的R2值在0.7～0.8之間，僅有1條Hub基因在兩種檢測方法間的R2值小于0.7(圖19a)。根中Hub基因的qRT-PCR定量結(jié)果與葉片相似，有9條Hub基因在兩種檢測方法間的R2值大于0.9；又3條Hub基因在兩種檢測方法間的R2值在0.8～0.9之間；有1條Hub基因在兩種檢測方法間的R2值在0.7～0.8之間，僅有2條Hub基因在兩種檢測方法間的R2值小于0.7(圖19b)。

(a)葉片；(b)根；x軸為qRT-PCR結(jié)果，y軸為RNA-SEQ結(jié)果圖19 Hub基因qRT-PCR和高通量測序數(shù)據(jù)比對Fig.19 Comparison betweenqRT-PCR and sequencing of Hub genes

總的來看，高通量測序檢測的Hub基因的表達(dá)與和qPCR驗證結(jié)果在趨勢上高度一致，說明我們的測序結(jié)果高度可信。個別Hub基因在兩種檢測方法間存在一定差異(R2值較低)可能是由于檢測原理間存在差異或目的基因具有特殊結(jié)構(gòu)(如莖環(huán))等因素造成的。

3 結(jié)論

(1)RNA-seq在甜菜中共鑒定出了11,992條鹽脅迫應(yīng)答基因，其中葉片和根中分別包含7391條和8729條。樣本間DEG比對分析，鑒定出244條core應(yīng)答基因，我們認(rèn)為這些基因通過調(diào)控甜菜的蔗糖-淀粉代謝、調(diào)節(jié)植物激素信號通路、激活苯丙素和黃酮醇代謝通路來響應(yīng)鹽脅迫進(jìn)而構(gòu)成了甜菜對鹽脅迫的基礎(chǔ)應(yīng)答。

(2)通過對Hub基因的表達(dá)模式進(jìn)行分驗證表明及功能分析顯示這些Hub基因具有重要的生物學(xué)意義，有助于解析甜菜對鹽脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理。

(3)本研究利用core基因、Hub基因和重要鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)DEG構(gòu)建了甜菜轉(zhuǎn)錄水平鹽脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，通過對該網(wǎng)絡(luò)中DEG的功能分析，從轉(zhuǎn)錄層面論述了甜菜對鹽脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理?？傊?，本研究首次為甜菜構(gòu)建了一個較為全面的轉(zhuǎn)錄水平鹽脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)。